专利名称：用于在快速侧流免疫测定中增强灵敏度以及评估样品充足性和试剂反应性的方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及免疫测定装置及其使用方法。更具体地，本发明涉及利用毛细管侧流快速检测生物流体中的配体的快速免疫测定法。本发明涉及允许在快速侧流免疫测定的进行过程中评估样品充足性和确认关键试剂的免疫反应性的方法和装置，以及在此类免疫测定中提供增强的灵敏度的方法和装置。所述方法和装置特别地涉及在快速侧流免疫测定中待评估的液体样品中免疫球蛋白的充足水平的确认，以及存在于测定的膜上的抗原、颗粒标志物(P ar t i c u I a t e marker)和任何对照单克隆抗体、多克隆抗体或其它配体的免疫反应性的确认。所述方法和装置还特别地提供了简单的装置设计和方法，其与常规侧流快速诊断测试相比，允许配体与其特异性结合伴侣更有利地相互作用(就来自颗粒标志物的干扰或通过颗粒标志物进行的检测而言)。本发明提供了具有比常规侧流免疫测定法更高的灵敏度的快速测试。本发明的方法和装置使用HIV抗体和抗原，以及人C反应蛋白和其配体来举例说明。本发明的此类方法和装置提供了可用于快速检测特异于其它抗原的抗体或用于检测其它配体结合对和其它医疗状况的平台策略和装置方法。
背景技术：
当今许多快速侧流诊断测试被用于世界各地。Rosenstein于1987年首次描述了该方法(美国专利No. 5，591，645)，此后许多其它人提供了改进(美国专利No. 4，855，240，Rosenstein 等人；美国专利 No. 5, 602, 040, May 等人；美国专利 No. 5, 714, 389, Charlton等人；美国专利 No. 5, 824, 268, Bernstein 等人；和美国专利 No. 7, 364, 914, Esfandiari)。然而，检测抗特定抗原的抗体的此类测试都没有在每一个测试内提供同时检测待评估的样品实际上是否包含充足量的免疫球蛋白以允许检测特定抗体(如果存在的话)的手段。同样地，目前可获得的此类测试都没有同时报告所述测试所需的关键试剂的免疫反应性以提供精确结果的内部对照(built-in control)。这两个重要方面的省略意味着，一些测试可能因样品不充足或已失效的试剂而提供假阴性结果。当人具有HIV抗体并且他们没有给快速评估测试提供充足的样品时，或当所述测试的关键试剂已变质时，在测试膜上将不会显现通常表示阳性结果(例如测试样品中抗HI V抗原的抗体)的条带(line)。测试用户可能会得出错误的结论所述测试是阴性的，因为未出现条带。然而，在将用于样品充足性和试剂反应性的对照包括在测试中后，该错误将不发生。用户可观察到，样品不足，不能进行测试，或实施精确测试所需的的关键试剂不起作用，并且得出正确结论测试结果是无效的并且不能用于解释，而不是错误地得出结论测试是阴性的。用于HIV的快速测试的此类错误的具体实例已在Kenya和Uganda(March 28，2009-Uganda Monitor Online,Dr.Z. Akol,the STD/AIDS Control Programme manager atthe Health Ministry,Kampala,Uganda)中进行了报导，并且已记录了，因暴露于恶劣的储存条件和使用超过其有效期的测试而造成的给予6，255人的测试的失败，可利用用于抗原和关键试剂反应性的对照检测到，但没有进行检测的失败，以及因错过20分钟或更短的测试短读取窗(超过该读取窗进行读�。刹傺粜�)而造成的失败。在印度，使用错误测试(其缺乏对照来检测试剂失效或样品不足)在5个州测试了超过10万人-在07年2月至07年5月，仅在孟买就测试了 76，464人，并且SKudalkar，孟买地区艾滋病控制协会(MDACS)的主任宣称，“那些在这3个月中被测试为阴性的人让人担心。因为他们未再次进行测试，如果他们的结果是错的，那么他们可能已错过恰当的治疗”。Dr. A. Deshpande也指出，可能没有检测到具有HIV感染的怀孕母亲。德里最高法院在2009年5月25日规定因所用的HIV快速测试的质量较差，在07年2月至07年5月之间测试的所有人必须重新进行测试(M. Rajadhyaksha, TNN 2009 年 7 月 29 日)。目前，许多快速侧流测试包括所谓的阳性对照，其不过是简单地报告引入所述快速测试的流体已迁移至测试结果窗口的末端的不完善的程序对照(incompleteprocedural control)(参见美国专利 No. 5, 989, 921, Charlton 等人,权利要求 I，第 26 行 ,无论抗体存在还是不存在于样品中，“所述对照位点包含结合所述缀合物的固定化的结合剂”。也参见美国专利No. 5，656，503,May等人，权利要求42 (d)，第63行，“对照区位于所述干燥多孔载体的所述述测试结果区的下游，用于结合标记试剂以表明，所应用的液体生物样品已通过毛细管作用被运输通过所述测试结果区”。再次地，该结合不依赖于目标分析物在液体生物样品中的存在或不存在。还参见OraSureOraquick ADVANCE Rapid HIV_l/2testPM，其涉及“固定在…对照(C)区中的硝酸纤维素膜上的山羊抗-人IgG程序对照”……“该内部程序对照用于显示，样品已被添加至瓶中并且流体已充分迁移通过测试装置”。这些对照不能鉴别可因测试不足的样品或关键测试试剂失效而引起的假阴性结果。用于检测抗HIV的抗体的基于当前先进仪器的测试，与快速侧流诊断测试相比，通�？稍缡�(在感染后血清转换期间)检测到抗HIV的抗体的存在，并且远在Western印迹确证测试变成阳性之前。对于快速侧流诊断测试，期望的是，具有增强的灵敏度以允许它们更接近基于仪器的测试的灵敏度。目前用于HIV的快速侧流诊断测试已得到US FDA批准，其具有非常短的读取窗，超过该读取窗，测试会因增加的假阳性结果的风险而得不到解释。例如，Trinity BiotechUniGold Rapid HIV-I抗体测试必须在2分钟的窗口内(精确地说，在测试开始后10-12分钟)读取。Inverness Determine HIV-1/2抗体测试必须在15至20分钟之间的5分钟窗口内读取,OraSureOraQuick ADVANCE HIV-1/2测试必须在20至40分钟之间的20分钟内读取。在繁忙的急诊室或紧急医疗诊所中，快速测试的该有限的读取时间可能难以满足，从而导致不能恰当地读取测试，或由于该限制而不能广泛使用所述测试。期望获得具有至少数小时，优选数天至数月的读取窗的测试。目前，现有的快速侧流诊断测试装置偶尔允许测试试剂从下游吸收垫向上游回流至读取窗。当发生该情况时，测试结果变得�：磺澹佣薹ň范寥〗峁�。期望获得这样的方法和装置，其利用防止此类试剂回流的方法。发明概述
本发明的重要目的是，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定装置，其与常规侧流快速免疫测定法相比，当未经训练的用户利用本发明的改进的方法和装置时，减少发生错误结果的概率。因此本发明的一个目的是，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定装置，其根据样品是否包含充足的免疫球蛋白(以允许检测样品中的特异性抗目标抗原或分析物的免疫球蛋白分子)来评估样品充足性。本发明的其它目的是，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定装置，其确认所述快速测试的所有关键试剂的反应性。这包括确认固定的抗原或分析物的反应性，免疫测定形式中利用的任何阳性对照可移动的免疫球蛋白的反应性，以及颗粒标志物的反应性，所述颗粒标志物检测生物液体样品中的特异性识别固定的抗原或目标分析物的免疫球蛋白分子，并且还识别测试形式中的阳性对照免疫球蛋白。本发明的其它特别期望的目的是，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定 装置，其允许通过定制拭子从牙齿龈缝线收集口腔液，所述拭子直接适配装置并且允许从拭子直接稀释该銀缝液(gingival crevice fluid)和就特定抗体分析该稀释样品。由于许多患者更偏好不需要血液样品的测试，因此，测试样品中的口腔液以进行测试的能力可为其使用提供更广的可接受性。本发明的目的还在于，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定装置，其与常规侧流免疫测定法相比较，通过提供更有利的包括在测试形式中的特定结合对之间的相互作用，增加了免疫测定的灵敏度。本发明的其它目的是，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定装置，其保持快速侧流免疫测定法固有的实施和解释的简单性，这允许未经训练的用户广泛地使用此类快速测试。本发明的其它目的是，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定装置，其使读取窗(可在其间正确地解释测试结果)从最早时的10至15分钟增加至多达24小时或更长时间。本发明的一个目的是，提供方法和利用所述方法的快速侧流免疫测定装置，其阻止试剂从快速测试装置的下游吸收垫回流至测试的上游读取窗。本发明的另一个目的是，将利用本发明的方法的任何测试装置设计为与注射成型相容，以产生装置的塑料外壳部分，并且所述设计适合用于自动装配制造。如下文实施例、附图和发明详述中详细地论述的，本发明已开发了实现上述目的的方法和装置。本发明已发现了特定免疫球蛋白结合试剂的组合，其允许在快速侧流形式中检测免疫球蛋白的存在，同时克服关于许多结合对发生的非特异性相互作用的问题，所述非特异性相互作用阻碍精确评估测试样品中是否存在充足的免疫球蛋白。本发明还提供了方法和装置，其允许确认抗原(其用于检测特异于其的抗体)的免疫反应性，同时确认测试中所使用的颗粒标志物的免疫反应性，以及用于结合抗原(其在测试中用于检测待检测的液体样品中的抗体)的关键表位决定簇的任何单克隆抗体或多克隆抗体的免疫反应性。这通过本发明提供的测试装置和膜构造(membrane configuration)来实现，所述测试装置和膜构造将引导待测试的液体样品沿着两个或更多个分开的流动路径。专门设计了一个流动路径(称为阳性对照试剂路径)来评估样品充足性和关键测试试剂的免疫反应性。其包含固定在该流动路径的下游部分中的硝酸纤维素上的一种或多种抗原，所述抗原与涂覆在经设计用以检测特异于该抗原或此类抗原的抗体的第二流动路径上的相同抗原是同一的。阳性对照试剂路径的上游部分包含干燥的可移动的单克隆或多克隆抗体或其它配体，其特异性结合下游测试抗原上待识别的表位(在其它流动路径(可在所述路径上就特异于该抗原的抗体的存在评估液体样品)中被识别的相同表位)。阳性对照试剂流动路径的上游部分还包含可移动的干燥的颗粒标志物，所述标志物当被固定时可识别并且结合可移动的干燥的单克隆或多克隆抗体或其它配体(其特异性识别下游测试抗原)。当在下游固定的测试抗原上流动和迁移时，颗粒标志物与固定的抗原的结合确认了 3个特征(1)抗原的免疫反应性，(2)单克隆或多克隆抗体针对特定抗原的免疫反应性，和(3)颗粒标志物的免疫反应性。阳性对照试剂路径还在更下游包含免疫球蛋白识别试剂，其特异性识别测试样品中的免疫球蛋白，如果所述免疫球蛋白以使得快速测试能够正确进行的充足量存在的话。在浓度上调整该试剂，以便其不结合充足的阳性对照抗体以允许被阳性对照试剂路径的可移动颗粒标志物视觉上可辨地结合，但如果呈递至测试装置的稀释样 品包含充足的免疫球蛋白(为充足的样品)的话，则将显示颗粒标志物的结合的可见条带。第二流动路径(和任何其它流动路径)被称为特定抗体流动路径，目的在于检测针对固定的目标抗原(分析物)的特定抗体。本发明提供的方法和装置的一个有利方面是，阳性对照试剂路径提供了一个或多个可观察的条带，每一个可观察的条带表示被识别的抗原具有反应性，以及如果特定抗体存在，则可预期在特定抗体路径中观察到针对该抗原的可比较的条带。每一条路径中使用的抗原是相同的，并且在每一条路径中使用相同的条件进行固定。同样地，阳性对照试剂路径中使用的颗粒标志物与检测针对特定抗原的抗体的路径中使用的颗粒标志物相同。当在特定的抗体路径中不存在条带时，这确保阴性结果不归因于抗原的失活或颗粒标志物的降解。该类型的对照与先前描述的对照(其中阳性对照是条带的不存在)相比，在直觉上更容易理解并且有助于正确使用和评估测试结果。本发明的阳性对照试剂路径也优于其中通过固定的单克隆抗体检测抗原的对照，因为该类型的对照要求抗原结合至颗粒标志物，这意味着其与测试中使用的天然抗原不同，或如果使用天然抗原，其必须在上游结合至单克隆抗体或其它配体(包含颗粒标志物)，因此其已进行了修饰，从而不能将其与用于检测特异于所述测试抗原的抗体的路径中使用的抗原直接比较。本发明的装置提供了两个或更多个分开的路径，用于导入待测试的流体。将确认关键试剂的反应性的阳性对照试剂路径与检测特异于目标抗原的抗体的不同路径分开，防止了不同对照和测试组分的干扰，当将阳性对照单克隆或多克隆抗体试剂组合入检测针对特定抗原的测试样品抗体的路径时，发生所述干扰。从装置内的收集稀释的液体样品的膜进入两个或更多个分开的路径，且最终进入每一条路径的下游末端处的吸收垫的流动方向防止了特定抗体检测路径被在阳性对照关键试剂路径中发现的试剂回流污染。本发明可以包括两个或更多个独立端口，一个允许将缓冲液添加至关键试剂阳性对照路径，一个或多个另外的端口用于接受待就特异于固定的目标抗原或分析物的抗体或配体进行测试的液体样品。这也在所涉及的发明中提供了方法来证实测试的关键试剂是完整的，同时就针对特定的目标抗原或分析物的抗体的存在或不存在评估测试结果。然而，为了使测试容易使用，本发明的优选实施方案能够将液体样品添加至单个位置，并且具有将液体样品从该单个位置导入两条或更多条路径以提供来自每一条路径的可观察的结果的装置，如本发明中所提供的。应当指出，本发明中描述的两条或更多条侧流路径不同于最早由Rosenstein等人(美国专利No. 4，855，240)且随后由Bernstein等人(美国专利No. 5，824，268)和Esfandiari (美国专利No. 7，189，522B2)描述的两条路径或双重路径。在这些美国专利的每一个中，在一条路径上运行颗粒示踪剂，并且在分开的路径上运行样品。相反地，在本发明中，样品和颗粒标志物都在每一条路径上运行。本发明包含测试样品充足性和关键试剂的免疫反应性的对照，然而这3个先前引用的专利不包括此类对照。还应认识到，Tung等人的标题为"Immunoassay Controls"的美国专利No. 6，627，459B1与本发明不同。其包括不与待检测的生物分析物交叉反应的阳性对照，然而本发明对于阳性对照使用相同的抗原，其用于检测特定分析物，并且两者都被同样地固定在硝酸纤维素上。这通过下列来实现将抗原阳性对照置于与检测特异于该抗原的抗体的路径分开的路径中，同时将待测试的样品导入每一条路径。这样，被固定并且被用作阳性 对照的抗原不干扰检测特异于该抗原的抗体的分开的路径中使用的相同抗原。同样地，因为在与用于检测特定抗体的路径中使用的相同抗原相同的条件下贮存阳性对照抗原，所以其与由Tung等人描述的非相同的、非交叉反应性的阳性对照相比，是更优的贮存条件(例如过热、过湿、对氧的暴露以及超过有效期的贮存)对免疫反应性的可能的不利影响的量度。本发明提供了定制拭子设计，其当与快速测试装置设计一起使用时，提供了一部分被龈缝液浸透的拭子膜的分离，随后按照Buchanan的方法(美国专利No. 7，364，914B2)取出龈缝液，同时将其稀释和递送至测试装置。该装置设计的简单性减少了用户出错的机会。通过将稀释的口腔液样品收集至膜中而非孔中，以及提供从稀释样品膜至阳性试剂对照路径和特定抗体路径的流体连通，在本发明中提供了关于下列的其它有利方面口腔液处理、毛细管流和测试完成的速度，以及避免溢出的保护作用。本发明还提供了适配快速测试装置并且允许从两滴全血中分离无细胞组分的经设计的插入物。可容易地将来自手指针刺或静脉穿刺的全血直接添加至插入物。通过插入物内的毛细管作用进行的迁移将处于迁移的前沿处的血液的无细胞组分与尾随的细胞组分分离。随后分离确定量的该无细胞部分，将其在测试装置内进行稀释，且将稀释的样品导入装置的流动路径以用于检测针对特定抗原的抗体。由于两个设计改变，本发明提供了可移动的颗粒标志物、特定抗体与此类抗体所针对的固定的抗原之间的更有利的相互作用。第一，当通过在测试装置中在压力下应用测试运行缓冲液将样品稀释并且从浸透的拭子或全血膜取出时，将其递送至稀释样品膜的中央。随着缓冲液到达膜的中央，稀释样品的浓度沿着膜从膜边缘的最高浓度变得越来越�。⑶易钪赵谙∈脱纺さ闹醒胛扪范鲇性诵谢撼逡�。本发明的快速测试设计将稀释样品膜的边缘与分开的路径(试剂阳性对照路径和特定抗体路径)的上游部分连接起来。第二，提供增加的灵敏度的本发明的测试设计对包含颗粒标志物的条带进行定向，以便其末端与在稀释样品膜边缘和每一条路径的上游部分之间的间隔重叠，但稀释样品膜的一侧部分重叠剩余的颗粒标志物膜的一侧。该定向导致，稀释的样品与颗粒标志物的初始相互作用与常规侧流测试相同。流经每一条路径的稀释样品将颗粒标志物推在其前面，其中的一些不与样品相互作用，并且流入吸附垫。标志物-样品相互作用的前沿部分包含过量的免疫球蛋白(相对于标志物)，这使得在许多抗体测试中稀释测试样品以产生可观察的结果成为必要。常规侧流免疫测定的接着发生的相互作用包含持续高水平的免疫球蛋白，而标志物不断减少，然后不存在。相反地，利用本发明的颗粒标志物垫的新型设计和定向的新方法在整个测试进展中提供标志物的持续供给。该革新，与给标志物提供一系列稀释度的免疫球蛋白的稀释样品膜一起产生了更有利的标志物-免疫球蛋白复合物，所述复合物产生可观察的结果。总之，这些更有利的特征导致，在稀释样品中检测目标配体的更高灵敏度。本发明的新一代设计还通过在长得多的测试时间过程中提供颗粒标志物至快速免疫测定测试的连续递送，增加了复合物(其能够产生可观察的颗粒标志物与固定的抗原的结合)的比例。已流经每一条路径并且在与标志物(对于常规侧流技术，所述标志物已丧失)复合之前结合抗原的抗体可被该新一代设计识别，所述新一代设计提供随后流经相同路径的标志物。通过在本发明的快速测试设计的不同时期使标志物过量或抗体过量的溶液连续地流过它们，产生太大以至于不能沿着测试装置路径顺畅地流过路径的复合物的标志 物-抗体结合的不利比率，也具有达到更有利的尺寸和流动条件的机会。最后，新一代测试设计提供了运行缓冲液，所述运行缓冲液在流体通过快速测试路径流动的最后阶段不包含抗体或颗粒标志物。该终运行缓冲液的清洗有助于从快速测试的读取窗除去未特异性结合至固定的抗原或配体的任何残留的颗粒标志物，从而提供了针对其易于读取测试结果的白色背景。本发明保持侧流免疫测定法的简单性，使得其易于使用和解释。在口腔液形式中，用户简单地利用提供的定制拭子拭抹牙龈缝隙边缘，然后将其放入其在测试装置中的精确位置。随后将稀释部分下推以原位锁定，分离一部分被口腔液浸透的拭子膜，将提供的包含运行缓冲液的小瓶的尖端插入稀释部分的顶部的开口，挤压以挤出液体，从而同时取出和稀释来自分离的膜的口腔液并将其递送入测试装置。随后在约10分钟内通过测试装置的窗口读取测试结果。在全血形式中，将收集全血的插入物置于测试装置盖的开口内(在口腔形式中接受拭子的精确位置中)。该插入物包含膜，所述膜在下述情况下将无细胞血液组分与细胞血液组分离将来自手指针刺或静脉穿刺的两滴血置于插入物的漏斗容器内，且允许其从接受区域至样品接受膜的相对端迁移4分钟。随后将稀释端口下推至锁定位置，如在口腔液测试中一样从提供的小瓶添加运行缓冲液，再过另外6分钟后，可在测试装置的读取窗观察结果。本发明包括提供大吸收垫(其吸收全部Iml的添加至测试装置的稀释样品液体)的设计改进。该大容量吸收垫，加上从试剂阳性对照路径和特定抗体路径的下游端连接至吸收垫的外流芯(outflow wick)的设计，和装置设计(所述装置设计包括在测试装置的盖中的叠压排气口区域，以帮助测试液体从吸收垫蒸发并且将从每一条路径的上游至下游部分的所有流动保持在测试装置内和最终进入吸收垫)，防止至读取窗内的回流，该回流可限制可在其范围内精确地读取测试结果的读取时间。测试装置的塑料组件和装置内膜的定向经设计与自动装配制造相容。下面参考
图13中所示的流动路径和索引数字，描述了本发明的代表性方法。在一个实施方案中，本发明提供了用于检测液体样品中的分析物的方法，包括(a)通过在膜的顶面和底面上沿着待分离的区域周缘施加压缩力，以界定与压缩周缘同心的膜的非压缩区域，从而分离包含至少一部分待分析的液体样品的一部分可压缩膜；(b)在压力下将液体稀释剂递送至膜的分离的部分，以从膜的分离的部分释放至少一部分液体样品，从而提供稀释的样品；(c)将稀释样品与具有第一末端和第二末端的第二多孔膜(8)接触，其中稀释样品流向第一和第二末端(FD2);(d)将稀释样品从第二多孔膜的第一末端引导至具有第一末端 和第二末端的第三多孔膜(上方的7)的第一末端，其中第三多孔膜包含结合分析物的可移动的标志物和可移动的分析物结合伴侣(例如，F240)，并且其中一旦稀释样品流至第三多孔膜的第二末端，稀释样品就还包含标志物和分析物结合伴侣；(e)将稀释样品从第二多孔膜(8)的第二末端引导至具有第一末端和第二末端的第四多孔膜(下方的7)的第一末端，其中第四多孔膜包含可移动的标志物，并且其中一旦稀释样品流至第四多孔膜的第二末端，稀释样品就还包含标志物；(f)将还包含标志物的稀释样品从第三孔膜的第二末端引导至具有第一末端和第二末端的第五多孔膜(9)的第一末端，其中第五多孔膜包括包含固定的分析物结合配体(例如，HIV抗原)的第一区域，其中随着包含标志物和可移动的分析物结合伴侣的稀释样品流向第五多孔膜的第二末端，所述固定的分析物结合配体有效结合可移动的分析物结合伴侣(和分析物，例如HIV抗体)，并且标志物有效结合可移动的分析物结合伴侣(和分析物)(结合至固定的配体)，从而提供了固定的结合伴侣、固定的分析物结合配体和标志物正在令人满意地运行的指示；和(g)将还包含标志物的稀释样品从第四多孔膜的第二末端引导至具有第一末端和第二末端的第六多孔膜(10)的第一末端，其中第六多孔膜包括包含固定的分析物结合配体的第一区域，其中随着包含标志物的稀释样品流向第五多孔膜的第二末端，所述固定的分析物结合配体有效结合分析物并且标志物有效结合分析物(结合至固定的配体)，从而提供了样品包含分析物(当分析物存在于样品中时)的指示。在一个实施方案中，该方法还包括将剩余的稀释样品从第五多孔膜的第二末端引导至具有第一和第二末端的第七多孔膜(上方的11)的第一末端，其中第七多孔膜从第二多孔膜(FD 3)吸取稀释样品；和将剩余的稀释样品从第六多孔膜的第二末端引导至具有第一和第二末端的第八多孔膜(下方的11)的第一末端，其中第八多孔膜从第二多孔膜吸取稀释样品。在一个实施方案中，第五多孔膜(9)还包括包含固定在其中(例如，在固定的配体的下游)的免疫球蛋白结合伴侣的第二区域，其中随着稀释样品流向第六多孔膜的第二区域，所述免疫球蛋白结合伴侣有效结合液体样品中的免疫球蛋白，并且其中可移动的标志物有效结合免疫球蛋白，从而提供了样品具有足以确认样品充足性的免疫球蛋白的指示。在一个实施方案中，第六多孔膜(10)还包括包含固定在其中(例如，在固定的配体的下游)的免疫球蛋白结合伴侣的第二区域，其中随着稀释样品流向第六多孔膜的第二末端，免疫球蛋白结合伴侣有效结合液体样品中的免疫球蛋白，并且其中可移动的标志物有效结合免疫球蛋白，从而提供了样品具有足以确认样品充足性的免疫球蛋白的指示。在一个实施方案中，将液体样品添加至可压缩的多孔膜以提供包含至少一部分液体样品的一部分可压缩膜。在一个实施方案中，将液体样品收集在可压缩的多孔膜上以提供包含至少一部分液体样品的一部分可压缩的膜。
在一个实施方案中，液体样品是全血。在一个实施方案中，液体样品是銀缝口腔液。
在一个实施方案中，分析物结合伴侣是抗原并且分析物是抗体。在一个实施方案中，分析物结合伴侣是抗体并且分析物是抗原。在一个实施方案中，分析物结合伴侣是HI V抗原并且分析物是HIV抗体。下面参考图13中所示的流动路径和索引数字，描述了本发明的代表性装置。在一个实施方案中，本发明提供了用于检测液体样品中的分析物的装置，其包括(a)用于接收液体样品的可压缩的多孔膜；(b)与可压缩的多孔膜的主表面相对相邻的第一和第二元件，其中第一和第二元件能够配合以在膜的上下表面上沿着待分离的区域的周缘施加压缩力，从而界定与压缩周缘同心的浸透的膜的非压缩区域；(c)适合接收第二流体的递送的端口，其中所述端口还适合于在压力下将第二流体递送至膜的分离的部分，以迫使至少一部分液体样品从膜的分离部分移出，以提供稀释样品；(d)用于接收来自可压缩膜的稀释的液体样品的第二多孔膜(8)，所述第二多孔
膜具有第一和第二末端；(e)包含有效结合分析物和可移动的抗原结合伴侣(例如，F240)的可移动的标志物的第三多孔膜(上方的7)，所述第三多孔膜具有第一末端和第二末端，其中第二多孔膜的第一末端与第三多孔膜的第一末端流体连通；(f)包含可移动的标志物的第四多孔膜(下方的7)，所述第四多孔膜具有第一末端和第二末端，其中第二多孔膜的第二末端与第四膜的第一末端流体连通；(g)包括包含固定的分析物结合配体(例如，HIV抗原)的第一区域的第五多孔膜
(9)，其中所述固定的分析物结合配体有效结合可移动的抗原结合伴侣(和分析物)，所述第五多孔膜具有第一末端和第二末端，其中第三多孔膜的第二末端与第五膜的第一末端流体连通；(h)包括包含固定的分析物结合配体(例如，HIV抗原)的第一区域的第六多孔膜
(10)，其中所述固定的分析物结合配体有效结合分析物，所述第六多孔膜具有第一末端和第二末端，其中第四多孔膜的第二末端与第六膜的第一末端流体连通。在一个实施方案中，装置还包括用于从第二多孔膜(FD3)吸取稀释样品的第七多孔膜(上方的U)，所述第七多孔膜具有第一末端和第二末端，其中第五多孔膜的第二末端与第七膜的第一末端流体连通；和从第二多孔膜(FD3)吸取稀释样品的第八多孔膜(下方的11)，所述第八多孔膜具有第一末端和第二末端，其中第六多孔膜的第二末端与第八膜的第一末端流体连通；在一个实施方案中，第五多孔膜还包括包含固定在其中(例如，在固定的配体下游)的免疫球蛋白结合伴侣的第二区域，其中随着稀释样品流向第五多孔膜的第二末端，免疫球蛋白结合伴侣有效结合液体样品中的免疫球蛋白，并且其中可移动的标志物有效结合免疫球蛋白，从而提供了样品具有足以确认样品充足性的免疫球蛋白的指示。在另一个实施方案中，第六多孔膜还包括包含固定在其中(例如，在固定的配体下游)的免疫球蛋白结合伴侣的第二区域，其中随着稀释样品流向第五多孔膜的第二末端，免疫球蛋白结合伴侣有效结合液体样品中的免疫球蛋白，并且其中可移动的标志物有效结合免疫球蛋白，从而提供了样品具有足以确认样品充足性的免疫球蛋白的指示。在一个实施方案中，第二多孔膜的第一末端与第三多孔膜的第一末端重叠。在一个实施方案中，第三多孔膜的第二末端与第五多孔膜的第一末端重叠。在一个实施方案中，第五多孔膜的第二末端与第七多孔膜的第一末端重叠。在一个实施方案中，第二多孔膜的第二末端与第四多孔膜的第一末端重叠。在一个实施方案中，第四多孔膜的第二末端与第六多孔膜的第一末端重叠。在一个实施方案中，第六多孔膜的第二末端与第八多孔膜的第一末端重叠。
附图概述当结合附图，参考下列详细描述时，本发明的上述方面和许多伴随的有利方面将变得更易于理解，且变得更好理解。图I是本发明的代表性装置的分解透视图，所述装置包括轭(yoke)⑴、样品稀释端口(2)、盖子(3)、用于收集口腔液并且适配装置的具有适当的吸收性织物和适当的尺寸的拭子(4)、o形环(5)、中片(mid-piece) ￠)、稀释样品膜(7)、包含颗粒标志物缀合物以及在对照泳道(control lane)的情况下结合所述缀合物并且识别下游抗原或抗体的试剂的两个或更多个膜(8)、一个或多个测试膜(9)、对照膜(10)、吸收垫膜(11)和底座(12)。图2A是样品稀释端口(2)的俯视图，图2B是样品稀释端口(2)的正视图，图2C样品稀释端口(2)的仰视图。图3A是通过其中央通道(36，图3A和10C)及其钩臂(hook arm) (32，图2B)的稀释端口(2，图I)的横断面视图，图3B是通过其钩臂(32)之一的稀释端口(2)的横断面视图。图3A的横截面的平面和视线方向通过在图2A中标记为A的虚线和箭头显示。图3B的横截面的平面和视线方向通过在图2A中标记为B的虚线和箭头表示。图4A是轭(I)的俯视图，图4B是轭(I)的正视图。轭具有将其保持在稀释端口内的臂表面(13)和当相向压紧臂表面(13)时允许其从稀释端口退出的手指拉环(fingertab) (14)。图5A是口腔液快速测试装置的盖子(3)的俯视图。其举例说明了观察测试(16)和对照(17)结果的窗口，测试和对照条带的蒸发端口(19)以及接收样品稀释端口的开口，其两个边缘包含突出脊(projecting ridge) (18),当其在压下和锁定位置时(参见图9A和9E)其紧密配合样品稀释端口的对应突出脊(35，图2B)。图5B和5C分别是盖子的正视图和透视图，其举例说明在进行口腔液快速测试的过程中用于包含待取样的口腔液的口腔液拭子的开口(20)。图6A是口腔液拭子的俯视图，虚线显示当将包含收集的口腔液的拭子置于用于其的装置开口(图5B，5C，和20)内时，拭子上待通过样品稀释端口(图10B和10C)取样的织物的区域(21)。图6B是口腔液拭子的右视图，其举例说明拭子在包含收集口腔液的织物的区域中逐渐变细。该逐渐变细提供了正确的尺寸，以允许在测试期间通过稀释端口压紧和分离拭子末端上的一部分织物，从而在装置中产生口腔液的稀释样品。图7A、7B和7C分别是口腔液中片的俯视图、透视图和正视图。图7A包括将中片定置在底座(图1，12)上的脊(24)、容纳O形环的凹陷(23)，以及允许稀释样品从中片的顶侧流至底侧的中央通道(25)。图7B和7C显示位于中片中的通道内的O形环(26，也见图1，5)和中片的底面上的通道(25)的突出的出口区域(27)。图8A、8B和8C是底座(图1，12)的俯视图、透视图和正视图。图8A举例说明稀释样品膜(8)、测试纤维素膜(9)、对照纤维素膜(10)和吸收垫(11)在底座内的布局。图SB举例说明底座内接收稀释端口的钩臂(图9C，32)的插孔(receptacles) (29)，所述钩臂通过插孔的开口 28 (图8A)进入插孔。图SC显示插孔中的窗口 30，一旦稀释端口被下推入插孔，稀释端口的钩臂就突入其中，直至钩臂(32，图2 ;32S，图9D和9E)在脊33 (图8B和9E)下锁定。钩臂突入插孔的窗口 30，将稀释端口原位锁定在4个分开的区域，每一个插孔的每一个窗口 30有一个突出钩臂进入。
图9进一步举例说明如何将稀释端口(2)插入底座(12)。图9A是原位具有稀释端口⑵和轭⑴的盖子⑶的俯视图。图9A中的虚线是产生图9D和9E的通过钩臂32 (图9C)之一的中间的横截面视图的平面，这些图的视线通过箭头举例说明。图9D显示处于向上未锁定位置(up-unlocked position)的钩臂相对于底座插孔的横截面，图9E显示底座插孔内处于向下锁定位置的钩臂。图9B举例说明轭(I)如何通过穿过开口(34，图2B和10B)阻止稀释端口(2)被下压至盖子开口中。其可通过将轭臂(13，图4B和13，图9B)相向推压同时提拉手指拉环(14，图4A)来移除。一旦移除轭，便可将稀释端口下压至底座插孔内的锁定位置，随后其顶部表面与盖子中用于稀释端口(图9C，2)的开口的上表面平齐。一旦与盖子平齐，稀释端口的长维度的边缘的底面上的脊(35，图2B)便覆盖盖子的邻接脊(18，图5A)。一旦稀释端口被锁定在底座中，这些便阻止了盖子的移除。图9D是钩臂在其底座插孔中处于向上位置的横截面左视图。钩臂(32S)位于底座插孔的上方脊(33S)的上方。图9E是钩臂在其底座中处于向下锁定的位置的横截面左视图。稀释端口至插孔内的锁定通过4个点(每一个钩臂两个点)实现，如通过现位于脊33S下方的钩臂32S举例说明的，一旦锁入位置，所述脊阻止稀释端口向上移回。图10举例说明在口腔龈缝液浸透后如何分离拭子织物的区域并且将其用于产生通过测试装置分析的稀释样品。图IOA是原位具有稀释端口的盖子的俯视图。虚线表示通过中央通道的顶部开口(31，图9A)的稀释端口的横截面视图的平面，观察图IOB和IOC的该平面中的横截面的位置的线由箭头和字母B及C显示。图IOB是处于向上未锁定位置的稀释端口的横截面，图IOC是处于向下锁定位置的稀释端口的横截面。图IOB显示稀释端口(3S)的开口(34)，将轭从该开口移除以使稀释端口能够被下压至装置中。图IOB横截面中的稀释端口的其它组件包括每一个钩臂(35S)的中央^(central stem)、稀释剂在被引入通过稀释端口的顶部开口(31，图IOB和9A)后通过的稀释端口的中央通道(36)，以及底座(12S)中接收稀释端口的钩臂的插孔(29S)。图IOB举例说明围绕其中央通道的稀释端口的壁的下表面(37S)的横截面，其与位于中片的通道内的0形环(5S)(图7A，通道23，和图7B，0形环5) —起分别在被口腔龈缝液浸透的拭子织物(图10B，21S)的顶面和底面上提供压缩力，以分离非压缩浸透的膜的区域。
图11是图IOC的放大。其显示拭子膜的压缩的横截面，且还举例说明稀释样品膜
(8S)相对于中片的位置。图11显示非压缩的拭子织物的分离区域(26)，其与通过O形环(图10B，5S)和稀释端口的下表面(图10B，37S)形成的压缩边缘同心。当在压力下以箭头的方向施加稀释剂流体通过通道36，图IOC时，其从非压缩的膜的分离区域(26S，图IOC和11)移出龈缝液的分离样品并且将其稀释。稀释样品从中片的底部流出，通过其底面上由底部突出(27S，图11)形成的通道，进入稀释样品膜(图11，8S和图1，8)，并且从此处芯吸至测试装置的其它膜上。图11也显示了口腔拭子的框架(38S)的横截面。其占据了收集口腔液的口腔拭子部分的边缘，留下可将稀释端口压入其中(图IOC和11)(以分离待用于测试的浸透的拭子织物的部分)的中央区域。图12举例说明测试装置的膜相对于中片的位置。图12A是仰视图，其显示颗粒标志物垫7相对于从中片的底部至中片的出口区域27 (图7C)的中央通道25的出口(图7A)的布局。图12B是仰视图，其显示颗粒标志物垫7与稀释样品膜8之间的重叠区域(虚线)。图12C是中片6的2X右视图，其显示稀释样品膜8至颗粒标志物垫的定向。当以流动方向I (FDl,图12C)将稀释剂在压力下引入通过与O形环5同心的分离膜26时，其从分离膜移 出样品，且稀释样品通过中片，从中片的底部流出，在中片的底部稀释样品与稀释样品膜8接触。从稀释样品膜8上的中央位置，其以流动方向2 (FD2，12C)向外流动，以与每一个流动路径的颗粒标志物垫7接触。图12D是装置的2X正视图，其显示稀释样品膜8与颗粒标志物垫7之间、颗粒标志物垫7与硝酸纤维素膜9或10之间，以及硝酸纤维素膜9或10与吸收垫11之间的重叠。稀释样品的流动方向3 (FD3，图12D)是从稀释样品8向上并且穿过颗粒标志物膜7，从颗粒标志物7向下进入硝酸纤维素膜9或10，穿过这些硝酸纤维素膜并且最终再次向上进入处于每一张硝酸纤维素膜的下游末端处的吸收垫11。图13进一步举例说明在使用装置检测口腔液中的特定抗体或分析物的过程中，运行缓冲液和稀释液体样品的流动方向。在该图中，中片和底座已被移除，只展示测试的膜，每一张膜以其正确定向放置，正如其存在于本申请的医疗装置内一样。样品膜(21)位于中片(未在本图中显示，参见6，图12)的顶部，并且在样品膜已被待测试的液体浸透后，按照美国专利7，364，914，B2, Buchanan分离该浸透的样品膜的界定区域(26)。浸透的膜的分离区域与通过压在膜底面上的中片内的O形环(5，图12)和压在膜顶面上的稀释端口的相对匹配的下表面(37，图2B和2C，和37S，图10B)形成的膜的挤压周缘同心。当在压力下将测试运行缓冲液递送通过稀释端口的中央通道(36，图10C)，通过包含样品的浸透的膜的分离部分(26S，图11)，通过中片内的通道25(图7A)和从位于分离膜之下的中片的下方开口(27S，图IOC和27，图12A，12D)流出时，发生流动方向I (FDl，图11、12和13)。样品从膜移出并且被稀释和滴在稀释样品膜(8，图1，8么，128-0，13，和85，图11)上。稀释样品进入稀释样品膜，开始了流动方向2 (FD2，图12C和13)，其将流体从该膜的中央部位转移至其边缘，这允许与位于中片的下表面上的颗粒标志物垫(7，图1，12A-D，13)接触，从而开始流动方向3。流动方向3 (FD 3，图12D和13)存在于两个或更多个流动路径中，一个通过盖子窗口 17 (图5A和9A)确认所有关键测试试剂的免疫反应性(结果示于膜10上(图1，8和13))，另一个或多个路径通过盖子窗口 16(图5A和9A)检测特定抗体(如果存在的话)并且还确认样品充足性(结果示于膜9上(图1、8和13))。流动方向3通过毛细管流动流体连通和膜的芯吸作用将稀释液体样品从每一条流动路径的上游部分转移至每一条流动路径的下游部分中，所述上游部分在颗粒标志物垫(7，图1，12A-D和13)上包含可移动的干燥试剂，所述下游部分由包含固定的抗原和额外试剂(以评估样品充足性和特定抗体检测流动路径中的样品充足性)的硝酸纤维素膜组成。每一条流动路径的终末下游部分是吸收垫，所述吸收垫收集所有过量的运行缓冲液以及稀释样品的任何未结合的组分和用于测试的移动的试剂。该垫子的吸收能力决定添加至稀释样品膜(8，图1，8A，12B-D, 13)的流体将终止于吸收垫并且总的测试流动方向为沿着稀释样品膜通向颗粒标志物垫至硝酸纤维素膜和最终抵达吸收垫的路径的上游至下游。图14显示测试装置盖子的俯视图。可利用本发明的快速侧流测试法和装置产生的结果示于图14A-14D中。这些结果的详细描述和解释见于实施例7中。图14A显示在试剂对照路径中在盖子的窗口 17中不存在证明颗粒标志物与固定的抗原的结合的条带。这表明关键测试试剂失效。在通过盖子的窗口 16观察到的特定抗体和样品充足性路径中不存在与抗原结合的条带，且在更下游存在条带，这表明测试的样品包含充足的用于评估的免疫球蛋白。
图14B显示在试剂对照路径中在盖子的窗口 17中存在证实颗粒标志物与固定的抗原的结合的条带。这表明关键测试试剂有效。测试样品充足性和测试针对特定抗原的抗体的路径中的窗口 16未显示与特定抗原结合的条带并且也未能在相同路径的更下游显示颗粒标志物与固定的I g结合剂rPA的结合。与固定的rPA的结合的不存在表明，测试的样品包含不足的用于评估的免疫球蛋白。图14C显示在试剂对照路径中在盖子的窗口 17中存在证实颗粒标志物与固定的抗原的结合的条带，并且还在盖子的窗口 16中显示在样品充足性路径的下游存在颗粒标志物与固定的I g结合试剂rPA结合的条带。这些条带表明，样品足以进行测试并且所有关键试剂都有效。通过盖子的窗口 16观察到，特定抗体和样品充足性路径中不存在颗粒标志物与抗原的结合的条带。图14D显示在试剂对照路径中在盖子的窗口 17中存在颗粒标志物结合固定的抗原的条带，并且还在盖子的窗口 16中显示在样品充足性路径中存在颗粒标志物结合固定在下游的Ig结合试剂rPA的条带。这些条带表明，样品足够用于进行测试并且所有关键试剂都是有效的。通过盖子的窗口 16观察到，特定抗体和样品充足性路径中存在颗粒标志物与抗原结合的条带。图15A是用于提供提高的测试灵敏度、更长的读取窗和不存在测试试剂的回流的改进的盖子装置设计的俯视图。其包括更大的用于稀释端口(2，图I)的开口(43)、增加的通气区域(39)(以加速测试运行缓冲液和稀释样品的蒸发)、逐渐变细的窗口(40和41)(以帮助读取和解释阳性试剂和样品充足性路径(窗口 40)以及特定抗体检测路径(窗口 41)的结果)和其中可放置用于测试装置条的保护性聚酯盖子的凹陷区域(42)，在所述条上可印制期望的标记以帮助鉴定和解释测试结果。图15B-15E举例说明可使用本发明的装置设计获得的代表性结果。在这些图中，试剂反应性和样品充足性途径的结果示于具有圆形边缘的窗口 40中，特定抗体检测结果示于矩形窗口 41中。图15B显示表示充足的免疫球蛋白存在于试剂阳性对照和样品充足性路径中的条带，但未显示颗粒标志物在固定的抗原上的条带。这表明固定的抗原，颗粒标志物或针对固定的目标抗原的上游可移动的单克隆抗体失效，且测试结果必须解释为无效。图15C显不在试剂阳性对照和样品充足性路径中存在颗粒标志物在固定的抗原上的条带，其表示抗原、颗粒标志物和针对固定的抗原的单克隆抗体具有免疫反应性。然而，不存在颗粒标志物在固定的重组蛋白A上的条带。这表明，所测试的样品包含不足以检测待测试的特异于固定的抗原的抗体(如果存在的话)的量的免疫球蛋白，并且测试结果必须解释为无效。图15D显示颗粒标志物结合在固定的重组蛋白A(44)和固定的抗原(45)上的条带，如通过与试剂阳性对照和样品充足性路径重叠的窗口读取的。这表明测试正确地运行，并且在特定抗体路径中在矩形窗口中颗粒标志物与固定抗原的结合的任何条带的不存在表明稀释样品不包含特异于固定的抗原的抗体，并且测试结果可正确地解释为阴性。图15E显示在试剂阳性对照和样品充足性路径中存在颗粒标志物结合在固定的重组蛋白A和固定的抗原上的条带。这表明测试正确地运行，并且在特定抗体路径中在矩形窗口中存在颗粒标志物与固定的抗原的结合的条带表明稀释样品包含特异于固定的抗 原的抗体，并且测试结果可正确地解释为阳性。图16A是改进的底座设计的俯视图，该设计提供了能够容纳可保留I. Iml液体的吸收垫(50，图16B)的大孔(67)。该大的吸收垫储液池确保，流体的流动方向是从进入每一条流动路径的上游点，向下游流过每一条流动路径并终止于该垫中，并且如实施例9中所述，阻止了垫内容物回流至测试装置的观察窗。在改进的底座中，用于稀释端口的最中央的底座插孔￠8)的间隔被移动3mm，更接近吸收垫孔(67)。这在稀释样品孔(48)的下游侧提供了 3mm的额外间隔(49)，其在稀释样品孔外部并且与其相邻，允许使用改进的颗粒标志物垫(55，图16B)，从而导致增加的测试灵敏度，如实施例10和11中所描述的。图16B是除桥接膜(bridging membrane)外,原位具有快速测试的膜的改进的底座设计的俯视图，所述桥接膜跨越对照(52)膜和测试(53)膜的硝酸纤维素条与颗粒标志物垫(55)之间的空隙(54)连接所述对照(52)膜和测试(53)膜的硝酸纤维素条，所述颗粒标志物垫(55)已被改进以以增加的灵敏度进行测试(如实施例10和11中所描述的)。颗粒标志物垫(55)主要位于邻近稀释样品膜(56)的塑料架上并且其上游边缘与稀释样品膜重叠1-2_。将稀释样品膜保持在底座中为其设计的孔(48，图16A)中。试剂阳性对照和样品充足性路径(52)和特定抗体路径(53)的硝酸纤维素膜在它们的下游与将硝酸纤维素条连接至吸收垫(50)的外流芯(outflow wick) (51)重叠。图16C与图16B相似，除了当将中片(60，图16D)置于装置内时，通过图16C和16D中的虚线59显示跨越上游稀释样品膜56与下游纤维素膜之间的空隙54(图16C)的桥接膜(7，图12)，以便如所显示的放置桥接膜(59，图16D)外。这些桥接膜，当在测试进行过程中被稀释样品湿润时，允许颗粒标志物垫55 (图16C)与对照路径52 (图16B)和特定抗体路径53(图16B)的硝酸纤维素膜之间流体连通。图16D显示原位具有图16C的中片60以及图16B的膜的图16A的改进的底座，桥接膜(虚线59，图16C和16D)连接至中片的下表面。图16D还显示了位于中片60的上表面的凹槽内的O形环23。如美国专利No. 7, 364, 914B2,Buchanan中所描述的，当通过o形环在其下表面以及通过稀释端口的底部在其上表面压缩膜时，该O形环帮助分离与O形环同心的浸透的样品膜的区域。
在如实施例5和6中所述在测试进行过程中在测试装置内产生稀释样品后，流体通过毛细管作用从上游稀释样品膜56至下游吸收垫50迁移通过膜，如由图16C的虚线58所显示的。图16B、C、E和F的虚线圆圈57显示稀释样品从其进入稀释样品膜的中片的下表面上的区域。图16E举例说明稀释样品移动进入两条流动路径的流动模式(虚线58)，每一条路径的颗粒标志物膜具有不同的尺寸和定向。流动路径52是样品充足性和阳性试剂反应性对照路径，并且在该例子中，颗粒标志物垫(68，图16E)具有常规尺寸和取向设计。用于该路径的常规颗粒标志物垫具有与下游路径膜的宽度相同的宽度。用于检测特定抗体的流动路径53(图16E)包含新一代颗粒标志物垫￠7，图16E)，该垫与沿着一边与稀释样品膜重叠并且允许更大浓度范围的样品与颗粒标志物相互作用，如实施例10和图16F中所解释的，并且还在测试结果显现过程中，在更长的时间段内，为进行中的侧流免疫测定提供颗粒标志物(实施例10)。总之，这些变化导致，快速免疫测定法与常规侧流快速测试设计相比，具有更高灵敏度(实施例11)。
图16F举例说明如何针对稀释样品膜(56，图16F)对本发明的颗粒标志物垫(67，图16F)进行定向，使它们略有重叠。通过本发明的装置获得的稀释样品浓度以下述范围保持在膜内从膜末端附近的最高浓度至分离样品从中片进入膜的进入点(57，图16B、D、E和F，和实施例10)附近的最低浓度。该重叠提供了相对恒定量的颗粒标志物来与范围从低至0-10%至高至85-100%的样品稀释物相互作用。在本发明的测试的进行过程中，进入下游流动路径的第一标志物-样品相互作用是具有最高浓度的样品的相互作用(图16F)。然后，以更高的标志物对样品的比与颗粒标志物一起温育的、浓度为最初进入下游路径的样品的40-70%的样品到达特定抗体流动路径的上端并且向下游迁移(图16F)。最后，具有最高的标志物对样品的比的组合(恒定标志物与浓度为最高浓度的10-40%的样品组合，参见实施例10)到达特定抗体流动路径的入口并且流过其下游组件。与利用本发明进行测试的不同浓度的样品对标志物相反，常规设计的颗粒标志物垫(68，图11F)仅与最高浓度的稀释样品(在最高浓度的70-100%的范围内)相互作用，并且此后随着其顺着流动路径(路径52，图16F)向下迁移，无颗粒标志物可用于与稀释样品相互作用。当将常规颗粒标志物垫(68，图11F)与本发明的颗粒标志物垫(67，图11F)相比较时发现，与常规线上颗粒标志物垫相比，利用新型设计和定向将颗粒标志物递送至测定进行的时间是3倍长(实施例10)。当与利用线上标志物垫的常规侧流免疫测定法相比较时，本发明中的颗粒标志物垫的新型设计和定向使检测特定抗体的灵敏度增强至5至10倍(实施例11)。图17显示用于测试装置的插入物的2D透视图，所述插入物使得测试装置能够用于测试来自静脉穿刺或手指针刺血液的全血(使用2滴血)。其精确地适配盖子的开口20 (图 5B 和 5C)。图17A是插入物的顶部的2D透视图，图17B是插入物的底部的2D透视图。被切成插入物底部的内缘的精确尺寸的膜例如LFl (GE Whatman, Florham Park, NJ, USA)位于平台62上，并且通过插入物的顶部与底部之间的挤压被原位保持在插入物内。当将2滴手指针刺或静脉穿刺全血直接加入测试装置插入物的漏斗样部分61 (图17A)时，血液流至LFl膜上，随后在4分钟的时段内迁移至膜的相对端，无细胞血清或血浆组分在更慢地迁移的细胞组分之前。随后可利用Buchanan (美国专利No. 7，364，914B2)的方法分离和稀释被全血样品的无细胞组分浸透的LFl膜的部分(66，图18)。图18显示在改进的盖子内原位装配的全血插入物。当将两滴全血引至LFl膜上的位置65处时，血液的无细胞部分在4分钟内迁移至位置66并且超过该位置。当将稀释端口下推并且锁定到位时，随后可在稀释端口的底面与中片的上表面中的O形环(图10C)之间分离被富含无细胞组分的全血浸透的LFl膜的区域。当随后在压力下通过稀释端口的开口施加运行缓冲液时，富含无细胞组分的全血被同时从浸透的LFl膜的分离部分移出和稀释，并且递送至稀释样品膜(56，图16C)，由此从一个末端向下游流入试剂阳性对照和样品充足性路径中的吸收垫，并且从另一个末端流入特定抗体路径，如由图16C的虚线58所说明的。发明详述下面的实施例3和表I中提供了本申请的方法和装置如何允许测定样品充足性的 详细描述。基本方法是发现能够提供免疫球蛋白在待测试的液体样品中的存在的定性指标的快速侧流免疫测定的条件，所述指标的不存在表示样品不足以用于检测特异于给定抗原的抗体，因为特定目标抗体为通过样品充足性测试检测的免疫球蛋白的亚级分。存在许多潜在的用户错误，其可能归因于测试包含不足量的免疫球蛋白的样品，并且检测该类型的错误的内部对照的不存在可能导致用户错误地得出测试结果是阴性的结论，而未认识到收集的样品不充足。例如，在口腔液测试中，用户不是从牙龈线处的龈缝收集口腔液，而可能是简单地将唾液收集在拭子上，或从颊粘膜内衬收集水分。或者，收集的位置可能是正确的，但时间不足，例如在牙銀线接合处(teeth-gum line junction)上方收集样品3秒而非30秒/次。这些错误可在拭子织物上产生具有少得多的免疫球蛋白(与正确收集的样品中存在的量相比)的流体。对于使用手指针刺或静脉穿刺血液的全血测试，测定的第一部分是沿着膜迁移血液，所述膜减缓细胞组分的迁移并且使血清或血浆的区域处于浸透的膜的前沿，随后利用稀释端口对O形环周缘压缩法，对该前沿取样以分离被血清或血衆浸透的膜的非压缩部分用于测试(参见Ahlstrom CytoSep或GE-WhatmanLFl膜，和美国专利No. 7，364，914B2)。该沿着血液样品收集膜的初始迁移需要4分钟来提供耗尽细胞组分的血清或血浆的前沿(其即可用于稀释和测试)。如果用户决定在仅等待3分钟或更短时间后将稀释端口下压进入锁定位置并且使运行缓冲液通过锁定的稀释端口以进行测试，则将会发生不充分的迁移，无法提供充足的样品。这可通过实施例3中描述的样品充足性对照法来检测，从而允许产生正确的解释所述测试是无效的。此类对照的不存在意味着，该类型的用户错误不能被检测到，并且测试结果可能被错误地解释为阴性，而不是解释为需要重复以获得答案的无效测试。在理论上，合理地预期表I中显示的许多组合可用于确认免疫球蛋白在测试样品中的存在。然而实际上，在本文中描述的条件下和对于常用于许多侧流免疫测定的膜，观察到评估的13个不同的组合中仅有一个在免疫球蛋白存在于测试样品中时产生条带，并且在测试不具有免疫球蛋白的样品稀释剂时不产生条带。即使当IgG不存在于测试样品中时，12个其它组合的每一个仍在其中IgG结合剂已被固定在硝酸纤维素上的测试条的最下游末端产生条带。该非特异性条带几乎等同于由包含免疫球蛋白的测试样品产生的条带。
来自这些实验的观察结果是，当与固定在硝酸纤维素下游的其它I g结合试剂接触时在大部分结合至胶体金的I g结合试剂之间发生非特异性结合(12个实例)。相反地，当将重组蛋白A(Repligen Corporation, Waltham, MA)固定在硝酸纤维素上时,其保持识别包含结合至蛋白L胶体金和蛋白G胶体金(BioAssay Works, Ijamsville, MD)的IgG的样品中的IgG的能力(当这两种胶体金试剂从上游至下游通过它时)，且当蛋白L胶体金与蛋白G胶体金在不包含IgG的运行缓冲液中迁移通过rPA (表I的第26行的Ig结合试剂)时，其不能非特异性结合蛋白L胶体金与蛋白G胶体金的混合物。当在无IgG的运行缓冲液中单独地迁移蛋白G或蛋白L胶体金制剂通过下游固定的rPA时，它们各自非特异性地结合下游固定的rPA。只有蛋白L胶体金与蛋白G胶体金两者的组合不能非特异性地结合低浓度的重组蛋白A以产生可视觉检测的条带。根据这些结果的假定是，蛋白G和蛋白L的胶体金制剂一起阻断了当胶体金蛋白G或胶体金蛋白L各自迁移通过固定的rPA时被固定的rPA识别的一些或大部分非特异性结合位点。快速诊断测试也可能无法产生精确的测试结果，如果检测针对特定抗原的抗体所需的关键试剂因在不利条件下贮存或超过贮藏期限有效期而变质的话。试剂失效可导致假 阴性结果。目前的测试不具有内部对照来测试该可能性。可能失效的两种最关键组分是(a)固定在硝酸纤维素上的抗原(其必须包含当特异于此类抗原的抗体通过时被所述抗体识别的完整抗原位点)和(b)结合至颗粒标志物的Ig结合试剂。如果待用于测试特定抗体的固定的抗原已变质，则特异于该抗原的抗体将在快速测定中仅仅迁移通过其。在无抗原完整性的对照的情况下，在固定的抗原的位置处条带的不存在可被错误地解释为阴性测试。类似地，如果结合至颗粒标志物的Ig结合试剂不具有免疫反应性，则不会产生条带来指示特定抗体的存在。此类颗粒标志物将不能识别测试样品中的结合至具有免疫反应性的固定的抗原的特定抗体，并且迁移通过。再次地，这潜在地可导致错误的解释在测试样品中不存在待测试的针对抗原的特定抗体。本发明提供了内部对照来确认关键的固定的抗原的免疫反应性和颗粒标志物-Ig结合复合物的免疫反应性，以及特异性识别待检测的特定抗体所针对的固定的抗原的第三关键试剂(单克隆抗体或多克隆抗体)的免疫反应性。这通过下列来实现具有致力于测试关键试剂的免疫反应性的路径(其与用于检测特异于给定的抗原的抗体的路径分开)，和使用同样地固定在特定抗体路径和关键试剂路径的下游部分上的相同抗原，以及使用以可移动的形式同样地干燥至两条路径的上游部分上的颗粒标志物垫上的相同的颗粒标志物-Ig结合试剂复合物。此外，关键试剂路径包含干燥至路径的上游部分上的一种或多种可移动的试剂，其结合固定在下游的一种或多种特定抗原。该试剂或此类试剂可以是特异性识别抗原(针对其的特定抗体将在分开的特定抗体和样品充足性路径中进行检测，并且也可被结合至颗粒标志物的Ig结合试剂识别)的单克隆或多克隆抗体或其它分子。优选地，当以可移动的形式干燥至关键试剂路径的上游部分时，该阳性对照抗体与固定的抗原相比，必须稳定一样长的时间或更长的时间，并且结合至Ig结合试剂的颗粒标志物与固定的抗原相比，也优选地必须稳定一样长的时间或更长的时间。更优选地，单克隆抗体或多克隆抗体将识别固定的抗原上的被待评估的测试样品中的抗体识别的相同特定抗原决定簇。使关键试剂路径与检测针对特定抗原的抗体的路径分开的有利方面是，如果它们存在于相同路径中，则识别抗原的对照抗体可干扰稀释的测试样品中的抗体对固定的抗原的检测。通过使用两个分开的路径，快速测试的流动方向(图13)阻止了来自关键试剂路径的阳性对照抗体对特定抗体路径的污染。实施例I提供了用于检测针对HIV的抗体的有效且稳定的肽-BSA缀合抗原的制备和使用的细节。实施例2提供了如何将两种单克隆抗体(一种针对线性表位，另一种针对HIV-I的gp41的相同区域中的构象表位)用于关键试剂阳性对照路径以确认用于检测针对HIV的人抗体的固定的肽-BSA缀合抗原的免疫反应性的细节(美国专利No. 5，260, 189，(Formoso,OlsenJP Buchanan)。其还提供了将多克隆血清抗体用作本发明中使用的方法和装置的阳性对照，用于针对人CRP的抗体的快速侧流免疫测定的具体实例。实施例3提供了关于评估12个试剂组合的细节和概述数据，所述12个试剂组合经证明不能用于确认免疫球蛋白在测试样品中的存在或不存在。其还描述了能够在本发明的方法和装置中使用的条件下区分包含人免疫球蛋白的样品与不包含免疫球蛋白的样品 的单个结合试剂组合的发现。实施例4提供了用于鉴定适用于收集龈缝口腔液样品的织物、用于从织物释放流体以及用于使用本发明的测试条和试剂鉴定稀释的龈缝液中的HIV特异性抗体的具体条件。实施例5提供了使用附图中描述的口腔液快速测试装置检测人口腔龈缝液中的针对HIV的抗体的具体细节。实施例6提供了使用本发明的一种全血快速测试装置检测手指针刺或静脉穿刺全血中的针对HIV的抗体的具体细节。实施例7和图14举例说明了使用本发明的快速测试平台获得的结果。显示了真阳性、真阴性和两个无效测试。一个无效测试因失活的关键试剂而为假阴性，另一个无效测试因测试样品包含不充足的免疫球蛋白而为假阴性。实施例8描述了这样的研究，其证明单克隆抗体F240具有足够的效力以至只需极小量即可结合足够的单克隆抗体，以允许被颗粒标志物蛋白G+L胶体金识别并且产生颗粒结合固定的HIV-I抗原的条带，使不充足的单克隆抗体迁移通过固定的抗原以被下游固定的重组蛋白A识别并且在下游位置产生颗粒标志物的条带。这允许所有对照(试剂反应性和样品充足性)被置于相同路径上并且简化测试结果的解释。实施例9和图16C-16E提供了位于测试装置的下游末端的大吸收垫槽和测试设计芯吸系统的具体细节，所述测试设计芯吸系统和大吸收垫槽允许在液体通过测试和对照条后捕获所有添加至测试装置的液体，并同时阻止测试试剂从吸收垫回流至测试和对照条。目前可获得的侧流测试具有有限的其中可以可靠地评估测试结果的读取窗，这至少部分归因于试剂从吸收垫回流至其中评估测试结果的区域。防止回流在本发明中可通过下列来实现能够吸收添加至测试装置的所有液体的吸收垫的尺寸，以及测试装置中在吸收垫上方定位的蒸发排气孔和将液体从测试及对照条的下游末端移动至吸收垫中的外流芯的位置。在添加至测试装置的所有液体都已流入吸收垫后，蒸发首先导致吸收垫表面和覆盖芯(overlying wick)(其连接测试条及对照条的下游末端与吸收垫)的干燥。在部分蒸发的吸收垫中剩余的任何液体保留在垫子的下面，不能回流至测试条和对照条(由于蒸发且需要穿过吸收垫的干燥表面和干燥的芯的下游末端)。通过使用该设计，在超过一周的观察过程中，未发生试剂从吸收垫至测试条或对照条的回流。实施例10解释了方法和设计创新的细节在于，与(b)在测试过程中允许一系列样品浓度与标志物相互作用的方法和设计组合的(a)本发明的颗粒标志物垫膜的尺寸和定向，如图16B、C、E和F中所举例说明的。实施例11提供了实验的细节，所述实验证实，与常规侧流免疫测定法相比较，实施例10中描述的创新一起为如实施例I和2中描述的已知量的特异于HIV-I抗原的单克隆抗体的检测(表2，实施例11)和从HIV阴性至阳性的血清转换的检测(表3，实施例11)提供增加的灵敏度。这些变化显示，通过使用本发明的方法和设计创新，灵敏度增加至约5至10倍。实施例12确认了充分稀释测试样品以不压倒可用于与免疫球蛋白组合的颗粒标志物的量的重要性。1:200或更大的人血清的稀释度显示对于使用本发明的方法和设计的快速测试中 可获得的颗粒标志物的量是最佳的(表4，实施例12)。图IlF举例说明，本发明的方法和设计如何使得免疫球蛋白能够与颗粒标志物相互作用，不仅以与常规侧流免疫测定相同的浓度而且还以1/10至1/100的量。在本发明的方法和设计中，与恒定量的颗粒标志物相互作用的免疫球蛋白的该10至100倍范围的可用浓度增加了允许最大灵敏度的最佳比率的机会。当比较用于将颗粒标志物递送至利用常规颗粒标志物垫(68，图16F)的进行中的免疫测定的时间段与用于将颗粒标志物递送至利用本发明的新设计的和定向的颗粒标志物垫(67，图16F)的进行中的免疫测定的时间段时，与常规侧流免疫测定相比，颗粒标志物在3倍长的时间内被递送至本发明的测定(表5，实施例12)。实施例13及图17A、17B和图18描述了以正确的定向精确地适配本发明的测试装置的盖子中的开口(当测试口腔样品时，可另外地放置拭子)的插入物的使用和设计，其可用于评估全血。其在其顶部包含漏斗样部分，该部分被设计用于接收两滴自由落下的全血，所述全血随后沿着插入物的膜迁移，以在下游针对无细胞组分富集全血的组分。4分钟后，将测试装置的稀释端口(2，图I)下推进入锁定位置，以分离被富含无细胞组分的全血浸透的膜的区域，随后按照美国专利No. 7，364，914B2,通过在压力下施加的稀释剂将富含无细胞组分的全血移出和稀释，然后将稀释样品通过中片下侧上的开口(图12)递送至处于区域57的稀释样品膜(图16B、C、E和F)，以流至图13和图16C、E和F中举例说明的路径，在所述路径中通过盖子的窗口读取结果，如图15B-15E中举例说明的。图15B-15E举例说明，通过图15的改进的盖子的测试结果窗口观察到的无效、真阳性和真阴性测试结果，如实施例5-7中一样进行测试，其中样品充足性重组蛋白A对照被固定在与试剂阳性对照路径相同的硝酸纤维素条的下游。用于收集和测试口腔液样品的方法和装置的使用如下使用图1-16中举例说明的本发明的口腔液收集装置通过使用提供的拭子(4，图4和图6A及6B)，用户沿着整个上下牙龈线上下摩擦拭子的一侧。随后将拭子插入测试装置的开口 20(图5)。随后在首先移去防止过早压下和锁定的轭(1，图I)后，将稀释端口 2(图1、2和3)下推入锁定位置(图9E、10C和11)。通过4个分开的接触点实现该锁定，稀释端口的两个钩臂(32，图2B)的每一个钩臂上具有两个接触点，其捕捉到用于稀释端口钩臂的底座插孔29的窗口 30(图8A-C)并且紧靠每一个窗口的上缘33 (图SB，和33S，图9E)，从而在压下和锁定后防止钩臂从装置退出。稀释端口的该锁定位置通过由O形环(5，图1、7B和7C，和5S，图11)在织物的下表面上产生的围绕分离的织物的一圈压力以及来自稀释端口的匹配下表面(37，图2C和37S，图11和12)的相对压力，分离已被口腔龈缝液浸透的一部分拭子织物。并且，一旦将稀释端口下压入锁定位置，测试装置的盖子就不能移除，因为被锁定在底座中的稀释端口(图2B)原位锁定的拭子(图6)阻止盖子移动至抵达稀释端口以将其解锁。该设计防止再使用测试装置的企图。将提供有已知量的运行缓冲液的小瓶或注射器插入稀释端口的开口 31(图9A)以形成防漏摩擦密闭(leak-proof friction fit),在压力下将缓冲液推出小瓶或注射器，向下通过稀释端口的中央通道36(图10C)，通过分离的浸透的膜，从而移出样品，所述样品穿过中片的通道25 (图7A)，以通过中片底面上的通道27 (图7C)流出，从而给稀释样品膜(8，图12B-12D和图13)提供稀释样品。在将口腔拭子插入装置和压下稀释端口后，直至完成来自提供的小瓶或注射器的运行缓冲液的递送，该整个过程只需不超过15秒。稀释样品以流动方向2 (FD2，图13)穿过稀释样品膜，然后由此以流动方向3 (FD3， 图13)通过测试的两个或更多个路径的上游和下游部分，以在普通情况下在10分钟内提供可读结果。试剂阳性对照和样品充足性路径的上游部分包含干燥的可移动的针对用于检测特定抗体的抗原的单克隆或多克隆抗体，所述单克隆或多克隆抗体位于该路径与颗粒标志物垫之间的桥接膜上，并且更上游还包含可移动的颗粒标志物例如结合至蛋白L和蛋白G的胶体金或磁性球，所述颗粒标志物识别移动的单克隆或多克隆抗体和人免疫球蛋白。由于单克隆或多克隆抗体被用运行缓冲液稀释的并且包含移动的颗粒标志物的样品推动，随着它们向固定的抗原迁移，一些抗体在颗粒标志物的前面迁移并且在与颗粒标志物相互作用之前结合至下游固定的抗原，而其它抗体则与颗粒标志物相互作用。在固定在硝酸纤维素膜或其它合适的膜(位于下游)上(在膜10上，图13)的抗原的位置处形成条带。该条带的形成确认了结合至蛋白L和蛋白G的颗粒标志物具有反应性，针对固定的抗原的单克隆或多克隆抗体具有反应性，以及该阳性试剂对照流动路径中的固定的抗原也具有免疫反应性。可在图15D的位置45上通过装置的盖子中的窗口 40(图15A)观察到该条带。该颗粒标志物条带在固定的抗原上的不存在可以因3种关键阳性对照路径试剂的任一种的失效而产生。无颗粒标志物结合抗原的该结果表示测试必须被用户解释为无效，从而防止潜在地报告因三种关键测试剂的任一种或多种的失效而产生的假阴性结果。在该相同路径的更下游，稀释样品中已与颗粒标志物复合的免疫球蛋白被重组蛋白A识别和结合(RepligenCorp.，Waltham, MA, USA，44，图15D)。条带在该位置处的不存在表示待测试的样品未包含充足的免疫球蛋白以允许检测针对特定的固定的抗原的抗体(如果它们存在于稀释样品中的话)。用于检测特定抗体的路径的上游部分包含一些干燥的可移动的与蛋白G和蛋白L复合的颗粒标志物，如在阳性对照试剂路径中发现的。该路径的下游部分包含在这样的条件下固定在硝酸纤维素或其它适当的膜上的相同位置的相同抗原，所述条件与用于将该抗原涂覆在阳性对照试剂和样品充足性路径的相同下游膜上的条件相同。下述观察结果在位置46(图15E)上通过盖子的窗口 41(图15A)未观察到颗粒标志物结合该路径中的固定的抗原的条带，但在试剂阳性对照和样品充足性路径中观察到相同颗粒标志物结合至抗原和重组蛋白A的明确条带，允许得出结论稀释测试样品对于特异于固定的抗原的抗体是真阴性的。在特定抗体路径中颗粒标志物结合固定的抗原的条带的存在以及在试剂阳性对照和样品充足性路径中固定的相同抗原上的条带和固定的重组蛋白A上的条带的存在，允许得出结论稀释的口腔液样品对于特异于固定的抗原的抗体是真阳性的。用于收集和测试全血■样品的方法和装置的使用如上文在关于口腔液测试装置的使用的部分中所述，本发明的方法的原理对于测试全血和口腔样品来说是相同的。差异见于测试装置。在新设计的用于测试来自手指针刺或静脉穿刺的全血的装置中，不是将包含口腔液的拭子插入盖子的开口(20)，而是将用于接收全血的插入物(图17A、17B和18)置于开口中。该插入物在其顶部包括漏斗样组件(图17A)。该漏斗的顶部较宽并且允许用户容易地将用手指针刺刺血针刺过的手指置于漏斗的上部，以便可将两滴自由落下的全血收集入漏斗，接触保持在插入物的顶部与底部(图17A和17B)之间的位置65(图18)上的血液接收膜。专门的血液接收膜(例如LF1，GE-ffhatman, Florham Park, NJ, USA)在膜下游的芯 吸前沿中将全血的血清或血浆部分与更慢地迁移的全血的细胞组分分离。全血通过毛细管作用从位置65(图18)朝向膜的另一端流动，以用无细胞血清或血浆浸透膜的位置66(图18)。将全血收集入测试装置的该方法帮助消除因不恰当地将血滴从被刺血针穿透的手指的部分转移至医疗装置而导致的测试失败。全血样品沿着膜迁移(以分离细胞组分与无细胞组分)花费4分钟，然后将被来自样品的血清或血浆浸透的膜的区域覆盖在装置的O形环上，所述O形环与稀释端口(当稀释端口被压下并且原位锁定时)组合，分离血清浸透的膜的区域以用于测试。用于全血收集装置的中片中的O形环具有比用于口腔液快速测试的O形环更小的尺寸(43，图16D)，并且与稀释端口组合以分离浸透的膜的区域，所述区域接近用于口腔液测试的浸透的膜的表面积的一半。与血清或血浆相比较，这部分地将龈缝液的浓度调整至大约1/4至1/6。容纳装有运行缓冲液的小瓶或注射器的稀释端口的顶部中的开口在用于测试全血的稀释端口和用于口腔液的稀释端口中具有相同的尺寸。全血测试装置的底座与口腔液测试装置的底座相同。获得每一个测试的可读测试结果的时间为10分钟。对于口腔液测试，在添加稀释缓冲液后该时间完全被迁移占用。对于全血测试，将无细胞组分与细胞组分分离的初始迁移需要4分钟，添加稀释运行缓冲液后的迁移需要另外6分钟来获得可读结果。两种测试在测试完成后数天至数周都未丧失它们的可读性(readabi I ity )。下列实施例意欲举例说明而非限制本发明的范围。
实施例实施例IHIV肽-BSA蛋白缀合抗原的免疫反应性将肽-BSA蛋白共价缀合物以250ug/ml总蛋白浓度(在含有0. 05%叠氮化钠的0. IN PBS，pH 8. 0 中)，以约 I. 5ul/cm 在硝酸纤维素(Hi-Flow Plus HF-120, MilliporeCorporation, Bedford, MA, USA)上划条纹(以约I. 5ul/cm),然后在真空下于35°C干燥10分钟，然后在无水硫酸干燥剂(Drierite Company, Xenia, OH, USA)存在的情况下进一步干燥并且于室温下贮存，所述肽-BSA蛋白共价缀合物包含具有在HIV-I的免疫显性部分中发现的序列，gp41的序列区域597-610的肽，如在美国专利No. 5, 260, 189 (Formoso,Olsen,和 Buchanan)以及 Dorn 等人(J. Clin Microbiology 38:2, pp. 773-780, 2000 年 2月)中描述的。随后使用单面聚酷胶带(ARcare 8160, Adhesives Research, Inc. , GlenRock, PA，USA)，将这些划条纹的硝酸纤维素条层迭(重叠以允许毛细流动)，在下游末端层迭至吸收垫(CF-4, GE-ffha tman, Florham Park, NJ, USA),且在上游末端层迭至芯吸玻璃膜(Grade 142, Ahlstrom Filtration, LLC, Mount Holly Springs, PA, USA)。将大约
0.250D单位的结合至40nm胶体金的蛋白A的颗粒缀合物(BA. PAG40, British BiocellInternational, Cardiff, UK)与Iml的用运行缓冲液以1:100稀释的正常人血清混合，所述运行缓冲液由 50mM P04(Spectrum Chemical Manufacturing Corp. , Gardena, CA,USA)、pH 7. 4 和 0. IN NaCl (Spectrum)、0. 05% 叠氮化钠(Spectrum)、0. 1% 牛血清白蛋白(无 IgG，无蛋白酶，Jackson Immunoresearch Labs, West Grove, PA, USA)以及 2%Tween20 (SigmaUltra, Sigma-Aldrich, Inc. , St. Louis, MO, USA)组成。如由 Rosenstein 等人在美国专利No. 4，855，240中所描述的，除了 BSA外，还添加糖例如蔗糖或海藻糖以提供2%至15%的浓度，从而在稀释血清存在的情况下使颗粒缀合物的凝集降至最低程度，并且减弱颗 粒缀合物与流动路径的层迭的膜之间的不想要的相互作用。包含针对HIV的抗体的稀释人血清在固定在层迭的测试条的硝酸纤维素部分上的HIV肽-BSA蛋白抗原的位置处，在白色背景下产生可见的红紫色条带，而对于不包含针对HIV的抗体的相似稀释人血清，未显现这样的条带。使用单克隆抗体进一步评估HIV肽-BSA缀合抗原的免疫反应性。经证实识别HIV的免疫显性抗原结构域(特别地，HIV-I的gp41的氨基酸序列区域597-617或592-606)的单克隆抗体，分别地单克隆抗体T32和F240,各自通过NIH AIDS Research and ReferenceReagent Program, Division of AIDS, NIAID, NIH 获得T32 单克隆抗体(Cat. No. 11391)获自 Dr. Patricia Earl,NIAID ;HIV_1 gp41 单克隆抗体(F240)获自 Dr. Marshall Posner和Dr. Lisa Cavacini0关于此类单克隆抗体的每一种的已公开的参考资料为T32_Earl等人，J. Virol. 71 (1997) : 2674-2684,和 Cavacini 等人，AIDS Res Hum Retroviruses14:1271-1280,1998。这两种单克隆抗体的重叠区域为序列区域597-606。该区域包含在HIV的广泛变异地域分离株间相对保守的序列CSGKLIC，并且该序列包含在美国专利No. 5, 260, 189 (Formoso, Olsen,和Buchanan)中描述的肽内。单克隆抗体T32识别该区域内的线性表位(参见Earl等人，J. Virol. 71 (1997) : 2674-2684)，单克隆抗体F240识别推测由肽序列￡SGKLI￡中的两个半胱氨酸之间的S-S键形成的构象表位(参见Cavacini等人，AIDS Res Hum Retroviruses 14:1271-1280,1998)。如美国专利No. 5，260, 189中所述，将包含序列CSGKLIC的HIV-1肽缀合至BSA，并且由 BritishBiocell International (BBI, Cardiff, UK)将该妝-BSA 缀合物定制地结合至40nm胶体金。通过以不同浓度的单克隆抗体(在含有0. 05%叠氮化钠的0. IN PBS,pH7. 4中)划条纹，然后在真空下在35°C下干燥15分钟，然后在无水硫酸钙干燥剂(DrieriteCompany,Xenia, OH,USA)存在的情况下进行室温干燥，将单克隆抗体F240和T32固定在硝酸纤维素 HF 120 (Millipore Corp.，Bedford, MA, USA)上。将定制结合的 HIV 肽-BSA 缀合物在含有0. 0025%叠氮化钠和15%海藻糖的2mM硼酸盐pH 7. I中稀释至2. 50D的浓度，将其涂覆在已用0. 0025%叠氮化钠(Spectrum Chemical, Gardena, CA),0. 1%牛血清白蛋白(Probumin, Diagnostic Grade, Celliance,Serologicals Corporation, Kankakee,IL,USA)预封闭的 S-14 缀合物垫(GE-Whatman, Florham Park, NJ, USA)上，将经涂覆的 S-14缀合物垫在真空下在37°C下干燥30分钟,然后在无水硫酸韩干燥剂(Drierite Company,Xenia, OH, USA)存在的情况下进行室温干燥。使用 ARcare 8160 (Adhesives Research,Inc.，Glen Rock, PA, USA)层迭评估条，将结合有单克隆抗体的硝酸纤维素在下游连接至吸收垫，并且在上游连接至包含BBI-制备的40nm胶体金HIV肽-BSA缀合抗原的缀合物垫(其在更上游与芯上游(Grade 142,Ahlstrom Filtration,LLC,Mount Holly Springs,PA,USA)重叠)。通过应用由 50mM P04 (Spectrum Chemical Manufacturing Corp. , Gardena,CA,USA),pH 7.4和0. IN NaCl (Spectrum)、0. 05%叠氮化钠(Spectrum)、0. 1%牛血清白蛋白(不含 IgG,不含蛋白酶，Jackson Tmmun ore search Labs,West Grove, PA, USA)以及 2%Tween20 (SigmaUltra, Sigma-Aldrich, Inc. , St. Louis, MO, USA)组成的运行缓冲液 PBSAAT 来评估这些测试条。将单克隆抗体T32和F240以不同浓度(在含有0. 05%叠氮化钠的0. IN PBS, pH7. 4中)固定在硝酸纤维素(HF 120)上，且如上所述进行干燥。当以400ug/ml的浓度划条纹时，单克隆抗体T 32产生与结合至40nM胶体金的HIV肽-BSA缀合抗原结合的微弱条带。对于以100ug/ml划条纹的F240单克隆抗体，获得与相同HIV肽-BSA缀合抗原结合的可比较的条带。用于快速测试的该类型的阳性对照的不利方面是，(a)H IV肽-BSA抗原与在用于检测特异于HIV的抗体的流动路径中使用的抗原不同，因为其已通过将其与胶体金结合的方法进行了修饰，和(b)该类型的阳性对照不能同时评估在用于检测特异于HIV的抗体的流动路径中使用的颗粒标志物的反应性。这些不利方面可通过将相同的天然HIV肽-BSA缀合抗原涂覆至两条流动路径中的硝酸纤维素来克服，只要单克隆抗体可被颗粒标志物识别。当将15微克的识别线性表位的单克隆抗体T32与0. 200. D.单位的40nm胶体金蛋白 G(BioAssay Works, LLC, Ijamsville, MD, USA)反应并且利用运行缓冲液 PBSAAT(上文中描述的)使其在测试条上向下游迁移时，所述抗体在硝酸纤维素层迭条上的固定的HIV肽-BSA蛋白抗原的位置处产生隐隐可见的条带。相比之下，当仅将10皮克抗体与相同胶体金蛋白G反应并且使其同等地在划条纹的层迭硝酸纤维素条上迁移时，F240单克隆抗体产生结合固定的HIV肽-BSA蛋白抗原的显著更强可见的条带。F240单克隆抗体的该1500倍或更大的效力表明，HIV肽-BSA蛋白抗原以环化形式存在，并且该抗原与人抗体的反应性与先前的报导一致，即，用于针对HIV感染的人免疫应答的优势表位是构象表位，推测为包含在本实施例中使用的HIV肽-BSA蛋白抗原内的S-S环表位。实施例2用于怏谏诊断测试以在试剂阳件对照流动路径中证实抗原完整件的以干燥状杰存在的单克隆或多克隆抗体以及HIV肽-BSA缀合抗原的稳定性的评估将实施例I中的用HIV肽-BSA缀合抗原划条纹的硝酸纤维素于室温下、10-30%的湿度水平下贮存，并且随时间针对F240单克隆抗体和包含抗HIV抗体的人血清进行测试。抗原在这些条件下保持其反应性超过I年。将2ug F240单克隆抗体点在以0. 250D单位/cm2涂覆蛋白G 40nm胶体金(BioAssay Works, LLC, Ijamsville, MD)的 0. 7cm x Icm 膜条上，使其在室温下干燥，随后在干燥剂不存在的情况下在室温下贮存13天。随后使用实施例I中描述的运行缓冲液，将该膜条的内容物在干燥至硝酸纤维素上的HIV肽-BSA缀合物上迁移。F240单克隆抗体和蛋白G胶体金产生显示与HIV肽-BSA缀合抗原的免疫反应性的强条带，从而确认了当在稳定剂存在的情况下干燥时，存在于涂覆的胶体金膜条中的F240单克隆抗体的稳定性程度。随后将F240 单克隆抗体在 0. IN PBSAA (0. IN P 04，pH 7. 4，具有 0.1 N NaCl,0. 01%BSA (Jackson Immunoresearch Labs,不含蛋白酶和 IgG)、0. 03% 叠氣化纳和 10% 海藻糖(FlukaBiochemika, Sigma-Aldrich Corp.，St. Louis, MO, USA))的溶液中稀释至7. 5ug/ml的浓度,然后将其涂覆于3种不同的膜S14 (GE-Whatman, FlorhamPark, NJ, USA)、8964(Ahlstrom, LLC, Mount Holly Springs, PA, USA)和 G041(Millipore Corporation,Bedford, MA, USA)上，在真空、45°C下干燥10分钟，随后在无水硫酸钙干燥剂(DrieriteCompany, Xenia, OH, USA)存在的情况进行室温干燥和随后忙存。此类稳定且干燥的F240单克隆抗体是稳定的，并且当在两个月的时期中重复测试时以及一年后再次重复时，在识别涂覆于硝酸纤维素的肽-BSA HIV抗原方面，显示效力未降低。
还评估了多克隆抗体在阳性对照途径中的应用。人CRP、山羊抗-人CRP和兔抗-人CRP 获自 CalBioreagents Inc. (San Mateo, CA, USA) 将人 CRP 以 lOOug/ml (在含有0. 005%BSA和20mM叠氮化钠的20mM Tris缓冲盐溶液pH 8. 2中)涂覆于硝酸纤维素。装配测试条以允许单独的运行缓冲液、以1:100稀释于运行缓冲液中的正常人血清或包含55ug/ml的山羊抗-人CRP或30ug/ml兔抗-人CRP的运行缓冲液运行通过可移动的蛋白G40nm金(BioAssay Works),随后通过固定的人CRP。在颗粒标志物与包含山羊或兔抗-人CRP的溶液之间观察到结合的强条带，但对于正常稀释的人血清或单独的运行缓冲液无结合发生。这证明，多克隆抗体也可用于识别在快速流动测试阳性对照下游的已知抗原。预期与用于F240MAb的条件相似的条件允许这些多克隆抗体以稳定的可移动的条件干燥，且具有足够的贮存期以并入快速侧流测试，用作阳性对照。实施例3确定稀释样品中是否存在足够量的免疫球蛋白以允许检测针对目标抗原或分析物的特定抗体(如果存在的话)的方法的开发针对特定抗原或其它配体的抗体的目前可用的快速测试都未包含用于确定是否存在足够量的免疫球蛋白以允许检测特定抗体(如果存在的话)的对照。这是重要的疏忽，因为如果不充足的血液被引入测试，手指针刺或静脉穿刺全血的测试可能为假阴性，以及如果未正确地收集口腔拭子液样品，口腔龈缝液的样品就可能缺乏充足的免疫球蛋白以允许精确地检测特定的抗-HIV抗体。使用不同的免疫球蛋白检测试剂(一种或多种结合至颗粒标志物，另一种固定在用于检测特定抗体的流动路径的测试窗口的下游末端)进行实验，以确定是否可鉴定一组免疫球蛋白结合试剂，其在正确浓度下，仅当稀释样品中的免疫球蛋白浓度足以允许检测针对特定抗原的抗体(如果存在的话)时，才可通过在最下游固定的免疫球蛋白检测试剂显示颗粒标志物的结合。评估的组合示于表I中。令人惊讶地，在13个测试的组合中，仅有蛋白L和蛋白G胶体金的组合，在与包含或未包含免疫球蛋白的样品反应时，能够正确地鉴别免疫球蛋白的存在。该组合，当与单克隆抗体F240或与用运行缓冲液稀释的人血清反应时，产生对下游rPA的结合，但当在免疫球蛋白不存在的情况下仅用运行缓冲液稀释时，不结合下游固定的rPA(表I)。用于将重组蛋白A涂覆于硝酸纤维素的条件为,包含0. 01%BSA (Jackson Immunoresearch,不含IgG和蛋白酶)和0. 05%叠氮化钠的0. IN PBS，pH 7. 4。用于在这些测定条件下进行rPA涂覆的 最佳浓度为I至5微克/ml。在这些条件下，快速测定可正确地鉴别测试样品是否包含足够量的免疫球蛋白(从而如果针对该抗原的特定抗体存在，则能够显示颗粒标志物与固定抗原的结合的条带)，和检测到在包含足够的免疫球蛋白方面不足的样品。将该组合在本文中描述的装置中用于随后的实验以确定测试样品的充足性。
权利要求
1.用于检测液体样品中的分析物和检查方法试剂的反应性的方法，包括 (a)通过在膜的顶面和底面上沿着待分离的区域周缘施加压缩力，以界定与非压缩周缘同心的膜的非压缩区域，从而分离包含至少一部分待分析的液体样品的一部分可压缩膜； (b)在压力下将预定量的液体稀释剂递送至膜的分离的部分，以从膜的分离的部分释放至少一部分液体样品，从而提供稀释的样品； (C)将稀释的样品与具有第一和第二末端的第二多孔膜接触，其中稀释的样品流向第一和第二末端； (d)将稀释的样品从第二多孔膜的一个部分引导入第一流动路径，所述第一流动路径提供从第二多孔膜上游至吸收垫下游的流动，其中所述流动路径包括多孔膜和评估试剂反应性的试剂，按流动顺序包含(i)包含针对待检测的分析物的种类的可移动的标志物的膜，(ii)包含特异于下游固定的配体的可移动的结合伴侣的桥接膜，所述配体用于检测稀释的样品中的目标分析物，所述可移动的结合伴侣能够被可移动的标志物识别，(iii)包含针对目标分析物的固定的配体的膜，和(iv)与用于固定的配体的膜直接流体连通或经外流芯膜与之连接的吸收垫； (e)将来自第二多孔膜的不同部分的稀释的样品引导入第二流动路径，所述路径提供从第二多孔膜上游至吸收垫下游的流动并且包括多孔膜和用于检测特定目标分析物的试齐U，按流动顺序包含(i)包含可移动的标志物的膜，(ii)连接可移动的标志物膜与包含用于检测特定目标分析物的固定的配体的膜的桥接膜，和(iii)与用于固定的配体的膜直接流体连通或经外流芯膜与之连接的吸收垫； (f)观察液体样品通过第一流动路径的迁移的结果，所述第一流动路径包括在针对目标分析物的固定的配体的位置处的标志物的可观察的条带，其允许确认标志物具有反应性并且能够结合待检测的分析物的种类，确认固定的配体具有反应性并且能够结合待通过测试检测的特定分析物，和确认特异于固定的配体的可移动的结合伴侣也具有反应性，从而表明该测试能够检测稀释的样品中的目标分析物，如果其存在的话； (g)观察液体样品通过第二流动路径的迁移的结果，所述第二流动路径包括在针对目标分析物的固定的配体的位置处的标志物的可观察的条带，其允许确认目标分析物存在于稀释的样品中，如果存在的话，或者如果目标分析物不存在于稀释的样品中，则在第二流动路径中的固定的配体的位置处不存在标志物的可观察的条带；和 (h)如果没有标志物条带存在于第一流动路径的固定的配体部分，则观察到，所述测试方法不能得出有效解释。
2.权利要求I的方法，其中将固定的重组蛋白A在流动路径之一上固定在固定的抗原的下游，并且用于评估在稀释的测试样品中是否存在充足的免疫球蛋白，以允许检测稀释的测试样品中的特异于该抗原的抗体。
3.权利要求I或2的方法，其中可移动的标志物选自蛋白G、蛋白L和蛋白A，其各自结合至一个或多个可观察的组分，所述组分选自胶体金、磁性球和荧光标志物。
4.权利要求1-3的任一项的方法，其中可移动的标志物为结合至胶体金的蛋白G和蛋白L。
5.权利要求1-4的任一项的方法，其中包含可移动的标志物的膜在50%或更多的测定完成所需的总时间段中，将标志物递送至显现测定的特定分析物检测流动路径部分。
6.权利要求1-5的任一项的方法，其中包含可移动的标志物的膜在超过75%的测定完成所需的总时间段中，将标志物递送至显现测定的特定分析物检测流动路径部分。
7.权利要求1-6的任一项的方法，其中将稀释的样品的多孔膜与可移动的标志物的膜对齐，以提供与一系列稀释度的稀释的样品混合的标志物，所述一系列稀释度是从稀释的样品的最高浓度至仅包含20%或更少的最高浓度的稀释样品的稀释度。
8.权利要求1-7的任一项的方法，其中液体样品是来自哺乳动物的生物样品。
9.权利要求1-8的任一项的方法，其中液体样品是来自非哺乳动物的生物样品。
10.权利要求1-9的任一项的方法，其中液体样品是全血或其级分。
11.权利要求1-9的任一项的方法，其中液体样品是龈缝口腔液。
12.权利要求1-11的任一项的方法，其中分析物结合配体是抗原并且分析物是抗体。
13.权利要求1-12的任一项的方法，其中分析物结合配体是抗体并且分析物是抗原。
14.权利要求1-13的任一项的方法，其中分析物是针对HIV的抗体并且分析物结合配体是HIV抗原。
15.权利要求1-14的任一项的方法，其中样品稀释剂包含为分析物与其结合伴侣之间的有效反应提供有利的PH和离子条件的流体，并且包含添加的蛋白质和去垢剂，以促进试剂沿着分开的流动路径迁移而无非特异性的组分粘附。
16.一种用于检测液体样品中的分析物和检查用于检测分析物的试剂的反应性的装置，包括 (a)用于接收液体样品的可压缩的多孔膜； (b)与可压缩的多孔膜的主表面相对相邻的第一和第二元件，其中第一和第二元件能够配合以在膜的上下表面上沿着待分离的区域的周缘施加压缩力，从而界定与非压缩周缘同心的包含至少一部分待分析的液体样品的膜的非压缩区域； (c)适合接收第二流体的递送的端口，其中所述端口还适合于在压力下将第二流体递送至膜的分离部分的上表面，以迫使至少一部分液体样品从多孔样品接收膜的分离部分移出； (d)从分离的膜的底面收集稀释的液体样品的通道； (e)用于接收来自分离的可压缩的样品膜的稀释的样品的第二多孔膜，所述第二多孔膜具有第一和第二末端，并且其中稀释的样品从施用点迁移至第二多孔膜的每一个末端； (f)用于评估试剂反应性的流动路径，所述路径将稀释的样品从稀释样品多孔膜的一个部分递送通过相继包含如下组分的多孔膜可移动的标志物、特异于与目标分析物反应的固定的下游配体的可移动的结合伴侣、针对目标分析物的固定的配体、和置于装置的预定位置处的吸收垫膜；和 (g)用于检测特定分析物的第二流动路径，所述路径将稀释的样品从稀释样品多孔膜的其它部分递送通过相继包含如下组分的多孔膜可移动的标志物、针对目标分析物的固定的结合配体和保持在装置的确定位置内的吸收垫膜。
17.权利要求16的装置，其中用于收集全血或其级分的可压缩多孔膜是具有低蛋白质结合的亲水玻璃膜，其在侧向迁移过程中延迟全血的细胞组分通过膜，从而与非细胞组分分离。
18.权利要求16的装置，其还包括插入物，所述插入物用于包括可压缩多孔膜，所述可压缩多孔膜经定位以在一个末端收集全血，允许沿着膜自由迁移至在插入物的相反末端上提供的开口，并且当将插入物置于装置中时，允许通过该开口压缩膜的周环，以提供全血的富含无细胞组分至测试装置的分离、移出和递送。
19.权利要求16的装置，其中用于龈缝口腔液或其它口腔液的可压缩多孔膜是亲水性膜，其被口腔液浸透，经超声焊接成围绕拭子的紧密配合，用于收集口腔液，和将口腔液样品释放至装置内而仅有最少的蛋白质损失。
20.权利要求16的装置，其中拭子在其口腔液收集末端被膜围绕，适配至装置的盖子中的开口内，并且具有允许压缩膜的周环从而允许将稀释的口腔液分离、移出和递送至测试装置的开口。
21.权利要求16的装置，其中多孔稀释样品膜包含亲水大孔玻璃膜，其具有充足的PVA或其它粘合剂，以阻止小玻璃颗粒从膜迁移至从其起源的试剂反应性和特定抗体流动路径。
22.权利要求16的装置，其中两条流动路径的与稀释样品膜重叠的标志物膜包含亲水大孔玻璃膜或被修饰为亲水性的聚酯膜，以便当将标志物复合物在蔗糖或其它糖存在的情况下干燥至膜上，和用液体样品稀释剂从干燥状态动员时，标志物复合物至膜的粘附和膜对可移动的标志物复合物的流动的限制减小至最低限度，所述液体样品稀释剂以最小粘附促进试剂沿着流动路径迁移。
23.权利要求16的装置，其中提供从上游标志物膜至下游固定的配体的膜的流体连通的两条流动路径的桥接膜包含具有最小蛋白结合的大孔玻璃。
24.权利要求23的装置膜，其包含以可移动状态干燥的、特异于下游固定的配体的结合伴侣，当用于试剂反应性流动路径时。
25.权利要求23的装置膜，其不包含特异于下游固定的配体的分析物，当用于特定抗体检测流动路径时。
26.权利要求16的装置，其中包含在两条路径中鉴定特定分析物的固定的配体的膜包含位于桥接膜的下游且位于至吸收垫的连接的上游的膜，其提供了蛋白质的固定。
27.权利要求16的装置，其中装置内包含的纤维素吸收垫或在下游吸收垫与上游配体 固定膜之间的芯吸膜提供了稀释的流体样品从配体固定膜的下游末端至吸收垫的转移。
28.权利要求16的装置，还包括开口，通过所述开口，可观察到标志物与固定在两条流动路径的配体结合膜上的配体的结合或无结合的结果。
29.一种用于检测全血或其组分中的针对HIV的抗体的试剂盒，包括 (a)用于获得手指针刺血液的刺血针； (b)收集血滴的插入物； (c)权利要求16-28的任一项的装置；和 (d)在压力下递送预定量的样品稀释剂通过装置的端口的小瓶或注射器。
30.一种用于检测龈缝口腔液中的针对HIV的抗体的试剂盒，包括 (a)用于将样品收集至用于摩擦牙龈线的拭子部分上的样品接收膜上的拭子； (b)权利要求16-28的任一项的装置；和 (c)递送预定量的样品稀释剂通过装置的端口的小瓶或注射器。
全文摘要
用于快速侧流免疫测定的方法和装置，其用于检测液体样品中的特定抗体，同时还验证液体样品的充足性(就免疫球蛋白的存在)以及检测目标抗体的测试试剂的完整性和免疫反应性，而无需仪器。所述方法和装置提供了稀释的液体样品至单个位置的递送，所述递送同时指导液体沿着两条或多条独立的流动路径流动，一条路径用作阳性对照以确认测试的所有关键试剂具有免疫反应性并且待测试的样品是充足的，另一条路径用于检测特定抗体，如果存在的话。
文档编号G01N33/569GK102782495SQ201080060401
公开日2012年11月14日 申请日期2010年11月4日 优先权日2009年11月4日
发明者托马斯·M·布坎南 申请人:托马斯·M·布坎南
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