专利名称：高流通量分子转子黏度测定法测定的制作方法
技术领域：
本组合物和方法涉及实时测定悬液中黏度变化的速率。该组合物和方法具有广泛的应用，包括測量淀粉酶介导的淀粉悬液的液化。
背景技术：
旋转黏度计是实验室中用于评估a-淀粉酶的淀粉液化性能的标准工具。但是，获得旋转黏度计数据的过程缓慢，且需要大量的酶，使得旋转黏度计测定不适于用作エ业 蛋白质工程的主要筛选方法。备选的直接測量黏度变化的小规模测定常给出错误或不可预测的结果，也使得它们不适于用作主要筛选方法。因此，存在对更方便、更准确和更可重复的黏度測定的需要。
发明概述所描述的是用于实时测定悬液黏度变化的高流通量分子转子(molecular rotor)黏度测定法測定。该方法一般涉及将分子转子加至包含能够转化为产物的底物的悬液，其中底物向产物的转化改变了悬液的黏度；将酶或化学催化剂加至悬液以起始底物向产物的转化；和測量分子转子的荧光(RFU);其中可以使分子转子的荧光变化与悬液的黏度变化相关。此黏度变化可以进一歩用于测定黏度变化的速率、底物向产物转化的速率、转化为产物的底物的量等。在一方面，提供用于实时测定悬液黏度变化的方法，其包括向包含底物的悬液加入分子转子分子，和能够将底物转化为产物的酶或化学催化剂，该底物能够转化为产物，该分子转子分子的荧光量子产率依赖于悬液自由体积；和实时测量悬液中分子转子分子的荧光；其中底物向产物的转化改变了通过测量分子转子分子的荧光测定的悬液自由体积，且其中悬液自由体积的变化与溶液黏度的变化相关。在一些实施方案中，用悬液黏度的变化来測定底物向产物转化的速率。在ー些实施方案中，用悬液黏度的变化来测定转化为产物的底物的量。在一些实施方案中，该悬液是淀粉悬液。在一些实施方案中，该悬液是玉米支链淀粉悬液。在其他实施方案中，该悬液是纤维素悬液，或混合的淀粉和纤维素悬液。在一些实施方案中，该酶是糖类加工酶。在一些实施方案中，该酶是淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶或其组合。在具体实施方案中，该酶是淀粉酶。在一些实施方案中，底物向产物的转化是淀粉酶介导的产生低分子量葡聚糖的淀粉悬液的液化。在一些实施方案中，该分子转子分子是9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)-久洛尼定(CCVJ)。
在一些实施方案中，以多孔形式进行该方法。在具体实施方案中，以6孔、12孔、24孔或96孔形式进行该方法。组合物和方法的这些和其他方面及实施方案将由于描述和附图
而显而易见。
附图简述图I显示淀粉水解反应中分子转子荧光(RFU)的减少作为时间(秒)的函数的曲线。突光减少与淀粉水解引起的悬液黏度减小相关。图2显示用常规旋转黏度计测定获得的峰值黏度数据，其确认了用分子转子黏度 测定法测定获得的结果。
发明详述
I.定义在详细描述本组合物和方法之前，为了清楚而定义以下术语和短语。应赋予未定义的术语和短语它们在本领域中使用的普通含义。本文中使用的“分子转子分子”或简单的“分子转子”是荧光化学实体，其荧光量子产率(即发射的光子数除以吸收的光子数)依赖于其微环境，例如悬液中的自由体积。本文中使用的术语“实时”指在事件发生时对它进行测量。本文中使用的术语“淀粉”指包含具有通式(C6HltlO5)n的多糖的物质，其中多糖的糖取代基主要通过a -D-(I — 4)和/或a -D-(I — 6)糖苷键连接。本文中使用的术语“纤维素”指包含具有通式(C6HltlO5)n的多糖的物质，其中多糖的糖取代基主要通过β -D-(I — 4)糖苷键连接。本文中使用的术语“糖类加工酶”指能够水解存在于淀粉和/或纤维素组合物中的至少一种成分的任意酶。示例性酶包含淀粉酶、葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、纤维素酶、半纤维素酶及其组合。本文中使用的术语“淀粉酶”或“淀粉分解酶”指能够催化淀粉的降解等的酶。淀粉酶是切割淀粉中a -D-(I — 4) O-糖苷键的水解酶。一般而言，α -淀粉酶(EC 3. 2. I. I ；a-D-(I— 4)-葡聚糖葡聚糖水解酶)定义为以随机方式切割淀粉分子内a-D-(l —4)O-糖苷键的内切酶。相反，外切淀粉分解酶，如β-淀粉酶(EC 3. 2. 1.2 ;a-D-(l —4)-葡聚糖麦芽糖水解酶)和一些产物特异性淀粉酶，如产麦芽糖a -淀粉酶(EC 3. 2. I. 133)从底物的非还原端切割淀粉分子。β -淀粉酶、a -葡糖苷酶(EC 3. 2. 1.20 ； a -D-葡糖苷葡糖水解酶)、葡糖淀粉酶(EC 3.2. 1.3 ；a -D-(I — 4)-葡聚糖葡糖水解酶)和产物特异性淀粉酶可以从淀粉产生特定长度的麦芽糖寡糖。本文中使用的术语“纤维素酶”或“纤维素分解酶”指能够将纤维素聚合物水解为较短的纤维寡糖寡聚物、纤维二糖和/或葡萄糖的一类酶。本文中使用的术语“多孔形式”指涉及常见固相支持体，例如6孔板、12孔板、24孔板或96孔板上的样品矩阵的测定排列。除非另有说明，冠词“一”、“一个”和“该”指单数指代物和复数指代物二者。本文中引用的所有参考文献在此以其整体引入作为参考。
II.高流通量分子转子黏度测定法测定用市售分子转子研发了高流通量分子转子黏度测定法测定来监测淀粉底物的液化。一般而言，分子转子是荧光种类，其量子产率(即发射的光子数除以吸收的光子数)依赖于与微环境黏度相关的微环境自由体积。对于这类分子，从激发态弛豫的优选方式是分子内旋转，分子内旋转以与微环境黏度成比例的量受抑制。能量平衡通过可以测量的辐射弛豫(荧光发射)逸散，从而允许计算微环境黏度。为了测量由对底物的酶活性引起的黏度降低的速率，将分子转子CCVJ(9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)久洛尼定)掺入玉米支链淀粉的缓冲悬液，然后将其分配至96孔板的孔。然后将一定量的许多a -淀粉酶多肽之一加至含有CCVJ/玉米支链淀粉悬液的不同孔，以起始酶促淀粉水解反应。在室温下在以动态模式运行的Spectramax M2 96孔突光计中进行反应，实时进行数据收集。測定中使用的试剂的配制和实验方案描述于实施例中。通过测量来自CCVJ的荧光信号的降低速率来測定由酶促淀粉水解引起的黏度降低速率。Spectramax仪器的配套软件Softmax Pro自动将突光信号降低的动态速率计算为“Vmax (毫单位/分钟)”。图I中显示了涉及酶介导的荧光(黏度)降低的原始动力学数据对时间的曲线。荧光(RFU，y轴)减少的速率与淀粉酶介导的黏度降低的速率成比例。就淀粉水解活性而言，更低的值指示更好的性能。27个变体a-淀粉酶在分子转子測定中显示优于野生型酶的性能。 为了确定分子转子測定的结果是否准确反映了变体a -淀粉酶的淀粉水解活性，用常规旋转黏度计測定评价了相同的变体a-淀粉酶。显示酶剂量和所获得的峰值黏度值的表格显示于图2中。用更麻烦的旋转黏度计测定确认了在分子转子測定中显示优越性能的27个变体中的24个具有优越的性能。这些结果显示了该方法的功效和准确性。用于本測定中的示例性分子转子包括但不限于9-(2-羧基-2-氰基こ烯基)-久洛尼定(CCVJ)和9-( ニ氰基こ烯基)-久洛尼定(DCVJ)及其烷基酷、I-(2-羟こ基)-6_[ (2, 2_ 二氛)こ稀基]-2, 3,4_ 二氧喧琳(DCQ)、4,4' -ニ氣-4-砸 _3a, 4a_ 重氣基-s-indacene、硫黄素T(ThT)、对-[(2-氰-2-丙ニ醇酯)こ烯基]ニ甲基苯胺等。
用途本測定允许直接实时监测悬液中黏度降低的动态速率。速度、简单性、稳健性、重复性和自动化可行性使得该测定很适于高流通量筛�。渲锌梢砸员瘸９嫘ざ燃茰y定快约1，000倍的速率产生数据。该测定的用途包括测量产生反应混合物悬液黏度变化的酶介导的反应和其他反应中的黏度变化。示例性反应是淀粉酶介导的产生低分子量葡聚糖的淀粉悬液的液化。相关反应涉及葡糖淀粉酶、支链淀粉酶、淀粉酶或其组合介导的淀粉悬液的液化，及纤维素酶、半纤维素酶或其组合介导的纤维素悬液的液化。
实施例通过将186 U L ニ 甲基亚讽加至含有 5mg 冻干 CCVJ (Sigma Aldrich Corporation,St. Louis, MO)的管中来制备IOOmM的CCVJ储液。CCVJ储液在室温下避光保存，并在使用前检查沉淀。将90g来自玉米的支链淀粉(MP Biomedicals LLC, Solon, 0H)加至2，850 y L蒸馏水，恒速搅拌加热至沸腾，支链淀粉在该条件下逐渐胶凝化和溶解。将产生的黏度均一的5%胶凝化支链淀粉悬液从热源移开，并在它回到室温时继续搅拌，此时加入150mLIMこ酸钠缓冲液(pH 5. 8)(之前通过用IMこ酸滴定IMこ酸钠配制)，然后加入150 u LTween-80 (Sigma Aldrich Corporation, St. Louis,MO) Tween-80完全溶解时，加入 150 u LIOOmM CCVJ储液并溶解(5 μ M终浓度)，此时完成支链淀粉/CCVJ试剂配制备用。该试剂在室温下保存于透明玻璃瓶中，在完成黏度测定法筛选测定所需的三天期间恒速搅拌。通过装配了能够同时对96孔微量滴定板的全部96个孔进行移液的多通道头部的Biomek FXp机器人来进行所有液体操作。向黑色未处理的聚苯乙烯96孔微量滴定板(Corning Incorporated, Corning, NY)的各孔加入60 μ L支链淀粉/CCVJ试剂。吸取30 μ L酶(IOOppma -淀粉酶)样品至其顶部,并立即在如下设置的Spectramax M2e突光计(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)上读数顶部读数突光模式；激发波长435纳米(nm);发射波长495nm ;临界波长455nm ;动态读数模式，24秒读数间隔；最初读数前振动15秒，读数间振动3秒；192秒总读数时间，20秒停滞期(从各动态速率计算去除所收集的9个数据中的第一个)。典型的结果显示在图I中。根据用分子转子黏度测定获得的结果，将27个α-淀粉酶变体鉴定为具有高水平的淀粉液化活性。将数据与用标准旋转黏度计测定获得的那些比较，这确认了变体中的24个具有高水平的淀粉液化活性(图2)，表明分子转子测定的准确性。 本组合物的其他特征、方面和实施方案将由于描述和附图而显而易见。
权利要求
1.用于实时测定悬液黏度变化的方法，其包括 向包含底物的悬液加入分子转子分子，和能够将底物转化为产物的酶或化学催化剂，所述底物能够转化为产物，所述分子转子分子的荧光量子产率依赖于悬液自由体积；和实时测量悬液中分子转子分子的荧光； 其中底物向产物的转化改变了通过测量分子转子分子的荧光测定的悬液自由体积，且其中悬液自由体积的变化与溶液黏度的变化相关。
2.权利要求I的方法，其中用悬液黏度的变化来测定底物向产物转化的速率。
3.权利要求I的方法，其中用悬液黏度的变化来测定转化为产物的底物的量。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述悬液是淀粉悬液。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述悬液是玉米支链淀粉悬液。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶是糖类加工酶。
7.权利要求6的方法，其中所述酶是淀粉酶。
8.权利要求I的方法，其中所述底物向产物的转化是淀粉酶介导的产生低分子量葡聚糖的淀粉悬液液化。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中所述分子转子分子是9-(2-羧基-2-氰基乙烯基)-久洛尼定(CCVJ)。
10.前述权利要求中任一项的方法，其以多孔方式进行。
全文摘要
用于实时测定悬液黏度变化的方法，其包括向包含底物的悬液加入分子转子分子，和能够将底物转化为产物的酶或化学催化剂，该底物能够转化为产物，该分子转子分子的荧光量子产率依赖于悬液自由体积；和实时测量悬液中分子转子分子的荧光；其中底物向产物的转化改变了通过测量分子转子分子的荧光测定的悬液自由体积，且其中悬液自由体积的变化与溶液黏度的变化相关。
文档编号G01N11/14GK102803924SQ201080024294
公开日2012年11月28日 申请日期2010年5月25日 优先权日2009年6月5日
发明者S-K·李, S·W·拉默, A·R·托波扎达 申请人:丹尼斯科美国公司
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