专利名称：：将加热和化学固定组合而稳定生物样品的方法
技术领域：
：本发明涉及一类用于分析的生物样品的稳定方法。更具体地说，本发明涉及将生物样品的加热处理和化学固定组合以保持蛋白质一级结构(primarystructure)和翻译后修饰如蛋白质磷酸化的方法。
背景技术：
：任何生物样品分析的关键是，在样品从活体取出的时刻和进行分析的时刻之间保存其组分的完整性。然而，样品降解既难以阻止，又难以发觉。结果是，许多分析不能发觉分析进行之前早已降解的物质的存在；与之相应，这样的分析可能实际上识别的是关键组分的降解产物，而不是原始组分。生物体中蛋白质的装配是了解生理学、机能和疾病的关键。许多不同的细胞区室中，例如细胞核中、细胞器中、原生质中和膜中，以及细胞间间隙和体液如血液中都发现有蛋白质。尽管蛋白质普遍存在，但它们对所处环境极度敏感，因而不总能很容易地被检出并被识别，因为他们会很快降解。生物体在活体状态时其蛋白质装配的天然功能由多种生化途径的复杂但精细的平衡来维持。一旦生物体死亡，或者一旦组织样品从活体中取出，生物体中或样品中的调节性平衡即行消失，且关键的蛋白质开始降解。降解本身能以许多不同的方式表现出来。例如，一些天然起消化其他蛋白质的作用(“蛋白裂解"功能)的蛋白质，以及一些在生物体活着时正�：亢突钚允艿降鹘诘牡鞍字剩篮罂墒Э�。因此，许多蛋白质和重要的多肽如共活化剂、激素以及辅阻遏物，被样品中天然存在的溶蛋白性蛋白质实际消化而消亡。消化通常涉及在多肽主链的一个或多个点上破坏，从而产生蛋白质或肽的片段。还有一些其他的蛋白质可被其他方式如水解而致天然离解，它们在活体中的含量因被不断合成而保持不变，死后他们迅即消失。例如，蛋白酶的死亡后活性和氧化应激已被证明对脑中的肽和蛋白质浓度起重要作用，且对检出翻译后修饰也然(Sk0ld等所著，“ANeuroproteomoicApproachtoTargetingNeuropeptidesintheBrain“,Proteomics,2,447—454,2002；Svensson等所著，“Peptidomics-BasedDiscoveryofNovelNeuropeptides“,ProteomeRes.，2，213-219，2003)，这两篇论文在此一并资作参考。然而，为了识别蛋白质来确定样品中存在什么蛋白质，能确定它们各自的一级结构，也即序列即足矣。蛋白质和多肽已被广泛研究，所用方法例如二维凝胶法和质谱分析法，但是此类技术依赖于是否有获取样品的手段，使得天然蛋白质降解过程尚未进展到将关键蛋白的浓度降低到各种测量极限值以下。多种蛋白质经历天然的翻译后修饰作为其功能和活性调节和修饰的一部分。蛋白质的翻译后磷酸化和去磷酸化是调节细胞中过程和信号传递的重要生物过程。因此，鉴别和测定蛋白质磷酸化的水平对了解蛋白质功能和细胞中过程极为重要。为了研究蛋白质和肽，组织或细胞样品通常通过在某些特定缓冲条件下的勻浆来破碎。这些缓冲液往往含有被认为能引起蛋白质所有活性终止的成分，包括降解其他蛋白质的蛋白质(蛋白酶)。然而，对病人或模型生物体的组织样品进行的研究，通常在勻浆和蛋白酶灭活发生以前使样品经历一段时期的氧和营养耗竭。因此，在该领域中已对研发一些试图在提取之后和在分析之前保存生物样品的方法。这些方法的例子包括组织固定法，该方法通常涉及将样品浸于醛溶液中，并用微波照射样品(例如参阅，Theodorsson等所著，“MicrowaveIrradiationIncreasesRecoveryofNeuropeptidesfromBrainTissues“,Peptides,11:1191-1197,1990)。使用醛溶液有问题，因为它慢慢穿透组织，"O.52tnm/h，允许大分子在完全固定前降解，因而不阻止蛋白质自然降解(Fox等人所著，”Formaldehydefixation”J.Histochem.Cytochem.33:845-853,1985)。微波照射也有问题，因为它通常不均勻，那就是说，样品的某些部分到达足以引起样品分解的高温。此外，样品的一些部分还能达到高于100°C的温度，喷出蒸汽而产生小孔。(例如参见，Fricker等所著，"QuantitativeNeuropeptidomicsofMicrowave-irradiatedMouseBrainandPituitary“,Molecular&CellularProteomics,4:1391-1405，2005)。此外，微波照射此前作为处死方法的一部分被用于活体(非人类)受试者，因而还有待被确认为来自人和非人受试者的样品的分析工具。WO2007/024185记述了一种制备分析用生物样品的方法，该方法包括在样品取出后快速而均勻加热样品，以终止样品的酶促降解。W02007/0M185没有论及组织学分析中对样品进行化学固定的需要。对于组织学分析来说，重要的是在对生物样品进行切片之前使所述样品固定，以获得能保持代表了来自该样品和切片之组织的自然结构的结构的切片。Shiurba等人(“Immunocytochemistryofformalin-fixedhumanbraintissues:microwaveirradiationoffree-floatingsections“，BrainResearchProtocols2:109-119,1998)记述了制备组织学分析用生物样品的方法，该方法结合福尔马林固定和后续的微波加热。该方法没有论述样品取样后快速降解的有关问题。蛋白质磷酸化的研究，例如通过利用磷酸化状态特异性抗体进行的研究，提供了研究性和诊断性病理学的重要工具。然而，这一技术应用于例如免疫组化研究的全部裨益，受到样品彻底稳定前样品中磷酸化快速损失的限制(Mandell所著，丨丨Phosphorylationstate-specificantibodies.Applicationsininvestigativeanddiagnosticpathology丨丨，Am.J.Pathol.163:1687-1698，2003)。因此，需要有可靠的方法在分析前保存组织样品的含量和结构，阻止样品自然降解和提供可靠且可重复的结果。此处进行的发明
背景技术：
讨论包括对本发明来龙去脉的阐明。这不得视作许可任何涉及到的材料是公开的、已知的或者权利要求中任何一项的优先权日当日的通用常识的一部分。在整个说明书的说明部分和权利要求部分中，措词包括(comprise)及其变体例如“包括(comprising)”和“包括(comprises)”不是旨在排除其他的添加剂、组分、整数或步骤。
发明内容本发明是基于理解到，常规用于在分析前固定生物样品的福尔马林，以慢速(-0.52mru/h)穿透组织时，允许大分子在完全固定前降解。特别是，完全固定前，磷酸化状态中蛋白质的广泛变化可用本领域标准方法证实。本发明人将热处理和化学固定组合而解决了这个问题，提供了一种有效而可靠的生物样品稳定方法。相应地，本发明提供使用于分析的生物样品稳定的方法。该方法包括a)将样品加热到高于70°C的温度，阻止酶过程；以及b)随后对样品进行化学固定。该方法优选用于稳定组织学分析用的生物样品，最优选用于组织化学分析和/或免疫组化分析用的生物样品。优选将所述样品加热到高于80°C的温度，例如高于90°C的温度，最优选加热到高于95°C的温度，例如加热到100°C的温度。优选所述化学固定用交联剂来进行。该交联剂优选是醛，最优选甲醛或者戊二醛。在一实施方式中，所述生物样品包含至少一种具有翻译后修饰的蛋白。在另一种实施方式中，先使一定体积的样品适应成某种允许均勻而快速加热的形状，然后加热，由此形成有形状的样品。在一种实施方式中，使生物样品形成能在加热均勻和迅速方面促进有效加热的形状。这有助于缩短中断酶促过程所需的时间。通过中断一些由蛋白质驱动的酶促过程，避免了样品中其他组分降解。因为获取生物样品和进行生物分析之间的时间对降解程度影响很大，甚至在短暂的时间之后，例如，在短如13分钟那样的时间之后也是如此，所以取样后立即进行加热是很重要的。通过加热样品，起着酶作用的蛋白质失去其二级结构和三级结构，从而失去其活性，使样品降解最小化。本发明方法保存了蛋白质和肽的一级结构和翻译后修饰，但是同时破坏了其原始二级结构、三级结构以及可能有的四级结构。因此，加热样品有多个优点，其中包括使例如较低丰度的神经肽和较常见的、会以别的方式降解的蛋白质翻译后修饰能保持完整无损。另外，该方法还使神经肽和蛋白质的降解以可重现的方式减少到最低限度。该方法也使得有可能比较源于不同样品的蛋白质和肽的含量和水准。本发明还提供经本发明方法稳定的生物样品。图1显示，经福尔马林固定的小鼠皮层(cortex)组织中磷酸化CREB即pCREB(Serl33)的免疫组化观察结果，所述组织在尸检后浸入福尔马林之前于室温保温0120分钟，小图A:0分钟，小图B15分钟，小图C:120钟。小图D显示用本发明方法处理过的样品，即取样后马上加热，继之以福尔马林固定。图2显示，经福尔马林固定的小鼠小脑组织样品中磷酸化CREB即pCREB(krl33)的免疫组化观察结果，所述组织按本发明方法在室温以延长的时间保温，再稳定。小图A稳定后0分钟，小图B稳定后15分钟，小图C稳定后6小时，小图D稳定后M小时。具体实施例方式概述本发明涉及一类稳定用于分析的生物样品的方法。已从生物体中取出的样品包含各种大分子如多肽或蛋白质。为使分析样品稳定化，要把各种大分子的一级结构和翻译后修饰的取样后降解尽最大可能抑制住。因此，在一种实施方式中，在降解最小的第一时间段之后，或者优选保持在类似于活体内样品中的水准上，或者保持在该水准左右，样品在第二时间段内迅速而均勻地加热，并以此方式使样品的所有部分达到特定的最低温度。此温度称为变性温度，因为它是各种大分子在此温度下改变性质的温度，也即其二级结构、三级结构和/或四级结构破坏的温度，但它不是大分子一级结构降解的温度。变性温度优选是高于80°C的温度，例如高于900C的温度，最优选是高于95°C的温度，例如100°C的温度。优选的是，样品不得高于100°C的温度。这些改变性质的大分子优选至少包括那些在样品自然降解过程中起作用的大分子。例如这样的大分子包括那些若未变性则例如会以消化方式使样品中其他分子降解的蛋白水解酶。这样的大分子还包括磷酸酶、酯酶、酰基转移酶、脂酶、水解酶、核酸酶如核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶，以及激酶。须予理解的是，本文所用的这些条件导致了度的影响，而非绝对的影响当然要理解的是，没有化学反应可予完全停止。因而须予理解的是，例如，虽然所用的温度选择得足够高，以便引起变性作用和酶活性损失，但却低得足以不引起一组给定分子的一级结构降解，这并不意味着，在那些条件下少量大分子仍未进行降解。这种大分子的数目是无关紧要的，而且例如小于5%的起始分子数目，优选小于2%,甚而更优选小于1%，更其优选为小于0.的这种大分子就足以实现本发明的目的。还须理解的是，当这里使用术语二级结构时，可意指大分子的负责活性和特异性的总体三维形态。因而，本说明书中术语二级结构可意指大分子的通常被分别称为二级结构、三级结构和四级结构的特点。在另一种实施方式中，样品不准备取出后立刻就分析，而是改为打算在分析前存储起来。在这样一种实施方式中，样品取出后实际上尽可能快地冷冻起来。样品取出和样品达到冷冻温度之间的时间是使降解最小化的时间。使样品采取某种可快速和均勻加热的外形。也可在冷冻的同时或冷冻之前使样品采取这样的外形。然后，在第二时间段内将样品迅速而均勻地加热，这样使样品的所有部分都达到变性温度。须予理解的是，冷冻样品的第二时间段不必与加热前未冷冻的样品的第二时间段相同。优选的是，第二时间段很短暂，以使样品在其冻结状态和加热状态之间不处于解冻时段。举例来说，短暂加热优选发生在小于1分钟内，小于30秒，小于20秒，小于10秒，小于5秒，或者小于2秒。本发明涉及应用于生物样品中多肽、蛋白质(包括抗体)、碳水化合物、脂质、激素和代谢物的分析。然而，人们会理解到，其他分子和大分子的研究也可得益于本文中所记述的方法和装置。举例来说，而且具体说来，生物样品中任何其它的大分子，如果具有可能因加热而受到破坏的三维构象、但保存其内部化学键顺序时，可用本文所述方法和装置来保存，以备分析。这样的其他大分子包括，但不局限于，核酸和寡核苷酸。通常，大分子被理解为由相同特性或不同特性的重复单位组成的高分子量分子。同样，本发明方法也可能导致更加精确地对会以别的方式消化掉或以其他方法降解的小分子(非大分子)进行检测。本说明书中使用术语“破坏的(disrupted)”和“降解的(degraded)”来提及样品中分子结构的改变。如果结构改变使其功能受损，则即使结构的特性不破坏，也属于结构破坏。因此，举例来说，蛋白质可变性，而且在这种情况下，其二级结构、和/或三级结构和/或四级结构遭受破坏，也即，改变得使其功能遭到破坏。然而，这样的过程不改变其一级序列，并因此保持其特性。反之，如若化学特性变化，则结构降解。因此，举例来说，切割蛋白质产生两个或更多个片段时，就已使蛋白质降解，因为不仅其二级结构和/或其三级结构和/或其四级结构都被改变，其一级结构也被改变。降解的另一个实例是损失翻译后修饰，比如因蛋白磷酸酶或自发水解而失去蛋白质和肽的磷酸化。供本发明使用的样品可包括采自生物体的任何生物样品。因此，样品包括，但不限于，组织、肌肉、骨、骨髓、牙齿、毛发、皮肤，或任何器官如脑、肾、肝脏、胃、肠、生殖器官，或者胰腺。样品还包括体液，其包括但不限于泪、唾液、血液、精液、汗液，或者尿。生物体优选为哺乳动物，但是也可为爬行动物、无脊椎动物、鱼、昆虫或者鸟。生物体更优选为人，但也可为动物，包括但不限于非人灵长类、兔、羊、狗、猫、马、猴、小鼠，或者大鼠。例证件理论组织活着时，合成蛋白质并将之降解。这是动力学过程，并可用各种机制对之控制。举例来说，活组织内自然发生蛋白质水解，但是它被调节得能使水解后的蛋白质保留充分的量来执行其功能。疾病状况能改变这个平衡，因此，平衡的变化可用于表征疾病。蛋白质翻译后的修饰是变更和控制蛋白质功能和活性的重要方法，而且是许多细胞代谢过程和发信号的重要部分。用磷酸化作用调整细胞代谢过程和用特殊蛋白质激酶和蛋白质磷酸酶对蛋白质进行去磷酸化作用是高度动力学过程。特定蛋白质的磷酸化水准表示细胞和组织的状态，因此令人有浓厚兴趣来进行研究。样品的肽组(ρ印tidome)，即存在于特异性细胞、组织、生物体或者体系中的那组肽，直接连接其蛋白质组(proteome)。分子在蛋白质组和肽组之间的分配由蛋白酶和蛋白酶抑制剂来控制。死后的酶活性对组织如脑组织中肽的完整性和蛋白质含量起作用。样品中总有少量因样品中源于天然的蛋白质-肽自稳的蛋白降解所致的高度丰度肽。对组织和细胞的众多研究都要求将其从活体的支持性环境中取出，因此干扰了各种的受控制的过程，而且具体说来，还导致样品中氧和营养素丧失，例如当血液中止流动到组织时。局部缺血，限制血液运送到组织中，导致随后的氧不足和缺氧症。对脑组织样品的组织降解已有特别周密的研究。因此，即使脑细胞不象肌肉细胞那样有氧储库，即有肌红蛋白，其氧利用率仍高。为了确保脑细胞生存，需要不断供给氧和营养素。研究脑组织时的难题是，采用多种分析技术时，脑组织必须脱离其氧和营养素的供给环境。没有了氧，氧化磷酸化和随后的腺苷三磷酸(“ATP”)生成将停止，引起细胞功能缺失。脑组织开始降解的时间比其他生物组织或者体液的降解时间短得多。此外，甚至在脑内，蛋白质和多肽的降解时间也是不一致的。氧存留量通常低而不均勻，不同脑结构之间差异大。通常在富集细胞体和树突的区域较高，例如在皮层的灰质部，而在纤维占主导的区域，例如皮层白质、脑桥和穹窿等处较低(例如参见，Erecinska等所著，“TissueOxygenTensionandBrainSensitivitytoHypoxia“,Respir.Physiol,128,3:263-276,2001)。葡萄糖是成年人脑的主要代谢物。葡萄糖经糖酵解而代谢成丙酮酸，其进入线粒体中的克雷伯氏循环，在那里，当有氧存在时，被彻底氧化成二氧化碳和水(例如参见，Goldman等所著，“Acid-inducedDeathinNeuronsandGlia“J.Neuroscience,112489-2497,1991).氧气减少会干扰线粒体中的丙酮酸氧化。结果，线粒体的ATP生成会受损，只剩下糖酵解式的ATP生成。在缺血的脑中，ATP生成经由内源物质的厌氧转化而发生。如前所述，脑中只含微量的氧储存。血管中的氧储存仅能给脑中正常的氧消耗支持数秒钟。厌氧糖酵解使每mol葡萄糖只产出2molATP，而有氧糖酵解可产生35molATP。这导致利用内源储存的ATP、ADP和磷酸肌酸(PCr)。磷酸肌酸对ADP贡献磷基，从而将之转换成ATP。包括磷酸肌酸在内的高能磷酸化合物，以较高浓度存在于体外神经元和神经胶质中。(例如参见，Folbergrova等人所著，“PhosphorylaseAlphaandLabileMetabolitesDuringAnoxiaCorrelationtoMembraneFluxesofK+andCa2+“,J.Neurochem.，55(5)1690-6，1990)。通过使用这些内源性能量物质，能量代谢可在局部缺血情况下被支持约1分钟(Hansen所著，“EffectofAnoxiaonIonDistributionintheBrain“,Physiol.Rev.,65,1:101-48,1985)。在局部缺血研究中，葡萄糖被耗�。樗崴皆�60秒钟之后增加3倍。2分钟之后，乳酸水平增加5倍(R)Ibergrova等人)。高能磷酸基的利用在大约10秒钟之后就会减到30%，在第一分钟之后，减到15%，在2分钟之后，减到几乎为零(Hansen、Folbergrova等)。通过心脏骤停诱导缺氧症后，K+离子立即从大鼠大脑皮质流出(Hansen)。在头两分钟的缺氧症期间(K-阶段I)，K+离子慢慢增加。约2分钟后，胞外K+离子浓度在数秒钟内从IOmM升到约60mM(K-阶段II)。当ATP能量代谢和氧消耗已下降到很低水平时，胞外钾的摄取迅速增加；在局部缺血后在1至2分钟之间。在接下来的数分钟内，胞外K+水平慢慢升高到SOmM(K-阶段III)。K-阶段I期间的缓慢上升可能是由于K+离子向内泵入不足，此乃Na-K-ATP酶活性减弱所致。局部缺血1到2分钟之后，ATP能级不足以支持Na-K-ATP酶活性，引起去极化作用且Na、K，Ca和Cl减少(例如参见，Hille,IonicChannelsinExcitableMembranes,SinauerAssociations,Sunderland,MA,1992)。大鼠皮层中的完全缺血诱发胞内Ca水平在大约60秒钟之后迅速增加(Kristian,“MetabolicStages,MitochondriaandCalciuminHypoxic/IschemicBrainDamage“,CellCalcium,36，3—4:221-33,2004)。缺血诱发的离子内稳变化引起去极化作用，使Ca通过压力依赖性Ca水平和NMDA受体而进入。NMDA拮抗剂治疗缺血性大鼠皮层在30秒钟之内延迟了胞内Ca增加(Kristian)。Ca-ATPase活性和Ca被扣留在细胞器中受ATP驱动、并因此对能量代谢率敏感。大鼠皮层中葡萄糖水平增加还将Ca流入延迟了90秒钟(Kristian)。当能量代谢受损时，Ca从细胞器中释放出来。Ca的增加可以激活K-Ca通道，从而促进K流出(Hille)。离子平衡消失时，细胞器瓦解，蛋白质和肽被释放并降解。如上所述，在将组织样品从活体取出后，降解可增加或者持续失控，从而迅速地导致样品内的蛋白质和多肽降解。因此，为了获得组织中关于蛋白质和多肽组成的最大量信息，在将样品从生物体中取出之后，应尽快加热之。不拘泥于任何特定理论，人们相信，组织在ATP水平降到低于样品细胞中不再保持离子梯度的临界点之前，就得加热。由离子如钠和钾的浓度梯度表现出来的跨细胞膜电化学梯度，为胞内化学过程提供了能源。酶如Na+ATPase和K+AIPase利用ATP来产生并保持这样的梯度。一旦细胞缺乏能量，那就是说，一旦ATP水平降到低于阈值水平，作为离子内稳态受到干扰的结果，钙在细胞间隙积累。离子平衡消失时，细胞器瓦解，而且蛋白质和肽被释放出来并降解。魏从生物体上提取样品可用许多形式。例如，样品可用切割法、涂片法或者用注射器或导管引出法从生物体上提取。虽然所有的生物样品通常都经受同样的、最终导致坏死的步骤，其中ATP生成和磷酸化都停止，离子梯度消失，细胞器破坏，蛋白质和肽被释放，而且蛋白质水解增加，但这些步骤中每个步骤的比率至少部分地取决于样品类型。因此，尽管有些样品中直到差不多已过去10分钟还不发生大规模降解，在有些样品中，大规模降解可以快得像从生物体取出组织的时间起3分钟、2分钟、1分钟、30秒钟、10秒钟或者更少的时间发生。特别是翻译后修饰如蛋白质磷酸化的损失，可以发生在数秒钟之内。因此，从生物体获取样品到样品被加热之间的时间段(本文中还要记述)优选为3分钟，更加优选的是2分钟，甚而更优选在10秒钟和2分钟之间。在有些实施方式中，为避免样品降解，可用器具来获取样品，该器具能同时取出样品并使之形成所要求的外形。然后立即将样品引入加热器，以阻止更进一步降解。样品成形确定怎样来使样品成形，以便可均勻加热样品，这考虑到加热样品所用器具的类型、样品的各种特征。样品可用一种或多种众所周知的传热方式传导，对流或幅射。若用热传导方式加热样品，则确定怎样来选择样品形状的因素是，优选样品内部没有任何部份大于离热源的临界距离。优选的是，此阈值是5mm，虽然它可随着组织样品的性质而变。例如，它可为1mm、2mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、9mm，或者Icm0在有些实施方式中，优选的是样品成形得具有尽可能最大的表面积对体积之比，例如产生非常薄的片，优选的是勻薄片。在加热器具有特定形状如圆柱形加热元件或者插入样品中的针状传热元件之类导热元件的情况下，圆柱形可能更加合乎样品的需要。样品的形状应该是一种能使任何在加热期间产生于样品两侧的温度梯度增加到最大限度的形状，以使热传导从样品表面到样品内部尽可能有效。加热步骤的速度可保持在足够快的速度，但也得加以选择，以防温度升得过高，或者防止样品的某些部分受热太慢，而且不加热到同样品其余部分一样的温度。倘若容许样品的一部分超过最高温度，则样品中的水会煮沸，而且细胞结构可遭破坏。在更极端的情况下，所关心的蛋白质或多肽的一级结构可被过高的温度破坏。反之，倘若样品的一些部分达不到所述变性温度，则整个样品可被不变性部分的残留存在度所污染。均勻加热避免了这两种结果。通过切割样品，可把样品成形为所要求的形状。在有些实施方式中，挤压样品或者使样品变平，例如用加压法来实现所要求的形状。在有些实施方式中，样品的厚度在约1微米到2，000微米之间，例如在1微米和1，000微米之间、1和500微米之间、1和200微米之间、1和100微米之间、1和50微米之间、1和25微米之间、1和20微米之间、1和10微米之间或者1和5微米之间。须予理解的是，上述范围的各个上下终点可不受限制地彼此互换例如，尽管在上文中没有明确叙述，但1050微米的范围也认作在本发明的范围内，5001，000微米也然。还须理解的是，本文中所用的词语“约(about)”与任意量如时间或长度或质量有关，它用来意指所讨论的值可以至多变化5%，小于或大于引用值。因而，举例来说，约10微米的厚度是用来意指9.5微米到10.5微米范围内的任何厚度。就温度而言，词语“约(about)”意指变化为士2°C。冷冻样品作为选择，样品在分析前可予冷冻，例如用闪冻法。可使样品达到优选低于-20°C的温度，例如低于-80°C。样品冷冻的一个优点是，可掌握样品的处理，并可使样品处于冻结状态时比新鲜时成形为更容易均勻加热所要求的形状。冷冻样品可切成小于约5mm、约4mm、约3mm、约2mm、约1毫米或者0.5mm的厚度。优选的是，对于冷冻样品来说，样品形状是薄片，厚度数量级为微米。切割新鲜样品时，不太容易切成这样的薄片。冷冻能使样品中的任何液体，包括被视作固体的样品在内凝结起来，允许更加精确地切割样品。加之，冷冻停止了酶活性，并预防样品的其他组分降解。当样品从生物体取出后予以冷冻时，样品应该在加热以前保持冷冻，例如低于-20°C或者低于-4°C。当冷冻样品时，形成冰晶并干扰原生质外膜。另外，当对冷冻样品解冻时，囊膜(vesiclemembranes)还变得可渗透。一旦样品解冻，渗透性增加能使蛋白质降解发生得比在从来没有冷冻过的样品中更迅速。在有些类型的生物样品情况下，加热样品前不得解冻样品。也就是说，样品加热前不得达到高于-20°C的温度。若要解冻样品，则在样品解冻起始约30秒内加热样品，以防大规模降解发生。JMi把样品加热，优选均勻加热，到使样品中大分子变性而不使这些大分子及其他大分子的一级结构降级的温度。加热可以通过传导、对流或者幅射形式的的热交换来进行。另外而且作为选择，可把微波辐射引导到样品上来将之加热。常压下，样品可加热到约70°C、80°C、9(rC、95°C或100°C的温度，或者加热到因待变性分子类型而异的液体样品的沸点。在有些实施方式中，防止了样品温度高于极限温度，例如，常压下样品的沸点或者100°C，以使一级结构不遭破坏。为使大分子变性，样品可在压力下加热到较高的温度。样品的温度保持在阈值以下，并因此保持宏观结构，就可便利样品分析。如果加热步骤所实现的温度使样品到达某个温度，在此温度下大分子的二级结构破坏，大分子就被变性。在某些情况下，加热使酶活性失效，蛋白质和多肽降解。加热可使至少60%，例如至少70%、80%、90%或者95%的样品酶活性停止。加热也会改变所考虑的蛋白质和多肽的三级结构和二级结构。然而，加热并不降解大分子的一级结构和翻译后修饰。任何加热器都可加热样品，迅速使样品的所有部分都达到最小70°C的温度，例如在少于2分钟内、少于1分钟内、少于30秒内、少于10秒内、少于5秒内、少于2秒内或者少于1秒内。在有些实施方式中，加热使样品的所有部分在23分钟内达到至少70°C的温度。这里记叙那类利用传导或幅射进行工作的加热器。传导加热可用于幅射不会均勻加热样品的情况。在冷冻的样品中，用微波辐射加热可使样品的某些部分在样品的其他部分之前达到所要求的变性温度。打个比方来说，一块在微波中加热的冰会抗拒解冻，这是因为微波不改变氢键键合的分子网络。举例来说，冰用热传导法解冻比应用微波辐射更有效。当冰在某些区域开始融化时，熔化后的冰I熔融的冰，即水开始以传导方式使周围的冰变暖并加热之。这可允许冰块的某些部分解冻，并在冰块的其他部分解冻之前到达沸腾。生物样品的这个现象引起不均勻加热，这可允许样品中存在比样品中可能存在的、也即均勻加热到目标温度的肽片段更多的肽片段。避免这个现象的选择方案是在加热步骤前就解冻样品。另一个选择方案是使用一种不同于微波辐射加热已冷冻样品的加热方法。总而言之，这样的加热步骤可以避免单设的一步解冻步骤。时机从生物体采样后，有两个可发生样品降解的阶段。第一个阶段开始于样品取出并结束于加热步骤起始。第二阶段始于加热步骤起始并结束于样品到达所要求的温度之时。如果样品没有冷冻，则第一阶段和第二阶段综合起来应该在样品降解之前完成，也即，在样品中离子失衡或者ATP耗竭和随后分子碎片增加之前完成。这里记述了确定每一种生物样品所适用时间的方法。然而，对于从未冷冻过的样品来说，最好这两个阶段在10分钟之内完成，例如在5分钟内、3分钟内、2分钟内、1分钟内或者30秒内。在有些实施过程中，第二阶段在2分钟内、1分钟内、30秒内、20秒内、10秒内、5秒内、2秒内、1秒内或更少时间之内发生。如果样品冷冻过，则第一个阶段既可延长也可缩短。延长该阶段，是因为样品可在延长的时间阶段(例如数天、数周、数月以至数年)保持冷冻。然而，缩短第一个阶段，使样品解冻和样品加热之间的时间必须保持得非常短，因样品解冻后将加速降解。化学固定化学固定优选在福尔马林，也即甲醛水溶液，例如含4%甲醛的磷酸盐缓冲盐水中进行。或者，固定在戊二醛水溶液，例如含2.5%戊二醛的磷酸盐缓冲盐水中进行。适宜的固定时间通常在6到36小时之间。生物分析实例在样品已用本发明方法稳定化之后，可分析样品来测定样品中蛋白质和多肽的组成。样品可优选用组织学方法，例如组织化学和免疫组化法来分析。装置实例无论样品是否是新鲜的或者是冷冻的，当加热时，可将样品置于可排气的容器内，以使样品可直接接触热源，在样品和热源之间没有气囊。该容器可以是可变形的材料片，例如袋状物或箔片，这种材料不释放会干涉分析结果的分子。用于这样一种容器的适宜材料可包括聚合物，例如医学级聚合物或其他不释放气体的材料，或者具有在样品处理期间可迁移到样品中的组分的材料。在具有适于均勻加热样品的构造的装置中加热准备好的样品。这允许热传递快速而均勻地穿透整个生物样品。在有些实施方式中，热源是例如用加热元件加热的单块板子，而样品无论它是否置于容器内，都仅从一侧接受热，也即有单个接触面允许将能量传递到生物样品中。在另一种实施方式中，热源是用幅射(例如微波辐射)来加热生物学样品的装置。辐射源可以是微波发生器。做为选择，其他类型的幅射也可用于样品，例如无线电频率(射频)或者超声。辐射源可输出约1至6瓦能量，例如在约3和5瓦之间。在有些实施方式中，如果生物样品的热容量与水相似，则将约2和4瓦/分钟/克之间，例如3.6瓦特*分钟，输到样品中，把样品温度从20度提高至80度。所需的辐射能是3.6/效率瓦*分钟/克，也即如果效率是10%，则所需的幅射是36瓦*分钟/克。质量包括样品和填料两者的质量，也艮口，如果填料的质量相似于样品，而且样品称重10克，效率为10%时，则在一分钟内就需要360瓦来加热样品至80度。因而，在20°C至80°C下，30秒内加热1克要求约72瓦。相对本文中所记述的任何其他方法，本文中所记述的任何方法都可实现。实施例实施例1小鼠脑样品经不同处理后磷酸化CREB的免疫组化。实验牛物样品和处理用颈脱白法处死小鼠，立即收集样品。处死后立即摘下全脑，并对之进行以下处理中的全部处理或任一项处理；A直接淹没在10%中性缓冲福尔马林中(NBF)，B淹没在NBF中之前，室温下保持15分钟。C:淹没在NBF中之前，室温下保持2小时。D通过在StabilizorTl仪(DenatorAB,Sweden)中按新鲜组织的自动设置进行热处理、且处理后直接浸没至NBF中来稳定。在石蜡包埋之前，全部样品都在室温下保存于甲醛溶液中M小时。全部样品都不经进一步的NFB中切割即予保温。在石蜡包埋之前，把样品切成两半并包埋，使得切片可切割穿过原始样品的中心。组织化学从石蜡块切4微米厚的切片，并立即置于SuperFrostPlus载玻片(BDH，Merck&Co.,Inc.,Poole,UK)上，在二甲苯中脱蜡并从分级酒精至水进行脱水。切片用苏木素-伊Χ(DAKOAS,Copenhagen,Denmark)Mallorytrichrome(Bio-Optica,Milano,Italy)染色，染色各按厂家说明书进行，无需改变。免疫组化从石蜡块切4微米厚的切片，并立即置于SuperFrostPlus载玻片(BDH，Merck&Co.，Inc.，Poole,UK)上，在二甲苯中脱蜡并从分级酒精至水进行脱水。在pH6的柠檬酸盐缓冲液(NeuNantibody,Millipore(Chemicon),#MAB377)中或者在pH9的TE-缓冲液(pCREB(Serl33)antibody，Abeam,#ab32096)中，用微波炉以750W处理10分钟，继之以350W处理15分钟，进行抗原修复，然后在DAKOAutostainerPlus(DAKOAS,Copenhagen)中进行处理。所有第一抗体保温30分钟。用divisionRealDetection试剂盒、过氧化物酶/DAB、兔/小鼠(K5007)来探测免疫染色，并用苏木素复染，均按照生产厂家说明书使用(DAKOAS,Copenhagen,Denmark)。图像采集和处理图象用ScanScopeχτdigitalslidescanner(AperioTechnologiesInc.,Vista,CA,USA)以40x放大倍数采集。进一步的切片用Aperio'sImagekope观察器选择，并用AdobePhotoShop(AdobeSystemsIncorporated,SanJose,CA,USA)组合至Ij小图上。结果图1显示了经福尔马林固定的小鼠皮层组织中磷酸化CREB即pCREB(krl33)的免疫组化观察结果，所述组织在尸检后浸入福尔马林之前于室温保温O120分钟(小图A0分钟，小图B15分钟，小图C2小时)。小图D显示用本发明方法处理过的样品，即取样后马上加热，继之以福尔马林固定来稳定。大黑点是PCREB阳性核，较小灰色点是用正铁血红素-伊红复染的pCREB。O120分钟的各个样品从外(右)到里(左)有明晰提�。っ鱬CREB的降解。死后时间较久产生较浅的染色，证明pCREB降解更广泛。按本发明方CN102472698A说明书11/11页法处理过的样品中，整个样品都可见到黑色的大pCREB阳性核，证明pCREB降解得少或者不降解。实施例2.小鼠脑样品的稳定化实验牛物样品和处理用颈脱臼法处死小鼠，立即收集样品。处死后立即摘下全脑，在MabilizorTl仪(DenatorAB,Sweden)中按新鲜组织的自动设置进行热处理、且在以下时间段进行室温保温来稳定在淹没在NBF中的A:0分钟、B15分钟、C6小时以及D24小时之前。在石蜡包埋之前，全部样品都在室温甲醛溶液中保存M小时。全部样品都不经进一步的NFB中再切割即予保温。在石蜡包埋之前，把样品切成两半并包埋，使得切片可切割穿过原始样品的中心。会目织化学,^mw化PI及图像采集应用与处理均如实施例1所描绘进行。MM图2显示了经福尔马林固定的小鼠小脑组织样品中磷酸化CREB即pCREB(Ser133)的免疫组化观察结果，所述组织按本发明方法在室温以延长的时间保温，再稳定。小图A稳定后O分钟，小图B稳定后15分钟，小图C稳定后6小时，小图D稳定后M小时。从整个组织可见到PCREB阳性核，处理后甚至在M小时室温培育之后都是如此，证明样品完全稳定。权利要求1.稳定用于分析的生物样品的方法，该方法包括a)将样品加热到高于70°C的温度，以阻止酶促过程；以及b)随后对样品进行化学固定。2.权利要求1所述的方法，其中该方法用于稳定组织学分析所用的生物样品，最优选组织化学分析和/或免疫组化分析所用的生物样品。3.权利要求1所述的方法，其中所述生物样品包含至少一种具有翻译后修饰的蛋白。4.权利要求3所述的方法，其中所述生物样品包含至少一种具有磷酸化的蛋白。5.权利要求1所述的方法，其中将所述样品是加热到高于80°C的温度，例如高于90°C的温度，最优选加热到高于95°C的温度，例如加热到100°C的温度。6.权利要求1所述的方法，其中所述化学固定用交联剂来进行。7.权利要求6所述的方法，其中所述交联剂是醛。8.权利要求7所述的方法，其中所述醛是甲醛或戊二醛。9.以权利要求1至8中任一项所述方法稳定的生物样品。全文摘要本发明提供一类稳定用于分析的生物样品的方法。更具体地说，本发明提供了将生物样品的加热处理和化学固定组合以保持蛋白质一级结构和翻译后修饰如蛋白质磷酸化的方法。文档编号G01N1/30GK102472698SQ201080033940公开日2012年5月23日申请日期2010年6月8日优先权日2009年7月30日发明者K.斯科尔德,M.博伦,M.斯文森申请人:德纳托股份公司
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