专利名称：一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及生物检测领域，特别是涉及一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒。
背景技术：
单核细胞增生李斯特菌(L. monocytogenes)归属于李斯特菌属(Listeria)。单核细胞增生李斯特菌是李斯特菌属中唯一对人致病的病菌。李斯特菌是一种细胞内寄生菌，它不仅可能存在于肉类产品中，也可能存在于乳制品、蔬菜、沙拉及海产品等日常食物里面。此菌广泛分布于自然界中，在土壤、排污下水、地表水、青贮饲料、烂菜中均可分离到。人也可作为无症状携带者。李斯特菌能在I 45°C的温度下生存，能在家用电冰箱的冷藏 室内较长时间生长、繁殖。单增李斯特菌主要引起致死性的脑膜炎和脓毒症，孕妇流产和新生儿细菌性脑炎。此菌的致病力强，尤其是免疫缺陷病人感染后，病死率可高达30% 70%。近几年来，李斯特菌病已呈世界性分布，北美和西欧等许多国家人食源性李斯特菌病日渐增多，且引起多起病人的死亡。因此，食品中存在的单核细胞增生性李斯特氏菌对人类的安全具有危险，如今已有20多个国家把它列为“食品致病菌”。目前，单增李斯特菌的检测方法主要依靠传统的分离养和生化鉴定，该方法费时费力。荧光定量PCR和传统细菌培养，次两种方法检测时间较长，最快人需8个小时，并且需要指定的实验环境和昂贵的仪器，PCR还易出现假阳性，不适合现场快速检测。酶联免疫检测法，虽然检出限较低，但检测前、后都需要做必要的仪器清洗及保养工作，检测时间长，并且要求本领域专业技术人员来操作。免疫胶体金技术(Immunogold labelling techique)是上世纪80年代继突光素、放射性同位素和酶三大标记技术后发展起来的固相标记免疫测定技术。该技术主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，当这些标记物在相应的配体处大量聚集时，形成肉眼可见的红色或粉红色斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新型层析材料基础上发展起来的一项新型体外诊断技术，近年来发展迅速，在生物医学领域特别是医学检验中得到了广泛应用。该技术主要是将特异性的抗原或抗体以条带状固定在硝酸纤维膜上，胶体金标记试剂吸附在结合垫上，当待测样品加到试纸条一端的样品垫上后，通过毛细作用向前移动，溶解结合垫上的胶体金标记试剂后相互反应，再移动至固定的抗原或抗体区域时，待测物金标试剂复合物与之发生特异性结合而被截留，胶体金标记聚集在检测带上，可通过目测得到直观的显色结果。而游离的标记物则越过检测带，从而达到与检测物自动分离的目的。免疫胶体金层析技术操作简单、快速、灵敏和特异性好，用于单增李斯特菌的快速检测，此项技术虽然是一种较为成熟的技术，但胶体金试纸条容易受到污染，不好保存，而现有技术中的试剂盒由于结构及各个部件位置和连接关系以及适用原理的不同，使得在检测和使用观察过程中存在足多不便。
实用新型内容为解决上述领域的需求和空白，本实用新型旨在提供一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒，用于谷物类单增李斯特菌的检测，本发明试剂盒采用双抗体夹心法原理和免疫胶体金技术相结合快速检测单增李斯特菌。—种快速检测单增李斯特菌的试剂盒，包括盒体、盒盖构成的盒封闭体和置于盒体内的胶体金试纸条，所述盒盖上具有加样孔、测试项标识和结果观察孔；其特征在于所述测试项标识设在所述加样孔和所述结果观察孔之间，所述盒封闭体上下表面的一对对角为弧形，所述盒封闭体上还设有透气孔，所述胶体金试纸条的金标纤维垫包被有胶体金标记的单增李斯特菌P60单抗，所述胶体金试纸条的纤维素药膜上所设的检测线T线和对照线C线上分别包被有单增李斯特菌P60单抗和兔抗小鼠IgG多抗。所述透气孔设在所述盒封闭体盒盖一面。所述透气孔为多个，呈扇形排列。所述盒体内设有安装胶体金试纸条的定位槽，当所述胶体金试纸条放置于盒体内的定位槽时，对应于盒盖加样孔处为样品纤维垫；对应于测试项标识处为金标纤维垫，对应于所述结果观察孔处为纤维素药膜。所述盒体设有连接装置，所述盒盖和盒体通过连接装置可拆卸式连接。所述盒盖上对应于盒体的一面设有多个小孔，所述盒体对应于盒盖的一面设有与所述盒体一体的凸起，所述凸起与所述盒盖上的小孔数量大小相适配。所述盒体上设有样品编号。所述样品编号设在所述盒封闭体盒盖一面，并且靠近所述结果观察孔的一侧。技术效果本实用新型的快速检测单增李斯特菌的试剂盒，包括盒体、盒盖构成的盒封闭体和置于盒体内的胶体金试纸条，所述盒盖上具有加样孔、测试项标识和结果观察孔；其特征在于所述测试项标识设在所述加样孔和所述结果观察孔之间，便于观察和使用，便于识别具体检测项目，所述盒封闭体上下表面的一对对角为弧形，节省材料空间，并且美观大方，所述盒封闭体上还设有透气孔，使得盒体内能够与外界保持气流相通，在检测时，保证反应膜正常发挥毛吸作用，使检测物能够完全地快速地定向移动至透气孔端，避免了阻滞或者不完全泳动等现象，保证了检测的灵敏性、准确性和高效率。所述胶体金试纸条的金标纤维垫包被有胶体金标记的单增李斯特菌P60单抗用于结合单增李斯特菌抗原，所述胶体金试纸条的纤维素药膜上所设的检测线T线和对照线C线上分别包被有单增李斯特菌P60单抗和兔抗小鼠IgG多抗，用于具体的特异性反应的显色。本实用新型优选将透气孔开在所述盒盖上。防止检测液从透气孔滴漏出来染到操作人员的皮肤上。本实用新型进一步优选透气孔为多个小孔，呈扇形排列。多个小孔的设计使通气孔既起到通气的作用，又不会让反应膜暴露出来，从而避免污染到人的皮肤。扇形排列较为美观。本实用新型所述盒体内设有安装胶体金试纸条的定位槽，当所述胶体金试纸条放置于盒体内的定位槽时，对应于盒盖加样孔处为样品纤维垫，对应于测试项标识处为金标纤维垫，对应于所述结果观察孔处为纤维素药膜。所述盒封闭体设有连接装置，所述盒盖和盒体通过连接装置可拆卸式连接，一方面方便使用，另一方面盒体和盒盖可重复使用，节省资源。所述盒盖上对应于盒体的一面设有多个小孔，所述盒体对应于盒盖的一面设有与所述盒体一体的凸起，所述凸起与所述盒盖上的小孔数量大小相适配，加工制作简单，方便拆卸，不易污染。所述盒封闭体上还设有样品编号，便于查找、区分，便于识别产品类别及测试项目。本实用新型优选所述样品编号设在所述盒封闭体盒盖一面，并且靠近所述结果观察孔的一侧，便于使用及观察。本实用新型操作简单，使用方便，拿来即用，不需要本领域的专业人员，不需要任 何仪器，能够满足不同层次人员的需要，容易普及，以符号显示结果，摆脱了对设备、仪器、人员及贮存和运输环境的特殊要求，并且具有快速、简便、灵敏、准确、特异的特点。
图I本实用新型试剂盒盒盖示意图图2本实用新型试剂盒优选方案盒盖示意图图3本实用新型试剂盒示意图图4本实用新型试剂盒优选方案示意图图5本实用新型试剂盒盒体示意图图6本实用新型胶体金试纸条示意图其中I-盒盖，2-盒体，3-加样孔，4-测试项标识，5-结果观察孔，6_盒封闭体，7-样品编号，8-胶体金试纸条，9-凸起，10-样品纤维垫，11-金标纤维垫，12-纤维素药膜，13-吸水材料垫，14-透气孔。
具体实施方式
提供下述实施例是为了更好地进一步理解本实用新型，并不局限于所述最佳实施方式，不对本实用新型的内容和保护范围构成限制，任何人在本实用新型的启示下或是将本实用新型与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本实用新型相同或相近似的产品，均落在本实用新型的保护范围之内。本实用新型操作简单、使用方便，美观大方、成本低廉，具有快捷、准确、方便、价廉的特点。说明书附图中的L. MCTG是指单增李斯特菌测试标示项。实施例I.本实用新型的快速检测单增李斯特菌的试剂盒，包括盒体2、盒盖I构成的盒封闭体6和置于盒体2内的胶体金试纸条8，所述盒盖I上具有加样孔3、测试项标识4和结果观察孔5 ;其特征在于所述测试项标识4设在所述加样孔3和所述结果观察孔5之间，便于观察和使用，便于识别具体检测项目，所述盒封闭体6上下表面的一对对角为弧形，节省材料空间，并且美观大方，所述盒封闭体6上还设有透气孔14，使得盒体2内能够与外界保持气流相通，在检测时，保证反应膜正常发挥毛吸作用，使检测物能够完全地快速地定向移动至透气孔14端，避免了阻滞或者不完全泳动等现象，保证了检测的灵敏性、准确性和高效率。所述胶体金试纸条8的金标纤维垫11包被有胶体金标记的单增李斯特菌P60单抗用于结合单增李斯特菌抗原，所述胶体金试纸条8的纤维素药膜12上所设的检测线T线和对照线C线上分别包被有单增李斯特菌P60单抗和兔抗小鼠IgG多抗，用于具体特异性反应的显色。本实用新型优选将透气孔14开在所述盒盖I上。防治检测液从透气孔14滴漏出来染到操作人员的皮肤上。本实用新型进一步优选透气孔14为多个小孔，呈扇形排列。多个小孔的设计使通气孔既起到通气的作用，又不会让反应膜暴露出来，从而避免污染到人的皮肤。扇形排列较为美观。本实用新型所述盒体2内设有安装胶体金试纸条8的定位槽，当所述胶体金试纸条8放置于盒体2内的定位槽时，对应于盒盖I加样孔3处为样品纤维垫，对应于测试项标 识4处为金标纤维垫11，对应于所述结果观察孔5处为纤维素药膜12。所述盒封闭体6设有连接装置，所述盒盖I和盒体2通过连接装置可拆卸式连接，一方面方便使用，另一方面盒体2和盒盖I可重复使用，节省资源。所述盒盖I上对应于盒体2的一面设有多个小孔,所述盒体2对应于盒盖I的一面设有与所述盒体2—体的凸起，所述凸起与所述盒盖I上的小孔数量大小相适配，加工制作简单，方便拆卸，不易污染。所述盒封闭体6上还设有样品编号7，便于查找、区分，便于识别产品类别及测试项目。本实用新型优选所述样品编号7设在所述盒封闭体6盒盖I 一面，并且靠近所述结果观察孔5的一侧，便于使用及观察。实验例2.本发明试纸条的制备方法试纸条的制备程序如下步骤I.纤维素药膜的包被I、将兔抗小鼠IgG多抗作为对照线C线，单增李斯特菌P60单抗作为检测线T线，两个试剂分别按照所需的浓度(范围I. 5-2mg/ml)，用20mM的PBS进行稀释。2、将配制好的上述试剂，按照C、T线位置分别包被到硝酸纤维素膜上，然后干燥6小时，温度为30°C，湿度< 35%，从而制得纤维素药膜。步骤2.金标纤维层的标记I、取40nm的胶体金溶液，按终浓度8-12 μ I/ml加入O. 2M K2CO3,加入一定浓度的单增李斯特菌P60单抗，放置室温反应15-30分钟，然后按照浓度20 μ I/ml加入20%BSA的溶液，用于饱和游离的胶体金。最后lOOOOrpm，离心30分钟，去除上清液中未结合的蛋白质。用等体积的O. 5m硼酸溶液(含l%Tween、5%蔗糖、1%水解BSA、1%水解酪蛋白、O. 1%PVA)复溶沉淀的胶体金标记原液。2、将上述胶体金标记原液按照10-20%浓度，用O. 5m硼酸溶液进行稀释，从而配制成标记后的胶体金工作液。然后再将该工作液铺于30*30cm玻璃纤维垫上,干燥6小时,温度为30°C，湿度彡35%，从而制得金标垫。[0052]步骤3.试纸条的组装I、将塑料板平放在操作台上，贴上双面胶带。2、撕掉双面胶带衬纸，在距塑料板上端30mm处贴上已包被有单增李斯特菌P60单抗和兔抗小鼠IgG多克隆抗体的硝酸纤维素膜。3、将粗纤维吸水纸压硝酸纤维素膜上端2mm贴上，上端与塑料板上端取齐。4、将小无纺布压硝酸纤维素膜下端O. 5mm处贴上。5、将金标垫取齐压于小无纺布上面。6、将玻璃纤维垫压于金标垫上约一半，下端距塑料板下端2mm处贴上。·[0059]7、将大无纺布与金标垫上端取齐，下端与塑料板下端取齐贴上。8、将箭头胶带压硝酸纤维素膜I. 5-2mm贴上。9、将手持端胶带压粗纤维吸水纸贴上。本发明一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒采用双抗体夹心法原理和免疫胶体金技术相结合快速检测食品中的单增李斯特菌。本实用新型试剂盒操作简单，使用方便，拿来即用，不需要本领域的专业人员，能够满足不同层次人员的需要，容易普及，本实用新型以符号显示结果，摆脱了对设备、仪器、人员及贮存和运输环境的特殊要求，用于谷物类单增李斯特菌的检测。本发明试剂盒简捷、灵敏、准确，并且容易保存，使用方便，美观大方。
权利要求1.一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒，包括盒体、盒盖构成的盒封闭体和置于盒体内的胶体金试纸条，所述盒盖上具有加样孔、测试项标识和结果观察孔；其特征在于所述测试项标识设在所述加样孔和所述结果观察孔之间，所述盒封闭体上下表面的一对对角为弧形，所述盒封闭体上还设有透气孔，所述胶体金试纸条的金标纤维垫包被有胶体金标记的单增李斯特菌P60单抗，所述胶体金试纸条的纤维素药膜上的检测线T线和对照线C线上分别包被有单增李斯特菌P60单抗和兔抗小鼠IgG多抗。
2.根据权利要求I所述的快速检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述透气孔设在所述盒封闭体盒盖一面。
3.根据权利要求2所述的快速检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述透气孔为多个，呈扇形排列。
4.根据权利要求3所述的快速检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述盒体内设有安装胶体金试纸条的定位槽，当所述胶体金试纸条放置于盒体内的定位槽时，对应于盒盖加样孔处为样品纤维垫；对应于测试项标识处为金标纤维垫；对应于所述结果观察孔处为纤维素药膜。
5.根据权利要求4所述的快速检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述盒体设有连接装置，所述盒盖和盒体通过连接装置可拆卸式连接。
6.根据权利要求5所述的快速检测单增李斯特菌的试剂盒，其特征在于，所述盒盖上对应于盒体的一面设有多个小孔，所述盒体对应于盒盖的一面设有与所述盒体一体的凸起，所述凸起与所述盒盖上的小孔数量大小相适配。
专利摘要本实用新型“一种快速检测单增李斯特菌的试剂盒”属于生物检测耗材，其特征在于，所述测试项标识设在所述加样孔和所述结果观察孔之间，所述盒封闭体上下表面的一对对角为弧形，所述盒封闭体上还设有透气孔，所述胶体金试纸条的金标纤维垫包被有胶体金标记的单增李斯特菌P60单抗，所述试剂盒的纤维素药膜上所设的检测线T线和对照线C线上分别包被有单增李斯特菌P60单抗和兔抗小鼠IgG多抗。本实用新型试剂盒采用双抗体夹心法原理以及胶体金技术快速检测单增李斯特菌，用于食品中单增李斯特菌的检测。本实用新型试剂盒简捷、灵敏、准确、特异，并且容易保存，使用方便，美观大方。
文档编号G01N33/577GK202710560SQ20122029085
公开日2013年1月30日 申请日期2012年6月15日 优先权日2012年6月15日
发明者张春山, 张永胜 申请人:北京博欧实德生物技术有限公司
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