专利名称：一种f蛋白检测试剂及检测方法
技术领域：
本发明专利属于生物医学工程和医学检验技术领域，尤其是指一种F蛋白检测试剂及检测方法。
背景技术：
在生物医学工程关于细胞的科研领 域及医学临床应用中，F蛋白是一种特异存在于肝细胞中的蛋白质，只有当肝实质受损方释放入血液中，因此现代医学认为F蛋白是一种特异的肝细胞损害标志物。肝病的诊断一直是医学诊断学中一个重要的组成部分，肝脏F蛋白作为一种可直接反映肝损伤程度的血清学标志，其血清含量与各种原因造成的肝损伤程度成正相关。无论何种原因导致的肝�。硐治蜗赴鸷Γ逯蠪抗原均可升高。血清F抗原的含量变化与肝组织学改变有密切的相关性。血清F抗原为肝脏特有，敏感性非常高，正常人血清F抗原浓度无年龄、性别差异，肝细胞受损时血液中出现的时间早，而且是不可诱导的，因此，血清F抗原是一种新的比常规肝功能项目更灵敏而特异的指标。如果制成F蛋白的免疫试剂，其将在肝病早期诊断与治疗、药物的筛选与疗效观察、肝病预后的判断等方面发挥重要作用。目前国内外获得F蛋白比较困难且缺乏统一的标准，难以相互验证，不利于研究工作的深入；国内外有学者通过提纯的方法提取F蛋白，利用这种方法很难得到大量且较纯的F蛋白；迄今为止用基因克隆的方法获得F蛋白的基因序列只有在大鼠中获得F蛋白克隆的报道，未见人肝脏F蛋白的克隆和表达的文献报道，同时Genebank上亦没有相应的序列发布。在查阅大量国内外相关文献基础上，我们参照与人类同源性较高的大鼠肝脏F蛋白的基因序列先后设计了 10对不同的上下游引物，成功扩增出人肝脏F蛋白基因序列。我们将人类肝脏F蛋白的基因序列在NCBI的GENEBANK上发布(序列号DQ188836)，并对此序列进行了 Blast比对，结果显示，人类肝脏F蛋白的基因序列与大鼠肝脏F蛋白的基因序列的同源性高达99%。进而利用已获得的F蛋白的cDNA在原核载体(大肠杆菌BL21 (DE3)PLysS)表达出F蛋白，使F蛋白的大量制备成为可能，解决其来源问题；通过改进提纯的方法一方面得到人肝脏F蛋白的提纯品，另一方面将提纯的F蛋白与克隆表达的F蛋白通过免疫特性相互验证；同时制备其多克隆抗体和单克隆抗体，并通过多克隆抗体检测部分临床标本，来初步验证F蛋白作为一种临床诊断试剂的可打性，为使F蛋白的研究尽快地从实验室走向临床奠定更坚实的基础。在众多的免疫测定技术中，酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)应用最为广泛，最具代表性。ELISA是60年代末，在酶免疫组织化学的基础上由Engvall和Perlmann以及Van Weeman和Schuurs等发展的一种酶标固相免疫测定技术。这种简单方便的免疫测定技术出现后，不但成为了一种非常简便的研究工具，而且迅速地应用于各种生物活性物质及标志物的临床检测，并在临床应用中逐渐取代了有环境污染、废液难以处理等缺点的放射免疫试验。免疫测定的基础在于抗原抗体之间的特异结合反应，而ELISA顾名思义就是以酶作为标记物、以抗原抗体免疫反应为基础的固相吸附测定方法。ELISA的测定试剂的有机组成部分包括三个方面，即固相支持物及包被的抗原或抗体、酶标记的抗体或抗原和酶反应底物等。抗原或抗体的固相化并不影响其免疫结合活性，酶标记的抗原或抗体亦是如此，并且标记酶的活性不因标记过程而丧失。整个测定中，抗原抗体结合反应在固相支持物上进行，反应结果的判断以酶与其底物作用后的显色或产生的荧光或发光反应为准则，显色或产生荧光的强度与临床标本中待测物的浓度成正比或反比关系。以前用于免疫测定的抗原通常为各种纯化抗原，近年来随着分子生物学技术的发展，使用基因工程方法制备各种特殊的抗原或抗体及其酶结合物等免疫测定试剂已成为现实，各种新型实用的测定方法不断出现，进一步拓宽了免疫测定技术的发展途径。现在基因工程抗原在ELISA方法中的应用得到了极大的拓展，有逐渐取代人工提纯抗原的趋势。最早是在HIV抗体免疫测定中所使用的抗原为用去垢剂裂解HIV感染的细胞后所提取的病毒抗原，这样得到的抗原纯度相对较差，因此影响测定的特异性和敏感性。现在国内外用于HIV抗体检测的ELISA试剂盒均使用基因工程抗原如gp41，gp 120及gp 160等，大大提高了测定的特异性和敏感性。HCV目前尚不能体外培养，只能用基因工程或化学合成的方法获得HCV结构区和非结构区的各种抗原片段。已知HCV基因组由7个功能区组 成；核心、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4和NS5区。最近，美国Chiron公司Chien等研制了一种包括HCV基因组7个功能区所有免疫决定基的单一融合蛋白，称为多表位融合抗原_6。使用该融合蛋白建立的化学发光免疫测定方法，其测定敏感性较使用由NS3-NS4核心(C25)区组成的融合蛋白所建立的酶免疫测定方法要高2-4倍。此外，近年来不少研究者采用基因工程技术重组表达了梅毒螺旋体的具有高度免疫原性的膜脂蛋白TpN17、TpN44. 5 (TmpA)和TpN47等，用其建立梅毒抗体检测的ELISA方法，表现了很好的测定特异性和敏感性，将成为取你快速血浆反应素环状片试验(Rapidplasma reagin circle card test, RPR)和螺旋体血球凝集试验(Treponemal pallidumhemagglutination assay, TPHA)的梅毒抗体理想的检测方法。由上述可见，基因工程抗原对建立高灵敏高特异的免疫测定方法具有不可替代的作用，已成为难以培养的病原体抗原的最佳来源，亦解决了病原体裂解提取抗原纯度差的问题。综观未来，基因工程抗原在免疫测定中的应用，有其独特的魅力和广阔的应用前景。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种既方便、快捷，又安全、经济的检测各种肝病及肝细胞损伤的F蛋白检测试剂及检测方法，填补国内在这一检测领域的空白。本发明的目的是通过以下技术方案实现的一种F蛋白检测试剂，包括F蛋白的兔抗人多克隆抗体、酶标抗体、显色试剂和终止液。而且，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标抗体。而且，所述显色试剂为含O. 01% H2O2的水溶液和pH 7. 4，含O. 4mg/ml TMB (3, 3,5，5-四甲基连苯胺)的O. lmol/L枸椽酸缓冲液。而且，所述终止液味2M的硫酸水溶液。
而且，还包括缓冲液和洗涤液。而且，所述包括缓冲液为PBS O. 01M, pH 7. 4 ;所述洗涤液为PBST，配置方法为10XTBS pH 7.6 :Tris_ 碱，60. 57g ；1M HCl, 420ml ;NaCl，85_90g，用 HCl 调 pH 至 7· 6 后，定容于IL ；1XTBST :将10XTBS稀释10倍，同时加入O. I %的TWEEN-20。利用F蛋白检测试剂检测F蛋白含量的方法，其特征在于步骤如下(I)包被使用纯化的F蛋白多克隆抗体按10 μ g/ml蛋白量进行包被，100 μ I/孔，4°C过夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗涤三次，含I %胎牛血清的PBS封闭，110 μ I/孔，37°C I小时，弃包被液待用；(2)取包被有F蛋白多克隆抗体的96孔板，加入待测血清50 μ I/孔，然后酶标抗、体50 μ I/孔，用封板膜封住反应孔，37°C恒温箱温育60min ；(3)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满PBST，静置lmin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3-8次；(4)每孔加入 O. 01% H2O2 的水溶液和 pH 7. 4 含 O. 4mg/ml TMB 的 O. lmol/L 枸椽酸缓冲液各50ul，37°C避光孵育15min ；(5)每孔加入终止液50 μ I,于15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。一种F蛋白检测试剂用于酶免仪检测F蛋白的用途。一种用于免疫比浊法专用F蛋白检测试剂盒，其特征在于试剂组成如下试剂Rl :含小鼠抗人F蛋白单克隆抗体的抗血清，试剂R2 :增浊剂，防腐剂，表面活性剂，Tris缓冲液；定值血清R3 :含定量纯化的基因工程重组F蛋白；所述试剂Rl为小鼠抗人F蛋白单克隆抗体，抗血清浓度为10 μ g/ml ；所述试剂R2中的增浊剂采用4% g/ml的聚乙二醇-6000，所述防腐剂为山梨酸钾；所述表面活性剂为1% SDS v/v, Tris缓冲液pH = 8. 2,浓度为20mmol/L。所述试剂R3为F蛋白冻干品，每份定值F蛋白含量为1000 μ g，使用时溶于IOmlTris缓冲液中，配制成浓度为100 μ g/mL的定值血清。本发明的优点和有益效果为I、本发明根据F蛋白是一种能反映肝细胞损伤程度的灵敏和特异的指标，采用生化分离提纯的方法得到人类肝脏的F蛋白的提纯品及其抗体、采用RT-PCR的方法获得人类肝脏F抗原的cDNA序列克隆，并进行原核表达F蛋白的基础上，研究开发F蛋白的ELSIA检测试剂，为快速准确检测各种肝病所致肝损伤建立一种全新的试剂和方法。2、本发明经过对F蛋白检测试剂的各项方法学指标如线性实验、灵敏度、重复性、交叉干扰最适反应时间、稳定性实验等的实验探索，结果表明，F蛋白试剂检测灵敏度达到O. 5 μ g/孔、批内重复性CV值在5. 5%、批间CV值在范围在10%左右、用本法在检测F蛋白过程中与HbsAg阳性对照、HbeAg阳性对照、HAV抗原、HCV抗原、HDV抗原、HEV抗原、HSVI型抗原、HSVII型抗原、大肠杆菌等无交叉反应、F蛋白检测最适反应时间确定为I小时、组成检测试剂盒的各组成部分放于4°C保存经过6个月P/N比值下降15%左右；阳性标本稀释100倍其P/N比值仍在线性范围内。3、本发明根据F蛋白在肝脏组织受到损伤后从肝细胞大量释放到循环中，可诱导机体产生特异性的细胞和体液免疫应答，采用基因工程制备并经Ni2+柱层析高度纯化后的HIS-F蛋白提高了诊断的精确度和诊断效率，节约了检测成本，使其在临床应用方面具有重大的理论意义和潜在的应用价值。
图I为本发明克隆载体pUCm-T示意图；图2-1为本发明表达载体pET_15b示意图，图2_2附表达载体关键位点定位信息；图3为本发明Western blot法结果；图4用于F蛋白浓度测定的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。在查阅大量国内外相关文献基础上，参照与人类同源性较高的大鼠肝脏F蛋白的基因序列先后设计了 10对不同的上下游引物，成功扩增出人肝脏F蛋白基因序列，将人类肝脏F蛋白的基因序列在NCBI的GENEBANK上发布(序列号DQ188836)，并对此序列进行了Blast比对，结果显示，人类肝脏F蛋白的基因序列与大鼠肝脏F蛋白的基因序列的同源性高达99%。进而利用已获得的F蛋白的cDNA在原核载体(大肠杆菌BL21(DE3)pLysS)表达出F蛋白，使F蛋白的大量制备成为可能，解决其来源问题；通过改进提纯的方法一方面得到人肝脏F蛋白的提纯品，另一方面将提纯的F蛋白与克隆表达的F蛋白通过免疫特性相互验证；同时制备其多克隆抗体和单克隆抗体,并通过多克隆抗体检测部分临床标本,来初步验证F蛋白作为一种临床检测试剂的可打性，为使F蛋白的研究尽快地从实验室走向临床奠定更坚实的基础。一、F蛋白检测试剂的制备方法如下I、F蛋白的制备及纯化提取车祸死亡的正常人的新鲜肝脏组织的总RNA，采用RT-PCR的方法获得目的基因，进行琼脂糖电泳检测目的基因。以pUCm-T为克隆质粒；pET-15b为表达载体；大肠杆菌BL21(DE3)pLysS为最终表达菌株。经IPTG诱导表达目的蛋白，应用Ni2+-charged NTA His-binding column纯化F蛋白，然后采用SDS-PAGE检测目的蛋白的纯度，并利用Western-blot进行特异性鉴定。其中，人肝脏F蛋白的提取和纯化方法如下取车祸死亡的正常人肝脏，经低温匀浆、饱和硫酸氨沉淀粗提后再经DEAE-Cellulose 52、Sephacryl S-200 和 CM-Cellulose-23 柱层析，最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。人肝脏组织经匀浆、离心和硫酸氨沉淀后获得粗制F蛋白，再经DEAE-Cellulose 52、Sephacryl S-200 和 CM-Cellulose-23 柱层析后获得的纯度较高的 F蛋白，经层析后的F蛋白进行聚丙稀酰胺凝胶电泳。在人肝脏F蛋白提纯的过程中，每一步均经用BALB/c小鼠肝匀浆免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清鉴定所提F蛋白的特异性，其纯度鉴定采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。采用IPTG诱导表达人肝脏 F 蛋白，用 Ni2+-charged NTA His-binding column 进行纯化。2、抗F蛋白多克隆抗体的制备
用生理盐水将纯化的F蛋白稀释为100 μ g/ml浓度，取溶液Iml与Iml福氏完全佐剂充分混匀，用福氏完全佐剂充分混匀，取2ml混匀液免疫新西兰纯种大白兔。首次免疫，每只兔注射2ml的乳化抗原，于背部两侧、耳后等处皮下多点注射。2周后以同样的剂量加强免疫，背部多点注射。10天后再次加强免疫。10天后进行第3次加强免疫。末次免疫后，抗体效价达到要求即从颈静脉取血，获取大量的抗血清。依次采用饱和硫酸胺盐析法、离子交换柱层析法和DEAE-Sephadex_A50柱层析法对多克隆抗体进行纯化。3、单克隆抗体制备采用基因工程获得的F蛋白作为抗原免疫BALB-C小鼠后，用ELISA法测定血清中抗体滴度，选取抗体滴度I : 72000的BALB-C小鼠制备脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，细胞融合后培养上清有15孔抗体阳性，抗体滴度最高为I : 25600。Western-blotting试验显示制备的单克隆抗体与基因工程表达的人肝脏F蛋白发生特异性反应，表明制备的抗体具有免疫活性。4、用纯化人F蛋白及辣根过氧化物酶标记的多克隆、单克隆抗体，采用双夹心法制备ELISA试剂。 F蛋白检测ELISA试剂(双抗体夹心法)制备及操作步骤如下(I)包被使用纯化的F蛋白多克隆抗体按10 μ g/ml蛋白量进行包被，100 μ I/孔，4°C过夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗涤三次，I %牛血清白蛋白PBS封闭，110 μ I/孔，37°C I小时，弃包被液待用；(2)同时加入标本和酶结合物临床标本按50 μ I/孔加入，同时设阴阳对照各二孔及空白对照一孔，并同时加入最适工作浓度的酶标记抗体50 μ I/孔，37°C孵育I小时，PBST (含吐温的Tris硼酸盐缓冲液)洗五次；(3)显色加入TMB底物A、B液各50 μ 1，37°C孵育15分钟；(4)加入2M硫酸50 μ I终止反应；(5) 450nm 波长测 OD 值；(6)结果判定P/N彡2. I为阳性。二、F蛋白检测试剂的组成如下(I)F蛋白的兔抗人多克隆抗体(10 μ g/ml，100 μ I/孔)；(2) 10% (v/v)胎牛血清；(3)自制辣根过氧化物酶标抗体；制备方法如下i.取4mgHRP(辣根过氧化物酶)溶于O. 4ml去离子水中，加过碘酸钠O. 4ml，4°C 30min，轻轻混匀。ii.加乙二醇液 0.4ml 4°C 30min,轻轻混勻。iii.加纯化抗体4. 8mg/0. 4ml,室温下2h轻轻混勻。iv.将样品加入透析袋，对O. 05M pH9. 5碳酸盐缓冲液透析，中间换液4次，透析18h以上。V.加入等量饱和硫酸铵，4°C静置30min后IOOOrpm离心IOmin,沉淀用O. OlMPBS pH7. 4溶解至I. 6ml,加饱和硫酸铵O. 8ml 4°C静置30min, IOOOrpm离心IOmin,沉淀用I-2ml PBS 溶解。vi.溶解后的沉淀装入透析袋,对O. OlM PBS pH7. 4透析,直至用I %的氯化钡检测不出硫酸根离子为止。vii.柱层析在2. 5*30cm柱上采用Sephadex G200为介质,方法同离子交换层析，流速为lml/min,每管收集约3ml。(4) PBS (O. 01M, pH 7. 4)；(5) PBST (Tris 2. 42g, NaCl 29. 24g，Tween-202· 5ml 加水定容至 1000ml，调 pH 至7. 5)；(6)底物 A 液(含 0.01% H2O2 的水溶液)和底物 B 液(pH 7. 4，含 O. 4mg/ml TMB (3，3，5，5-四甲基连苯胺)的O. lmol/L枸椽酸缓冲液)；(7)阳性对照；(8)阴性对照； (9)终止液(2M硫酸)。三、F蛋白检测试剂的制作方法如下I、利用纯化的F蛋白多克隆抗体(10 μ g/ml)包被96孔板，每孔100 μ 1，4°C过夜，
O.01M,pH 7. 4的PBS洗涤三次，用含1%牛血清白蛋白PBS 110 μ I封闭各孔，37°C保温lh，弃包被液待用；2、采用改良过碘酸钠标记法制备辣根过氧化物酶标记的抗F蛋白抗体；改良方法取4mg过氧化物酶(HRP)溶于O. 4ml水中，加过碘酸钠O. 4ml,4°C 30min，轻轻混匀。
3、配制洗涤液PBST :10 X TBS (pH 7.6) :Tris_ 碱，60. 57g ; IM HCl，420ml ;NaCl，85_90g，用 HCl 调 pH至
7.6后，定容于IL0IXTBSTjf 10 X TBS 稀释 10 倍，同时加入 O. 1% (v/v)的 TWEEN-20 即可。4、配制显色底物A 液(含 O. 01 % H2O2) ;B 液(含 O. 4mg/ml TMB 的 O. lmol/L 枸椽酸缓冲液)；5、反应终止液硫酸溶液(2M)。四、F蛋白试剂的检测方法简介如下(I)取包被有F蛋白多克隆抗体的96孔板，加入待测血清50μ I/孔，同时设阴、阳对照各二孔，然后酶标抗体50 μ I/孔，用封板膜封住反应孔，37°C恒温箱温育60min ；(2)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满I XPBST，静置lmin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；(3)每孔加入TMB底物A液和B液各50 μ 1，37°C避光孵育15min ；(4)每孔加入终止液50 μ I,于15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。辣根过氧化物酶催化过氧化物的氧化反应，最具代表性的过氧化物为H2O2, TMB为供氧体，H2O2为受氢体，反应式为TMD+H202 —蓝色可溶性产物+H2O,各类酸性终止液(如硫酸溶液)则会使蓝色转变成黄色，此时可用特定的波长(450nm)测读吸光值。五、由此还可以扩展为专用检测试剂I、用于酶免仪专用酶免方法F蛋白检测试剂，详见前述。2、用于免疫比浊法专用F蛋白检测试剂盒。2. I试剂组成试剂Rl (含小鼠抗人F蛋白单克隆抗体的抗血清)，试剂R2 (增浊齐U，防腐剂，表面活性剂，TriS缓冲液)；定值血清R3(含定量纯化的基因工程重组F蛋白)试剂Rl中小鼠抗人F蛋白单克隆抗体来源于上述步骤(六)，抗血清浓度为10 μ g/ml。试剂R2中的增浊剂采用4% (w/v)的聚乙二醇-6000 (PEG-6000)，防腐剂为山梨酸钾，表面活性剂为1% SDS (v/v)，Tris缓冲液(pH = 8. 2)浓度为20mmol/L。试剂R3为F蛋白冻干品(每份定值F蛋白含量为1000 μ g，使用时溶于IOmlTris缓冲液中，配制成浓度为100 μ g/mL的定值血清)2. 2试剂盒操作说明2. 2. I按含F蛋白单克隆抗体的抗血清100 μ 1，加相应的试剂R20. 9ml的比例混 合成单一试剂(F蛋白单抗抗体液)。最好临用前配制当天用量。2. 2. 2各试剂用量如下表
权利要求
1.一种F蛋白检测试剂，其特征在于包括F蛋白的兔抗人多克隆抗体、酶标抗体、显色试剂和终止液。
2.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标抗体。
3.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述显色试剂为含O.Ol 1^H2O2的水溶液和PH 7. 4含O. 4mg/ml TMB的O. Imo 1/L枸椽酸缓冲液。
4.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述终止液为2M的硫酸水溶液。
5.根据权利要求I所述的F蛋白检测试剂，其特征在于还包括缓冲液和洗涤液。
6.根据权利要求5所述的F蛋白检测试剂，其特征在于所述包括缓冲液为PBSO. 01M, pH 7. 4;所述洗涤液为 PBST，配置方法为10XTBSpH 7. 6 :Tris_ 碱，60. 57g ;IMHCl，420ml ;NaCl, 85_90g,用 HCl 调 pH 至 7· 6 后，定容于 IL ；1 XTBST :将 10XTBS 稀释 10倍，加入 O. 1% (v/v)的 TWEEN-20。
7.利用权利要求1-6之一所述的F蛋白检测试剂检测F蛋白含量的方法，其特征在于步骤如下 (1)包被使用纯化的F蛋白多克隆抗体按10μ g/ml蛋白量进行包被，100 μ I/孔，4°C过夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗涤三次，含I %胎牛血清的PBS封闭，110 μ I/孔，37°C I小时，弃包被液待用； (2)取包被有F蛋白多克隆抗体的96孔板，加入待测血清50μ I/孔，然后酶标抗体50 μ I/孔，用封板膜封住反应孔，37°C恒温箱温育60min ； (3)弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满PBST，静置lmin，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板3-8次； (4)每孔加入TMB底物O.01% H2O2的水溶液和pH 7. 4含O. 4mg/ml TMB的O. lmol/L枸椽酸缓冲液各50 μ 1，37°C避光孵育15min ； (5)每孔加入终止液50μ I,于15min内在450nm波长处测定各孔的OD值。
8.—种如权利要求I所述的F蛋白检测试剂用于酶免仪检测F蛋白的用途。
9.一种用于免疫比浊法专用F蛋白检测试剂盒，其特征在于试剂组成如下 试剂Rl :含小鼠抗人F蛋白单克隆抗体的抗血清， 试剂R2 :增浊剂，防腐剂，表面活性剂，Tris缓冲液； 定值血清R3 :含定量纯化的基因工程重组F蛋白； 所述试剂Rl为小鼠抗人F蛋白单克隆抗体，抗血清浓度为10 μ g/ml ； 所述试剂R2中的增浊剂采用4% g/ml的聚乙二醇-6000， 所述防腐剂为山梨酸钾； 所述表面活性剂为1% SDS v/v, Tris缓冲液pH = 8. 2，浓度为20mmol/L。
所述试剂R3为F蛋白冻干品，每份定值F蛋白含量为1000 μ g，使用时溶于IOmlTris缓冲液中，配制成浓度为100μ g/mL的定值血清。
全文摘要
本发明涉及一种F蛋白检测试剂，包括F蛋白的兔抗人多克隆抗体、酶标抗体、显色试剂和终止液，所述酶标抗体为辣根过氧化物酶标抗体，所述显色试剂为A液(含0.01％H2O2)和B液(pH 7.4，含0.4mg/ml TMB(3，3，5，5-四甲基连苯胺)的0.1mol/L枸椽酸缓冲液)；所述终止液为2M的硫酸水溶液。本发明根据F蛋白在肝脏组织受到损伤后从肝细胞大量释放到血液循环中，可诱导机体产生特异性的细胞和体液免疫应答，采用基因工程制备并经Ni2+柱层析高度纯化后的HIS-F蛋白提高了诊断的精确度和诊断效率，节约了检测成本，使其在临床应用方面具有重大的理论意义和潜在的应用价值。
文档编号G01N33/68GK102721814SQ20111036427
公开日2012年10月10日 申请日期2011年11月16日 优先权日2011年11月16日
发明者任峰, 刘树业 申请人:天津美德太平洋科技有限公司
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