专利名称：莱克多巴胺单克隆抗体的制备及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学分析技术领域，具体涉及一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法以及用途，用于检测莱克多巴胺的酶联免疫检测试剂盒和胶体金试纸卡，其特别适用于畜禽组织、尿样、饲料、乳制品等样品中莱克多巴胺药物残留的检测。
背景技术：
莱克多巴胺(ractopamine，Rac)属于β -肾上腺素受体激动剂(简称β _激动·剂)，国内外许多研究者将其作为饲料添加剂，分别对猪、牛、草鱼和鼠等动物进行试验，证明其具有营养重分配作用，该药物能改变动物的营养代谢，降低胴体脂肪，提高瘦肉率，同时使动物增重，提高饲料使用率。然而β_激动剂在动物体内的蓄积性残留会对食用者的安全构成潜在威胁，常常引起食用者发生心悸、肌肉震颤、恶心呕吐、发热寒战等临床症状，特别对心脏病、糖尿病、高血压等病人�：Ω�。在欧洲，1986年就颁布了禁用β-激动剂的禁令，1997年我国农业部严禁将β -激动剂等药物作为动物促生长剂使用。然而由于经济利益的驱使，违法滥用β_激动剂的现象仍非常普遍，各类中毒事件时有发生。另外由于美国FDA核准Elanco Animal Health Products所制造的莱克多巴胺用作猪的饲料添加剂，这一规定成为许多非法使用者的借口。为了打击非法使用违禁药物，除了健全法律法规，建立有效的监督管理体系外,还需要健全相应的检测方法。目前分析检测莱克多巴胺的方法主要有仪器检测法和免疫分析方法，其中仪器检测方法主要涉及高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS)，但是仪器检测方法所用的仪器几乎都属于大型仪器，价格昂贵，样品前处理过程复杂，需要专业技术人员才可操作仪器，检测过程耗时长，检测成本高，不适合现场监控和大量样品的筛查；免疫分析方法主要包括酶联免疫吸附检测方法(ELISA)和免疫胶体金检测方法，这两种方法均属于快速检测方法，并在食品安全监管的现场大量样品筛查工作中已经被使用。两种检测方法均操作简单快速、不需大型仪器设备、不需专业技术人员操作即可完成检测，特别适合于现场大批量样品抽检。但是，目前的检测莱克多巴胺酶联免疫检测试剂盒对检测莱克多巴胺特异性不理想，试剂盒的灵敏度不高，稳定性不好，样品前处理方法繁琐费时；莱克多巴胺胶体金试纸卡存在着检测产品稳定性差，检测结果不够准确的缺点。本发明为了解决上述问题，从改造莱克多巴胺半抗原结构出发，进而优化免疫原和包被原结构，来改善抗体的质量，提高抗体的特异性，增强抗体与抗原的识别能力。
发明内容
本发明的一个目的是针对现有莱克多巴胺检测技术的不足，提供了一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，使其具有抗体效价高、特异性强、成本低廉的特点。本发明的莱克多巴胺单克隆抗体是通过以下技术方案得以实现的1、莱克多巴胺抗原的制备(I)、本发明中的莱克多巴胺半抗原合成步骤为
1.1g对苯二胺，溶入150ml O. 2M的HCl水溶液中，0-4°C下滴加O. 7g NaN02的20ml水溶液，避光反应O. 5-1小时，然后缓慢滴加1.1g莱克多巴胺在20ml O. 5mol/L醋酸钠水溶液中的混合物。避光反应1-3小时。加入适量浓盐酸酸化，产生沉淀，离心，水洗，乙酸乙酯提�。ト芗梁蟮玫桨肟乖晨硕喟桶返呐嫉苌铮寐�75-80% (如
图1所示)。其分子结构如下
权利要求
1.一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于所述莱克多巴胺单克隆抗体采用合成的莱克多巴胺半抗原与载体蛋白偶联得到的抗原进行动物免疫而得到的，其中所述莱克多巴胺半抗原的制备方法步骤为1.1g对苯二胺，溶入150ml 0. 2M的HCl水溶液中，0-4°C下滴加0.1g NaNO2的20ml水溶液，避光反应0. 5-1小时，然后缓慢滴加1.1g莱克多巴胺在20ml0. 5mol/L醋酸钠水溶液中的混合物。避光反应1_3小时。加入适量浓盐酸酸化，产生沉淀，离心，水洗，乙酸乙酯提�。ト芗梁蟮玫嚼晨硕喟桶钒肟乖晨硕喟桶返呐嫉苌�。
2.根据权利要求1所述的莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，其特征在于莱克多巴胺小分子经过结构改造得到带有氨基结构的莱克多巴胺的偶氮衍生物，其分子结构如下
3.根据权利要求1所述的莱克多巴胺单克隆抗体，其特征在于其制备方法包括以下步骤 (1)将权利要求2所述的莱克多巴胺半抗原与牛血清白蛋白偶联得到的免疫原对8-10周龄的Balb/c小鼠进行三次间隔免疫，在第三次免疫后再进行一次加强免疫，激活体内的淋巴细胞，产生莱克多巴胺特异性抗体。
(2)将产生莱克多巴胺特异性抗体的Balb/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按8 I比例进行融合，采用间接竞争ELISA测定细胞上清液，筛选阳性孔。将阳性细胞采用有限稀释法进行亚克�。玫轿榷ǖ哪芄环置诶晨硕喟桶返タ寺】固宓脑咏涣鱿赴�。
(3)用液体石蜡致敏Balb/c小鼠，将收集得到的杂交瘤细胞株用1640进行清洗，并注射与小鼠的腹腔。采集到的腹水，用辛酸-饱和硫酸铵法进行纯化，纯化后的腹水放入-20°C环境保存。
4.如权利要求1所述的莱克多巴胺单克隆抗体制备的莱克多巴胺酶联免疫试剂盒，其包括 (1)包被了莱克多巴胺抗原的96孔酶标板； (2)羊抗鼠酶标二抗； (3)莱克多巴胺抗体工作液； (4)莱克多巴胺标准品溶液； (5)底物液A液； (6)底物液B液； (7)终止液； (8)2 X浓缩洗涤液。
5.根据权利要求4所述酶联免疫试剂盒，其特征在于所述的羊抗鼠酶标二抗是采用改良过的过碘酸钠法将所述羊抗鼠二抗与辣根过氧化物酶或细菌提取碱性磷酸酯酶偶联得到。
6.如权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于当所述标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物A液为pH 5. 0，含有0. 75%过氧化氢脲的0. lmol/L柠檬酸-0. 2mol/L磷酸盐缓冲液，底物显色液B液为3，3’，5，5’ -四甲基联苯胺的乙醇水溶液，所述终止液为2mol/L硫酸；当所述标记酶为碱性磷酸酯酶时，底物显色液为4-硝基酚磷酸钠盐缓冲液，终止液为I 2mol/L的氢氧化钠溶液，所述百分含量为质量百分比。
7.如权利要求4或5所述的酶联免疫试剂盒，其特征在于所述包被缓冲液为pH为9.4 9. 6的0. 05mol/L碳酸盐缓冲液，所述封闭液为pH为7. 2，含有I %卵清白蛋白，0.05mol/L的磷酸盐缓冲液，所述洗涤液为pH7. 2，含有0. 05%吐温-20，0. 05mol/L的磷酸盐缓冲液，所述百分比为质量百分比。
8.如权利要求4或5的酶联免疫试剂盒，其特征在于莱克多巴胺标准品溶液的浓度分别为 0 u g/L、0. 05 u g/L、0. 15 u g/L、0. 45 u g/L、1. 35 u g/L、4. 05 u g/L。
9.由权利要求3所述的莱克多巴胺单克隆抗体制备的莱克多巴胺胶体金试纸卡，其由样品吸收垫、结合物释放垫、反应膜和吸水垫依次粘贴在PVC底板上组成，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的莱克多巴胺单克隆抗体，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有莱克多巴胺半抗原和载体蛋白偶联物，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。
10.如权利要求9所述的莱克多巴胺胶体金试纸卡，其特征在于莱克多巴胺半抗原和载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为甲状腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋白、卵清蛋白或血蓝蛋白。
全文摘要
本发明提供了一种莱克多巴胺单克隆抗体及其应用。本发明公开了一种莱克多巴胺单克隆抗体的制备方法，通过合成莱克多巴胺半抗原以及莱克多巴胺半抗原与载体蛋白免疫得到莱克多巴胺抗原，将其免疫动物得到高特异性单克隆抗体。本发明还提供的一种将莱克多巴胺单克隆抗体应用于酶联免疫试剂盒检测莱克多巴胺的方法。本发明还提供了一种将莱克多巴胺单克隆抗体应用于胶体金试纸卡检测检测莱克多巴胺的方法。本发明制备得到的莱克多巴胺单克隆抗体特异性高，成本低，以此莱克多巴胺单克隆抗体制备的莱克多巴胺酶联免疫试剂盒和胶体金试纸卡检测莱克多巴胺药物具有操作方便、检测成本低、特异性高、灵敏度高、准确度高、精确度高、检测快速等特点。
文档编号G01N33/543GK103012592SQ20111028171
公开日2013年4月3日 申请日期2011年9月21日 优先权日2011年9月21日
发明者何方洋, 万宇平, 冯静, 扶胜, 聂雯莹, 邵小雪, 顾蓉蓉, 何丽霞 申请人:北京勤邦生物技术有限公司
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