专利名称：一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方法
技术领域：
本发明涉及一种总菌数测定方法，具体涉及一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定 方法，该方法能快速检测食品加工企业各个车间设备表面单位面积的总菌数。
背景技术：
目前，国标法对生产设备上微生物总量的估计采用擦拭法、琼脂覆盖法或接触板法。 擦拭法通过人工擦拭设备表面将菌体采集而后选用合适的培养基进行培养，琼脂覆盖法和 接触板法则是通过培养基与生产设备的直接接触对菌体进行培养。但是，擦拭法因擦拭方 式的不同及取样人员用力强度的差异造成结果不够准确，影响结果的可比性。同时，由于 细菌以生物被膜这种特殊的形式生长于设备表面，且难于彻底剥离，人工擦拭的方法不足 以将生物被膜中的绝大多数微生物收集到。甚至可能因为棉拭本身吸附部分微生物，从而 降低了该方法的检测灵敏度。琼脂覆盖法和接触板法由于与设备表面接触时间短、作用力 弱，难以将生物被膜内包裹的各种菌吸附到培养基上，更不能准确反映实际菌量，造成较 大误差。这三种方法不能准确完全的反应生产中设备表面的总菌数状况。除此之外，传统 方法需要对菌体进行培养，耗时较长。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺点，提供一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方 法，这种方法无需培养，短时间内即可测出设备表面的总菌数，并且可以区分出活菌与死 菌，结果更准确，检测效率更高。
一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方法，其技术方案如下将内径为1.60-1.96 cm的橡胶圈下沿直接与平坦的设备表面接触，橡胶圈上再放置一个与其内径相同的圆柱形 硬塑料管，人工向下压塑料管，使橡胶圈、设备表面和硬塑料管形成一个密闭的可以盛装 液体的容器，向容器内部注入含0.5-1.5 %吐温-80的无菌PBS缓冲液5-10 mL，缓冲液pH 是7.35至7.40，将超声波细胞破碎仪的变幅杆插入液面以下0.5-1.3 cm，其中，处理功率 80-120 W，处理时间10-20 s，温度为室温，将菌悬液充分吸出，置于离心管中，滴入染色 剂500-1000 ^L，染色3-5min后，收集于灭菌注射器中，过滤，将菌体富集于黑色的聚碳 酸酯膜上，用无菌PBS缓冲液清洗2-3次，缓冲液pH是7.4，室温晾干后，于荧光显微镜 观察，在显微镜下随机取20-50个视野，拍照，分别计算照片中的菌数并求平均值，经换
3算得到生产设备表面单位面积的总菌数。
所述染色剂为吖啶橙(Acridine Orange， AO)和碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)的
混合物或DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚)和CTC (5-氰基-2， 3-联甲苯氯化四氮唑.的
混合物。
所述黑色的聚碳酸酯膜的孔径为0.22 um。
所述换算方法为设备表面单位面积的总菌数(个/cm2)=[(计数平均值/显微镜视野面 积)x滤膜总面积]/取样面积。
所述超声波细胞破碎仪为便携式超声波细胞破碎仪。
本发明的有益效果是可以在准确测定食品企业生产车间设备表面的微生物总量的同 时，縮短检测时间，及时反映生产加工链上的微生物生长情况，为保证及时有效的杀菌消 毒提供依据。
具体实施例方式
本发明将通过以下具体实施例作进一步说明。实施例中使用的超声波细胞破碎仪均为 德国Bandelin超声波破碎仪，型号HD2070;所用黑色的聚碳酸酯膜的孔径为0.22 um， 直径25mm，购自美国MILLIPORE。
磷酸缓冲液(PBS)的配制为137 mmol/LNaCl; 2.7 mmol/L KC1; 10 mmol/LNa2HP04; 2 mmol/L KH2P04;以HC1调节溶液pH。 实施例l
将内径为1.60 cm橡胶圈(取样面积为2 cm2)置于生产设备表面，要求设备表面平坦， 并且表面上部有充足的空间放置超声波变幅杆，如传送带、操作台面等。橡胶圈上再放置 一个与其内径相同的圆锥形硬塑料管，人工竖直向下压塑料管，使橡胶圈、设备表面和硬 塑料管形成一个密闭的可以盛装液体的容器，向容器内部注入5ml， pH为7.39，含0.5% 吐温-80的无菌PBS缓冲液，吐温-80起到促进微生物细胞悬浮的作用，将超声波细胞破碎 仪的变幅杆插入，使其浸入液面下0.5 cm。打开超声波开关，以保证菌体剥离最多，损失 最少为原则进行超声波处理。处理功率120W，处理时间16s，保持温度为室温,以免因温 度过高导致微生物死亡。用灭菌移液枪将处理液充分吸出，置于离心管中，滴入浓度为1 g/L 吖啶橙-0.5g/L碘化丙啶混合染色液500 pL，染色5min，吸入至灭菌注射器中，过滤，将 菌体富集于孔径为0.22 u m ,面积为490.6 mm2的黑色的聚碳酸酯膜上。用pH为7.4的 无菌PBS缓冲液清洗2次，室温晾干后，于荧光显微镜观察。在显微镜下随机取40个视 野，拍照，应用下述方法对生产设备表面单位面积的总菌数进行换算。换算方法如下设备表面单位面积的总菌数(个/cm2)=[(计数平均值/显微镜视野面积)x滤膜总面积]/取样 面积，
其中，计数平均值=113.3个/视野；显微镜视野面积=23121.9 ym2;滤膜总面积=490.6 mm2;取样面积=2 cm2;得到的总菌数为1.20x 106个/cm2 。 实施例2
将内径为1.96cm橡胶圈(取样面积为3 cm2)置于生产设备表面，要求设备表面平坦， 并且表面上部有充足的空间放置超声波变幅杆，如传送带、操作台面等。橡胶圈上再放置 一个与其内径相同的圆锥形硬塑料管，使其上端直径小于超声波换能器。将超声波细胞破
碎仪的变幅杆插入后，使换能器与硬塑料管接触，人工向下压换能器使塑料管下端挤压橡 胶圈下沿与设备表面紧密接触，形成一个密闭的可以盛装液体的容器。向容器内部注入10 ml含1%吐温-80的，pH为7.37无菌PBS缓冲液，吐温-80起到促进微生物细胞悬浮的作 用，将超声波细胞破碎仪的变幅杆插入，使其浸入液面下1.0cm。打开超声波开关，以保 证菌体剥离最多，损失最少为原则进行超声波处理。处理功率80W，处理时间10s，保持 温度为室温，以免因温度过高导致微生物死亡。用灭菌移液枪将处理液充分吸出，置于离 心管中，滴入浓度为1 g/L吖啶橙-0.5 g/L碘化丙啶混合染色液1000 ^L，染色3min，吸入 至灭菌注射器中，过滤，将菌体富集于孔径为0.22 ix m ，面积为4卯.6rm^的黑色的聚碳 酸酯膜上。用pH为7.4的无菌的PBS缓冲液清洗3次，室温晾干后，于荧光显微镜观察。 在显微镜下随机取20个视野，拍照，应用下述方法对生产设备表面单位面积的总菌数进 行换算。换算方法如下设备表面单位面积的总菌数(个/cm2)=[(计数平均值/显微镜视 野面积)x滤膜总面积]/取样面积。
其中，计数平均值=26.3个/视野；显微镜视野面积=23121.9 u m2;滤膜总面积=490.6 mm2;取样面积=3 cm2。得到的总菌数为1.86x10 5个/cm 2。 实施例3
将内径为1.96cm橡胶圈(取样面积为3 cm2)置于生产设备表面，要求设备表面平坦， 并且表面上部有充足的空间放置超声波变幅杆，如传送带、操作台面等。橡胶圈上再放置 一个与其内径相同的圆柱形硬塑料管，人工向下压塑料管，使橡胶圈、设备表面和硬塑料 管形成一个密闭的可以盛装液体的容器，向容器内部注入10 ml含1%吐温-80， pH为7.37 无菌PBS缓冲液，吐温-80起到促进微生物细胞悬浮的作用，将超声波细胞破碎仪的变幅 杆插入，使其浸入液面下1.3cm。打开超声波开关，以保证菌体剥离最多，损失最少为原 则进行超声波处理。处理功率100W，处理时间20s，保持温度为室温，以免因温度过高导致微生物死亡。用灭菌移液枪将处理液充分吸出，置于离心管中，滴入浓度为1 g/L吖 啶橙-0.5g/L碘化丙啶混合染色液lOOOpL，染色5min，吸入至灭菌注射器中，过滤，将菌 体富集于孔径0.22 y m ，面积为490.6 mm2的黑色的聚碳酸酯膜上。用pH为7.4的无菌 的PBS缓冲液清洗3次，室温晾干后，于荧光显微镜观察。在显微镜下随机取40个视野， 拍照，应用下述方法对生产设备表面单位面积的总菌数进行换算。换算方法如下设备表 面总菌数(个/cm2)=[(计数平均值/显微镜视野面积)x滤膜总面积]/取样面积。
其中，计数平均值=38.9个/视野；显微镜视野面积=23121.9 u m2;滤膜总面积=490.6 mm2;取样面积=3 cm2。设备表面单位面积的总菌数为2.75><105个/cm 2。 实施例4
将内径为1.78cm橡胶圈(取样面积为2.5cm2)置于生产设备表面，要求设备表面平 坦，并且表面上部有充足的空间放置超声波变幅杆，如传送带、操作台面等。橡胶圈上再 放置一个与其内径相同的圆柱形硬塑料管，人工向下压塑料管，使橡胶圈、设备表面和硬 塑料管形成一个密闭的可以盛装液体的容器，向容器内部注入8ml含1.5%吐温-80的，pH 为7.36无菌PBS缓冲液，吐温-80起到促进微生物细胞悬浮的作用，将超声波细胞破碎仪 的变幅杆插入，使其浸入液面下1.2 011。打开超声波开关，以保证菌体剥离最多，损失最 少为原则进行超声波处理。处理功率120W，处理时间14 s，保持温度为室温，以免因温 度过高导致微生物死亡。用灭菌移液枪将处理液充分吸出，置于离心管中，滴入浓度为1 g/L 吖啶橙-0.5 g/L碘化丙啶混合染色液800 pL，染色4min，吸入至灭菌注射器中，过滤，将 菌体富集于孔径为0.22 um ，面积为490.6 mm2的黑色的聚碳酸酯膜上。用pH为7.4的 无菌的PBS缓冲液清洗2次，室温晾干后，于荧光显微镜观察。在显微镜下随机取40个 视野，拍照，应用下述方法对生产设备表面单位面积的总菌数进行换算。换算方法如下 设备表面单位面积的总菌数(个/ cm2)=[(计数平均值/显微镜视野面积)x滤膜总面积]/
取样面积。
其中，计数平均值=77.8个/视野；显微镜视野面积=23121.9 w m2;滤膜总面积=490.6 mm2;取样面积=2.5 cm2。得到的总菌数为6.61x105个/cm2。
权利要求
1、一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方法，其特征在于将内径为1.60-1.96cm的橡胶圈下沿直接与平坦的设备表面接触，橡胶圈上再放置一个与其内径相同的圆柱形硬塑料管，人工向下压塑料管，使橡胶圈、设备表面和硬塑料管形成一个密闭的可以盛装液体的容器，向容器内部注入含0.5-1.5％吐温-80的无菌PBS缓冲液5-10mL，缓冲液pH是7.35至7.40，将超声波细胞破碎仪的变幅杆插入液面以下0.5-1.3cm，其中，处理功率80-120W，处理时间10-20s，温度为室温，将菌悬液充分吸出，置于离心管中，滴入染色剂500-1000μL，染色3-5min后，收集于灭菌注射器中，过滤，将菌体富集于黑色的聚碳酸酯膜上，用无菌PBS缓冲液清洗2-3次，缓冲液pH是7.4，室温晾干后，于荧光显微镜观察，在显微镜下随机取20-50个视野，拍照，分别计算照片中的菌数并求平均值，经换算得到生产设备表面单位面积的总菌数。
2、 根据权利要求1所述的一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方法，其特征在于 所述染色剂为吖啶橙和碘化丙啶的混合物或DAPI和CTC的混合物。
3、 根据权利要求1所述的一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方法，其特征在于 所述黑色的聚碳酸酯膜的孔径为0.22 um。
4、 根据权利要求1所述的一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方法，其特征在于 所述换算方法为设备表面单位面积的总菌数=[(计数平均值/显微镜视野面积)x滤膜总面 积]/取样面积。
全文摘要
本发明公开了一种基于超声波及荧光观察的总菌数测定方法，属于食品微生物检测领域。该方法用一定尺寸的圆形橡胶圈与设备表面组合成密封容器，以超声波空化效应对设备表面的生物被膜进行取样，荧光染色后过滤，显微镜下拍照计数。此法用于对食品生产车间内加工设备表面总菌数的测定，误差�。氖倍蹋笆庇行У纳本咎峁┮谰�。
文档编号G01N21/77GK101482512SQ20091007803
公开日2009年7月15日 申请日期2009年2月10日 优先权日2009年2月10日
发明者彤 刘, 李春雷, 杨葆华, 陈晶瑜, 韩北忠 申请人:中国农业大学
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