专利名称：一种筛选抗血管生成活性物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种筛选抗血管生成药物的方法，特别是一种利用斑马鱼模型筛选抗血管生成药物的方法，属于药物筛选领域。
背景技术：
血管生成是恶性肿瘤发生发展过程中的必要过程，与恶性肿瘤的生长和转移有十分密切的关系。肿瘤血管对于恶性肿瘤的作用主要表现在两方面，1、肿瘤血管为肿瘤细胞的生长提供必需的养料和氧；2、肿瘤血管的存在为肿瘤细胞侵入循环系统、进而实现远处器官转移提供了前提。1971年Folkman首先提出肿瘤生长和转移是血管依赖性的，阻断血管生成是遏制肿瘤生长的有效策略这一著名学说，使人们开始认识到血管对于肿瘤的重要
眉、ο抗血管生成已经成为有效治疗肿瘤的策略之一。建立可靠的血管生成模型是血管生成研究方面的基础。动物模型是现代生物医学和药理学研究中的一个极为重要的实验方法和手段。人们可通过不同手段复制出各种模型，在人为设计的实验条件下反复观察和研究，避免了人体实验造成的伤害。模型动物不仅在群体数量上容易得到满足，而且可以在方法学上严格控制实验条件，增强实验材料的可比性。斑马鱼模型是一种理想的抗血管生成药物筛选体内模型。其胚胎早期发育的过程中，血管生成的模式比较简单，主要出现在头部和躯干部体节间，体节间的血管最初由背部的动脉出芽形成于相邻体节之间。现有的利用斑马鱼检测样品抑制血管生成活性的方法主要有两种。1)碱性磷酸酶染色方法。Parng等利用此模型筛选活性成分，在96孔板上用待测样品处理胚胎，通过血管内源性碱性磷酸酶染色来显示血管，进而评价待测样品对血管生成的作用。该方法操作繁琐，而且不能实时观测血管生成情况。2)荧光标记血管法。Cross等研究发现荧光标记血管的转基因斑马鱼(VEGFR2 =GFP) 可用来快速筛选抗血管生成药物，认为其有潜力成为一种高通量蹄选模型。一些抗血管生成药物如SU5416、SU6668、TNP470作用于斑马鱼的效果与在哺乳动物中的相近。该方法简便快捷，但是靶点单一，只有影响VEGFR2(II型血管内皮生长因子受体)表达的样品才能出现阳性结果，而且影响VEGFR2表达的样品，不一定影响血管生成。上述实例证实了利用斑马鱼筛选抗血管生成药物的有效性，但是上述模型存在的不足之处极大地限制了抗血管生成活性物质的筛选。本领域迫切需要开发既操作便捷又能综合反映样品抑制血管生成活性的筛选抗血管生成活性物质的方法。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种利用斑马鱼模型中生成有血流的血管数量来筛选抗血管生成药物的方法，以获得具有药物开发价值的新的活性物质。一种筛选抗血管生成药物的方法，步骤如下(1)将发育20-28小时的辐鳍鱼纲动物胚胎放入由对血管生成有抑制作用的待筛选物质配制的溶液中，培养20-28小时后，观测辐鳍鱼纲动物胚胎的循环系统发育情况，在心脏形态正常和心率正常的前提下，统计辐鳍鱼纲动物胚胎体节间有血流的血管数量，得实验组节间血流数；(2)观测培养20-28小时后的对照组辐鳍鱼纲动物胚胎的循环系统发育情况，在心脏形态和心率正常的前提下，统计辐鳍鱼纲动物胚胎体节间有血流的血管数量，得对照组节间血流数；(3)将步骤⑴获得的实验组节间血流数与步骤(2)获得的对照组节间血流数按
如下公式计算
血管生成抑制率(0/0)=对照组节间血 =-、实验f且节间血流数χ100%
对照组节间血流数得到血管生成抑制率，当血管生成抑制率大于30%时，待筛选物质即为对血管生成有抑制作用的抗血管生成活性物质。所述步骤(1)中，辐鳍鱼纲动物为斑马鱼。上述斑马鱼为野生型斑马鱼。所述步骤(1)中，对血管生成有抑制作用的待筛选物质为天然活性物质或化学合成物质。上述天然活性物质为来自植物、动物和/或微生物中的由单一组分或者多种组分构成的物质。上述多种组分的数量为2-50种；优选的，上述多种组分的数量为2-25种；更优选的，上述多种组分的数量为2-15种。所述步骤⑵中，对照组辐鳍鱼纲动物胚胎为施用了阴性/阳性对照药物的阴性 /阳性辐鳍鱼纲动物胚胎、正常培养的辐鳍鱼纲动物胚胎或施用了相应浓度溶剂的辐鳍鱼纲动物胚胎。所述步骤(2)和步骤(3)中，心脏形态正常是心房和心室的形状正常，是指心房与心室的体积比例为 1. 5-2. 5 (如图 1 所示，Structure and Function of the Developing Zebrafish Heart, The Anatomical Record, 2000, Oct 1,260(2) :148_157.)；心率正常是心房跳动的频率和心室跳动的频率为180-210次/分。本发明的有益效果1.本发明通过观测斑马鱼体节间有血流的血管数量获得待筛选物质是否对血管生成有抑制作用，为成本低廉、快捷准确的化合物筛选提供了新的方法。2.本发明采用体节间有血流的血管数反映化合物/混合物对血管生成的影响，与传统的以血管壁的存在或完整性反映化合物/混合物对血管生成的影响相比，从血管功能角度反映血管的存在，更加科学、客观。3.本发明通过限定观测时心脏形态和心率参数条件，排除心脏毒性引起的血流滞缓对数据影响的因素，提高了结果的客观性和准确性。4.本发明中的模型动物斑马鱼，与其他模型动物相比，具有繁殖能力强、养殖成本低、胚胎透明、生长发育快等优点；利用斑马鱼胚胎进行化合物/混合物活性筛�。欣谔岣呱秆⌒屎徒档褪笛槌杀�。
图1是斑马鱼心脏切片显微照片；其中A、心房，V、心室。具体实施方法下面结合实施例，对本发明做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实验材料1.实验动物实验所用斑马鱼为AB系普通斑马鱼。喂养时，照明14h/黑暗IOh交替进行，雌雄斑马鱼分开喂养，定时喂以人工颗粒状饵料和卤虫无节幼体(Artemia nauplii)。采卵时， 傍晚将健康性成熟的斑马鱼，按雌雄1/1或1/2的比例放入交配缸内，次日清晨获得受精卵。对受精卵进行消毒和清洗后，移入斑马鱼胚胎培养用水中，28°C下控光培养。实验方法1.试剂配制抑制血管生成的阳性化合物PTK787 (购自Sigma公司)溶解于二甲基亚砜，配成 5mg/ml的储液低温保存，实验前用斑马鱼胚胎培养用水(5mmol/L NaCl,0. 17mmol/L KCl, 0. 4mmol/L CaCl2,0. 16mmol/L MgSO4)稀释至 0. 0625 μ g/ml、0. 125 μ g/ml、0. 25 μ g/ml、 0. 5 μ g/ml 和 1 μ g/ml 的 PTK787 溶液。抑制血管生成的阳性化合物靛玉红购自中国药品生物制品检定所，称取靛玉红样品5mg，溶解于100 μ L 二甲基亚砜(DMSO)，配制成质量浓度为50mg/ml的母液，再用胚胎培养用水将母液稀释成5mg/ml，10mg/ml,20mg/ml,40mg/ml (1%。DMS0)4个质量浓度的靛玉红溶液。实施例1 :PTK787对斑马鱼血管生成的影响在体视显微镜下挑选发育24小时的正常胚胎，移入96孔板的样孔中，每孔一枚。 样孔中已预先加入了含不同浓度的ΡΤΚ787溶液，每个浓度10个重复。对照组为胚胎培养用水。随后加盖封闭，置于光照培养箱(28°C)内，让胚胎继续发育。在胚胎发育48小时后， 于倒置显微镜下观察心脏形态，记录心跳频率，再观测统计体节间有血流的血管数量，获得实验组节间血流数和对照组节间血流数。结果见表1，根据如下公式计算血管生成抑制率
权利要求
1.一种筛选抗血管生成药物的方法，步骤如下(1)将发育20-28小时的辐鳍鱼纲动物胚胎放入由对血管生成有抑制作用的待筛选物质配制的溶液中，培养20-28小时后，观测辐鳍鱼纲动物胚胎的循环系统发育情况，在心脏形态正�：托穆收５那疤嵯拢臣品⒂愀俣锱咛ヌ褰诩溆醒鞯难苁浚檬笛樽榻诩溲魇�(2)观测培养20-28小时后的对照组辐鳍鱼纲动物胚胎的循环系统发育情况，在心脏形态和心率正常的前提下，统计辐鳍鱼纲动物胚胎体节间有血流的血管数量，得对照组节间血流数；(3)将步骤(1)获得的实验组节间血流数与步骤(2)获得的对照组节间血流数按如下公式计算.血管生成抑制率(0/0)=对照组节间血 =-、实验f且节间血流数xl00%对照组节间血流数得到血管生成抑制率，当血管生成抑制率大于30%时，带筛选物质即为对血管生成有抑制作用的抗血管生成药物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，辐鳍鱼纲动物为斑马鱼。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，上述斑马鱼为野生型斑马鱼。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，对血管生成有抑制作用的待筛选物质为天然活性物质或化学合成物质。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，上述天然活性物质为来自植物、动物和/或微生物中的由单一组分或者多种组分构成的物质。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，上述多种组分的数量为2-50种。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，上述多种组分的数量为2-25种。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，上述多种组分的数量为2-15种。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，对照组辐鳍鱼纲动物胚胎为施用了阴性/阳性对照药物的阴性/阳性辐鳍鱼纲动物胚胎、正常培养的辐鳍鱼纲动物胚胎或施用了相应浓度溶剂的辐鳍鱼纲动物胚胎。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中，心脏形态正常是心房和心室的形状正常，是指心房与心室的体积比例为1. 5-2. 5 ；心率正常是心房跳动的频率和心室跳动的频率为180-210次/分。
全文摘要
本发明涉及一种筛选抗血管生成活性物质的方法，特别是一种利用斑马鱼模型筛选抗血管生成活性物质的方法，属于药物筛选领域。本发明通过观测统计斑马鱼体节间有血流的血管数量获得待筛选物质是否对血管生成有抑制作用。与传统的以血管壁的存在或完整性反映化合物/混合物对血管生成的影响相比，从血管功能角度反映血管的存在，更加科学、客观，提高了结果的准确性。
文档编号G01N33/50GK102445531SQ20111028441
公开日2012年5月9日 申请日期2011年9月22日 优先权日2011年9月22日
发明者何秋霞, 侯海荣, 刘可春, 彭维兵, 王希敏, 王雪, 袁延强, 陈锡强, 韩利文 申请人:山东省科学院生物研究所
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