专利名称：一种人血液hsp70抗体胶体金标检测试纸条及其制备方法
技术领域：
本发明属于免疫检测分析技术领域，具体涉及一种人体液中HSP70抗体胶体金标检测试纸条及制备方法。
背景技术：
热休克蛋白家族(HSPs)是一类高度保守的蛋白，HSP70 (heat shock protein70,热休克蛋白)是热休克蛋白家族中的重要成员，其分为诱导型的组成型的。当机体受到外界环境中多种不良因素刺激时，诱导型的HSP70蛋白表达升高。HSP70蛋白对细胞损伤的修复、存活和维持正常的细胞功能是必需的。在环境刺激、病原菌感染、疾病引起细胞应激损伤中发挥分子伴侣作用，阻止蛋白聚集，促进损伤蛋白的重新折叠。在大多数的哺乳动物，只有在应激条件下诱导型HSP70表达，而且显著的细胞和机体应激后才能检测到，但 是在人和灵长类，诱导型的HSP70有一个基准值，在一些特殊条件下如过热、化学有毒物质暴露、缺氧、缺体、感染、自身免疫性疾病、凋亡、器官移植、细菌和病毒引起的感染，动脉粥样硬化等心体管疾病中，生物体的HSP70表达显著升高；在正常老化过程，精子发生，月经，运动练习等正常生理过程中，生物体的HSP70表达也显著升高，提示其在这些过程中可能发挥重要作用。研究者发现在很多疾病的发生、形成、预后过程中Hsps的自身抗体显著改变，提示HSP70抗体在这些过程中可能具有重要作用。一般认为诱导型的HSP70是细胞内的蛋白，但是研究发现在正常人的外周循环和一些疾病状态下能够检测到可溶性的HSP70和HSP70抗体，细胞内的HSP70能够释放到细胞外，引起机体产生HSP70抗体。近来的研究发现在各种风湿性疾病和自身免疫性疾病，HSP70能够被机体识别，产生自身抗体；人群流行病学研究发现HSP70抗体与动脉粥样硬化的进展和严重程度密切相关。所以建立快速、可靠的检测血中HSP70抗体的方法，将为多种疾病的监控提供重要的手段。现在检测HSP70抗体的方法主要有Western Blotting、Elisa方法。各种方法互相印证，同时又存在检测灵敏度、专业性、设备设施条件及成本的影响。目前，以血清学反应原理为基础的酶联免疫吸附吸附测定(Elisa)是被广泛接受和推广的方法。酶联免疫吸附分析(enzymelinked immunosorbent assay,ELISA)技术是目前进行体液生物蛋白检测最为常用的方法，与其他检测方法相比，ELISA检测方法具有成本低、检测设施设备简单、快速高效的特点，并在不断改进当中，已经有直接ELISA、间接ELISA、单抗体ELISA，微波ELISA、双抗体夹心ELISA方法。但是ELISA方法，目前只适用于实验室检测，不能适用于现场检测。应激是机体在对生存环境中多种不利因素适应过程中，实际或认知上的要求与适应和应付能力之间不平衡导致的身心紧张状态及其反应。应激同人的健康有密切联系，这种联系是双向的一方面应激可影响人的健康，另一方面一个人的健康状况也会影响应激条件下心理应激反应的强度和对应激的耐受力。适度的心理应激是人成长和发展的必要条件，适当的应激有助于维持人的生理、心理和社会功能，应对挑战既可以引起我们的紧张、劳累、苦恼和痛苦，又可以为我们带来成功的喜悦、轻松和欢乐。但是长期、超过人适应和应对能力的应激就会损害人的健康，这是心理应激对健康的消极影响，主要表现在下述三个方面。首先，心理应激引起的心理和生理反应可以以症状和体征的形式见之于临床，成为人们身体不适、虚弱和精神痛苦的根源和就医需求帮助的原因；其次，心理应激可以加重已有的精神障碍和躯体疾�。蚴拐庑┘膊「捶ⅲ蛔詈螅睦碛た梢栽斐啥约膊〉囊赘凶刺⑶以谄渌蛩氐墓餐饔孟碌贾滦碌木裾习颓寮膊 Ｊ笛槭仪捌谘芯糠⑾郑て诟咔慷扔ぃ錒SP70抗体水平升高，HSP70抗体可作为应激的生物标记物，可以检 测机体应激水平，预防应激损伤的发生，用于机体应激负荷健康风险评估。
发明内容
本发明目的是克服现有HSP70抗体检测技术中的不足，提供一种人血液HSP70抗体胶体金检测试纸条。本发明的目的还在于提供上述检测试纸条的制备方法。一种人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条，此试纸条包括设在固定板I上依次相连的样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸9 ;在硝酸纤维素膜4上设有三条平行检测线抗原5，6，7和一条质控线抗体8 ;在金标垫3上设有金标抗原。固定板I为具有压敏胶的PVC板材，样品垫2为玻璃纤维膜，金标垫3为聚酯纤维膜。金标抗原为显色抗原，检测线抗原为捕捉抗原，显色抗原与捕捉抗原能同时和人HSP70抗体结合形成双抗原夹心；显色抗原和捕获抗原为原核重组表达的人HSP70蛋白；金标抗原用粒径为20nm-60nm的胶体金标记。质控线抗体为兔抗人HSP70多克隆抗体。一种权利要求I所述的人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)用常规的柠檬酸三钠还原法制备均匀粒径为20nm-60nm的胶体金；(2)调节胶体金pH为8. 5-9，然后加入显色抗原与其反应，其中显色抗原的浓度为O. 02mg/ml，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗原溶液，将金标抗原溶液喷印在聚酯纤维膜，晾干；(3)将捕捉抗原用稀释液稀释成浓度为lmg/ml的捕捉抗原溶液，用喷墨仪将捕捉抗原溶液在硝酸纤维素膜上喷划三条平行检测线，真空干燥；(4)将兔抗人HSP70多克隆抗体用稀释液稀释成浓度为O. 5mg/ml的兔抗人HSP70多克隆抗体溶液，用喷膜仪将抗体喷线在硝酸纤维素膜上形成质控线，真空干燥；(5)按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸顺序粘贴在固定板上，切条，装入塑料袋，干燥包装。离心的方法为反应液于5000xg离心30min，沉淀用lwt%牛血清白蛋白溶液重悬浮，反复2次；其中lwt%牛血清白蛋白(BSA)溶液为IOmM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5，含lwt%的牛血清白蛋白。步骤(2)中重悬沉淀的溶液为20mM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5，含30wt%的海藻糖，lwt%的牛血清白蛋白，Iwt %的酪蛋白，体积浓度为O. 01%的Tween-20(吐温-20),O. 02 wt % 的 NaN3。述稀释液为IOmM的磷酸盐缓冲溶液，pH为7. 6，其中含10wt%的海藻糖，体积浓度为3%的甲醇。本发明的有益效果为用于人血液HSP70抗体检测，检测灵敏度高，准确性强、成本低；结果易观察判断，20min内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性，操作简便，无需特殊仪器设备，适宜在现场检测基层医院和实验研究推广和应用。
图I为试纸条的结构示意图；其中各标号为1-固定板，2-样品垫，3-为胶体金垫，4-为硝酸纤维素膜，5-第一检测线抗原，6-第二检测线抗原，7-第三检测线抗原，8-为质控线，9-吸水纸。
图2为试纸条测试结果判定示意图。图3为HSP70蛋白诱导表达及纯化后HSP70蛋白的SDS-PAGE图；各条带分别为I-诱导表达的未经纯化的全菌蛋白；2、3、4分别为Ni柱亲和纯化HSP70蛋白，箭头所示HSP70目标蛋白。
具体实施例方式实施例I试纸条的制备以下述方式进行I.胶体金制备将HAuCl4配制成浓度为O. Olwt %的水溶液，取IOOml加热至沸。搅动下准确加入2ml的Iwt %柠檬酸三钠(C6H5Na3O7CH2O)水溶液。继续加热煮沸15min。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸钠加入后很快变为灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成红色。冷却至室温后用蒸馏水恢复至原体积。2.胶体金质量的分析采用多功能酶标仪对胶体金进行波长在400 800nm范围光密度扫描，获得其最大吸收波长和半峰宽。根据最大吸收波长判断粒径大�。莅敕蹇砼卸狭＞毒怀潭�。3.显色抗原金标记用K2CO3调整胶体金的pH值到8. 5，于IOOml胶体金溶液中滴加显色抗原2mg，搅拌5min，避光静止放置30min，再加入25ml 5wt% BSA溶液(用IOmM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5配制)，封闭2h以上，反应液5000xg离心30min，沉淀用125ml的lwt% BSA溶液重悬�。锤创�2次，沉淀用Iml重悬液(20mM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5，其中含30wt%的海藻糖，lwt%的BSA，lwt%的酪蛋白，体积浓度为O. 01%的Tween-20,0. 02wt%的NaN3)重悬沉淀,得到金标抗原。4.金标垫的制备将金标抗原用喷膜仪喷印在聚脂纤维素膜上，2 μ I /cm最优，干燥。5.检测线的制备取纯化的HSP70蛋白捕获抗原(可与显色抗原形成夹心配对)作为检测线抗原，用稀释液(IOmM的磷酸盐缓冲溶液，pH为7. 6，其中含10wt%的海藻糖，体积浓度为3%的甲醇)稀释成lmg/ml浓度的溶液，用喷墨仪在硝酸纤维素膜上将抗原喷线，每隔O. 5cm喷一线，共喷三条平行线，形成检测线，喷线以 μ /cm最优，真空干燥。
6.质控线的制备将兔抗人HSP70的多克隆抗体用稀释液(IOmM的磷酸盐缓冲溶液，pH为7. 6，其中含10wt%的海藻糖，体积浓度为3%的甲醇)稀释成浓度为O. 5mg/ml溶液，用喷膜仪将抗体喷线在硝酸纤维素膜上形成质控线，1μ I /cm最优，真空干燥。7.试纸条的组装将样品垫2、金标垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸9按顺序黏贴在压敏胶的PVC板I上，如图I所示，硝酸纤维素膜4上含有捕获抗原的3条检测线5、6、7以及质控线8 ;将黏附好的大板切割成4_宽的试纸条，包装于含有干燥剂的密闭容器内，室温保存。8.检测及结果判定将试纸条平放，样品IOOul滴加在样品垫上，20min时观察，检测结果判读检测线显示I条带，表明阴性；检测线显示2条带，表明弱阳性；检测线显示3条带，表明强阳性；以上结果判定必须以质控线显示条带为基�。糁士叵呶尴陨醮砻魇灾教跏В峁卸ㄎ扌В匦虏舛ǎ缤�2所示。实施例2
实施例I制备的试纸条对人血清中HSP70抗体的检测采用HSP70抗体ELISA检测试剂盒检测人群血样，根据检测结果，从正常人血样，中度应激强度人血样和高应激人群中分别选取代表HSP70抗体阴性、弱阳性和强阳性血样各5份，15份血样用移液器吸取100 μ I的血浆样本，加在胶体金试纸条的样品垫上，开始计时，等待红色条带出现，20分钟时判断结果。结果判定当质控线出现，检测线出现一条线时，表明HSP70抗体阴性，表明机体应激水平正
堂
巾O当质控线出现，检测线出现二条线时，表明HSP70抗体弱阳性，表明机体处于次强应激状态；当质控线出现，检测线出现三条线时，表明HSP70抗体强阳性，表明机体处于过强应激状态；若质控线无显色条带，表明试纸条失效；结果15个试纸条质控线全部出现，15份血样检测结果与预测结果一样，100%全都符合，表明试纸条准确可靠。实施例3HSP70蛋白抗原的制备纯化按下述方法(I)设计PCR扩增引物，构建原核表达载体，其中上游弓丨物为5，CGAATTCATGGCCAAGAAAACAGCG3’；下游弓丨物为5’ CCCAAGCTTCTAATCCACCTCCTCGAT3’，PCR 扩增 HSP70 基因。PCR扩增条件为第一阶段温度95°C，时间3min ；第二阶段温度95°C、时间:30s，温度:56°C、时间:60s，温度:72°C、时间60s,以上进行30个循环；第三阶段温度72°C、时间10min。PCR产物纯化后经EcoRI和Hind III双酶切后经胶回收试剂盒回收备用；(2)构建原核表达菌株
表达载体PET32a经EcoRI和Hind III双酶切后经胶回收试剂盒回收，与HSP70PCR产物回收片段进行连接，转化至BL21感受态菌株中，涂平板，在培养箱中培养16h，挑克�。谝【苤欣┱梗嶂柿Ｃ盖屑ǎ粜跃炒妫魑狧SP70表达菌株。(3)诱导表达并纯化HSP70蛋白HSP70表达菌株于LB培养基中37°C振�。┰鲋罯D值O. 5时，加入IPTG 1.0U/ml,诱导4h，离心收集菌体，于PB缓冲液中超声破碎，离心收集上清。将收集的上清GE公司HP HISTrip纯化柱进行纯化。纯化条件为亲和缓冲液(Buffer) 20mM的磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为500mM，pH为7. 4。洗脱Buffer 20mM的磷酸盐缓冲液，氯化钠浓度为500mM，咪唑浓度为500mM，pH为 7.4。 取样品10ml,经O. 45 μ m膜过滤；柱子(Histrap 5ml)用亲和Buffer平衡10个柱体积，流速为5ml/min,上样IOml,再经亲和Buffer洗5个柱体积,用洗脱Buffer , IOOml线性梯度洗脱目标蛋白，收集目标峰，进行纯度鉴定。4)用SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度将洗脱纯化的蛋白与上样缓冲液混合，100°C加热5min变性，IOOOrpm离心lOmin，取上清IOul上样，SDS-PAGE胶浓度为12. 5wt%，电泳条件，60V，30min，120V，80min ;电泳完毕后，胶进行考马斯亮蓝R250染色，脱色后，胶进行扫描并图像分析，结果重组HSP70蛋白纯度> 95%以上，如图3所示。5)将洗脱液装入透析袋中，PBS液中透析过夜，其间换液三次。将透析袋中的液体分装入冷冻干燥管中，即制成HIS-HSP70重组蛋白，每管中总蛋白量为lmg，冷冻干燥成粉末状，放入_70°C备用。实施例4兔抗人HSP70多克隆抗体制备I)选用健康雌性家兔，用实施例2制成的HIS-HSP70重组蛋白作为免疫原免疫动物；免疫程序为将O. 5ml的浓度为2mg/ml蛋白抗原与O. 5ml的弗氏完全佐剂完全混合,在兔子背部皮下多点注射，每点O. 2ml，下肢腹股沟O. 2ml ；2)—个月后,将O. 5ml的浓度为2mg/ml蛋白抗原与O. 5ml的弗氏完全佐剂完全混合均匀，在兔子背部皮下多点注射，每点O. 2ml，下肢腹股沟O. 2ml ；3)再一个月后，用O. 5ml的浓度为2mg/ml蛋白抗原耳静脉注射；4)再7天后，颈动脉放血采集，分离血清，加入浓度为lwt°/4t柳汞水溶液防腐，-70度保存，5)采用硫酸铵沉淀法纯化HSP70多克隆抗体，得到兔抗人HSP70多克隆抗体。
权利要求
1.一种人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条，其特征在于包括设在固定板(I)上依次相连的样品垫(2 )、金标垫(3 )、硝酸纤维素膜(4 )和吸水纸(9 );在硝酸纤维素膜(4 )上设有三条平行的第一检测线抗原(5)、第二检测线抗原(6)、第三检测线抗原(7)和一条质控线抗体(8);在金标垫(3)上设有金标抗原。
2.根据权利要求I所述的人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条，其特征在于所述固定板(I)为具有压敏胶的PVC板材，样品垫(2)为玻璃纤维膜，金标垫(3)为聚酯纤维膜。
3.根据权利要求I所述的人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条，其特征在于所述金标抗原为显色抗原，检测线抗原为捕捉抗原，显色抗原与捕捉抗原能同时和人HSP70抗体结合形成双抗原夹心；显色抗原和捕获抗原为原核重组表达的人HSP70蛋白。
4.根据权利要求I所述的人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条，其特征在于所述金标抗原用粒径为20nm-60nm的胶体金标记。
5.根据权利要求I所述的人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条，其特征在于所述质控线抗体为兔抗人HSP70多克隆抗体。
6.一种权利要求I所述的人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)用常规的柠檬酸三钠还原法制备均匀粒径为20nm-60nm的胶体金； (2)调节胶体金pH为8.5-9，然后加入显色抗原与其反应，其中显色抗原的浓度为O.02mg/ml，离心得沉淀，重悬沉淀，得金标抗原溶液，将金标抗原溶液喷印在聚酯纤维膜，晾干； (3)将捕捉抗原用稀释液稀释成浓度为lmg/ml的捕捉抗原溶液，用喷墨仪将捕捉抗原溶液在硝酸纤维素膜上喷划三条平行检测线，真空干燥； (4)将兔抗人HSP70多克隆抗体用稀释液稀释成浓度为O.5mg/ml的兔抗人HSP70多克隆抗体溶液，用喷膜仪将抗体喷线在硝酸纤维素膜上形成质控线，真空干燥； (5)按样品垫、金标垫、硝酸纤维膜、吸水纸顺序粘贴在固定板上，切条，装入塑料袋，干燥包装。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，离心的方法为反应液于5000xg离心30min，沉淀用lwt%牛血清白蛋白溶液重悬浮，反复2次；其中lwt%牛血清白蛋白溶液为IOmM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5，含lwt%的牛血清白蛋白。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中重悬沉淀的溶液为20mM的Tris-HCl缓冲溶液，pH为8. 5，含30wt%的海藻糖，lwt%的牛血清白蛋白，Iwt %的酪蛋白，体积浓度为 O. 01% 的 Tween-20，O. 02 wt % 的 NaN3。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述稀释液为IOmM的磷酸盐缓冲溶液，pH为7. 6，其中含10wt%的海藻糖，体积浓度为3%的甲醇。
全文摘要
本发明公开了属于免疫检测分析技术领域的一种人血液HSP70抗体胶体金标检测试纸条及其制备方法，此试纸条包括设在固定板上依次相连的样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜和吸水纸；在硝酸纤维素膜上设有三条检测线抗原和一条质控线抗体；在金标垫上设有金标抗原。金标抗原为显色抗原，检测线抗原为捕捉抗原，显色抗原与捕捉抗原能同时和人HSP70抗体结合形成双抗原夹心；显色抗原和捕获抗原为原核重组表达的人HSP70蛋白。本发明的试纸条用于人血液HSP70抗体检测，特异性高，结果易观察判断，20min内就能判读结果，具有良好的稳定性和重复性，操作简便，无需特殊仪器设备，适宜在现场检测基层医院和实验研究推广和应用。
文档编号G01N33/68GK102879584SQ201210365239
公开日2013年1月16日 申请日期2012年9月26日 优先权日2012年9月26日
发明者钱令嘉, 弓景波, 王新兴, 战锐, 杲修杰 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
