专利名称：侦测致死细胞的方法与材料及其应用的制作方法
技术领域：
本发明为提供一种确认与检测致死细胞存在的方法与材料，无论是何种原因所造成的癌症，经由检测该癌症病患中致死细胞的存在，可确认该病患的疾病状态与治疗反应。
背景技术：
Hanahan 及 Weinberg 在 2000 年(Cell，2000，100 :57_70)发表文献中，表列出多种癌症的标志(hallmarks)，但目前针对这些理论所开发出来的临床治疗方法，在过去50年都无法完全的治愈癌症病患。因此，近年来许多研究开始质疑这些无法治愈的癌症，它的癌细胞与表现的标帜(Marker)，仅是这些疾病的最终产物。越来越多证据显示骨髓衍生干 / 源祖细胞(bone marrow-derived stem/progenitor cells, BMDSC)会扩散到全身，并且在发展中的肿瘤基质内快速增加,这种现象的产生如伤口过度愈合时,该部位会聚积生长因子、化学激素、细胞因子、及组织再造因子，促使组织的微环境改变进而逐渐破坏器官，导致器官衰竭，并逐渐的造成人体的免疫受到抑制、细胞凋亡抑制、上皮细胞恶性变质、增生、生长、侵袭、及癌细胞移转扩散等状况。然而，骨髓衍生干/源祖细胞包含多种类型的干/源祖细胞及其衍生物，例如纤维母细胞与巨噬细胞，这些特殊的骨髓衍生干/源祖细胞在癌症发展及病程上所扮演的角色仍然不是非常的确定，因此利用骨髓衍生干/源祖细胞在无法治愈的癌症检测与治疗仍有许多的挑战。(Bingle et al，J Pathol, 2002,196 254-265 ；De Wever and Mareel, J Pathol，2003，200 :429-447 ；Condeelis and Pollard,Cell，2006，124 :263-266 ;Direkze and Alison，Hematol Oncol，2006，24 :189-195 ;Kaplanet al, Trends Mol Med,2007,13 :72-81 ；Karnoub et al, Nature，2007，449 :557-563 ；Loberg et al, CA Cancer J Clin,2007,57 :225-241 ；Massberg et al, Cell，2007，131 994-1008 ；Biswas et al, J Immunol，2008，180 :2011-2017 ；Chantrain et al, CancerMicroenviron，2008，I :23-35 ；Germano et al，Cytokine，2008，43 :374-379 ;Laird et al,Cell，2008，132 :612-630 ；Le Bitoux and Stamenkovic，Histochem Cell Biol，2008，130 :1079-1090 ；Takaishi et al, J Clin Oncol，2008，26 :2876-2882 ;Aggarwal and Gehlot，Curr Opin Pharmacol, 2009,9 :1-19 ；Gonda et al,Cell Cycle，2009，8 :2005-2013 ；Joyceand Pollard, Nat Rev Cancer，2009，9 :239-252 ；Mishra et al, Cancer Res，2009，69 1255-1258 ;Psaila and Lyden, Nat Rev Cancer，2009，9 :285-293)。不过，传统的作法已经受到质疑，因此，除了过去五十年来，癌症研究着重在癌细胞本身的传统分子癌肿瘤学之夕卜，细胞与临床肿瘤学研究，特别是系统肿瘤研究亦应同时受到重视。脯氨酸指导的蛋白激酶Fa(proline-directed protein kinase，PDPK Fa)/肝糖合成酶激酶-3a (GSK-3 a )被认为是一种特定的蛋白质去磷酸酶活化因子A(Vandenheedeet al，JBiol Chem，1980，255 :11768-11774 ;Yang et al, J Biol Chem，1980，255 :11759-11767 ;Woodgett，EMBO J，1990，9 :2431-2438)。发明人过去的研究中进一步证实PDPKFA/GSK-3a是具有多受质/多功能TOPK的特征，这些特征与各型癌细胞抗细胞凋亡、抗分化、肿瘤生成、侵犯及耐药性相关(Lee et al, J Cell Biochem，1995，58 :474-480 ；Yang et al, J Cell Biochem, 1995, 59 :143-150 ；Yang et al, J Cell Biochem, 1996,61 238-245 ；Hsu et al, Br J Cancer, 2000，82 :1480-1484 ;Hsu et al, Cancer, 2000,89 1004-1011 ；Yang et al, Clin Cancer Res, 2000,6 1024-1030 ；Hsu et al, Cancer, 2001,92 :1753-1758 ；Hsu et al, Int J Cancer, 2001,91 :650-653 ；Chung et al, Cancer, 2002,95 :1840-1847 ；Hsueh et al, Cancer, 2002,95 :775-783 ；Fu and Yang, Anti Cancer Res,2004,24 :1489-1494 ；Yang, Curr Cancer Drug Targets, 2004,4 :591-596 ；Yang, Drug NewsPerspect,2005,18 :432-436 ；Hsu et al, J Clin Oncol，2006，24 :3780-3788)。遗憾的是，过去roPK Fa/GSK-3 a的癌症研究，主要都是针对上述的癌细胞本身或癌前期细胞。故此讯息传导分子对癌症的影响，仍需要持续的研究才能确认。
发明内容
与先前roPK FA/GSK-3 a针对癌症的主要研究相比，即上述着重于传统癌细胞的研究，本发明主要为检测这个TOPK讯息传导分子，特别是在骨髓衍生干/源祖细胞(BMDSC)内，骨髓衍生干/源祖细胞是能够自动寻向至发展中的肿瘤基质内并快速增加，就如前述中过度愈合的伤口一样。根据此方法，骨髓衍生干/源祖细胞中roPKFA/GSK_3a的异常表达(expression)，对于监控疾病状态与治疗反应，以及确认各器官相关的肿瘤为可治愈或不可治愈，扮演决定性与指导性的角色。如果癌症病患具有roPKFA/GSK_3a异常表达的骨髓衍生干/源祖细胞，则不论病因为何，都不易治愈。因此，本发明将有roPKFA/GSK_3a异常表现的骨髓衍生干/源祖细胞统称为“致死细胞”。与针对癌细胞的研究相比，本发明提供侦测致死细胞的方法与材料，检测此具有攻击性的细胞对于预防癌症、治疗以及使用具广泛的应用。例如，罹患早期癌症的病患若无致死细胞，则可通过局部切除治愈。相反的，即使是罹患早期癌症的病患，体内有致死细胞，则手术亦无法治愈。因此，本发明提供监控治疗反应的方法与材料，以协助医师更积极与适当的做出治疗决定。此处致死细胞为可应用于全身的预测因子，对于非常早期的系统性失调包括造血、止血、体内稳态，以及与免疫系统相关的系统性免疫抑制、感染、阻塞、血栓以及由骨髓缺陷引发多重器官衰竭等非常有用。具体而言，致死细胞于监控不同种类的癌症病患状态与治疗反应是可信赖的预测因子。另一方面，PDPKFA/GSK-3a或许不需为最具效果且理想的药物筛选标的，然而，将此讯息传导分子作为一种新的探针，可侦测并离析出监控治疗反应与癌症进展的致死细胞。因此本发明所阐述的致死细胞一但被分离出来，可以进一步以蛋白质体学及基因体学的方法，发展更多可用来筛选与评估治疗性药物，为各类型的癌症患者提供更多更有效且更完整的预防与治疗方法。因此，本发明的目的之一为，提供一种可于受试者的骨髓衍生干/源祖细胞中侦测到TOPK FA/GSK-3 a表现的方法，该现象代表有致死细胞的存在，本方法包括取得受试者的生物性样本；判断该生物性样本中骨髓衍生干/源祖细胞的I3DPK Fa/GSK-3 a的表达(expression)情形；其中骨髓衍生干/源祖细胞的细胞内TOPK FA/GSK-3 a发现异常聚积，表示此骨髓衍生干/源祖细胞为致死细胞。于一实施例中，PDPK Fa/GSK-3 a蛋白质表现通过使用对roPKFA/GSK_3a专一的抗体，以免疫试验方法进行测定。生物性样本为骨髓、血液、组织样本、肿瘤，腹水或胸膜积水的一种或多种。另一目的，为提供一种于生物样本中侦测致死细胞的诊断试剂盒(diagnostickit)，包括至少一评估样本中roPKFA/GSK-3 a蛋白质表现试剂，以及评估致死细胞存在的操作说明，包装于一容器中。更多侦测用试剂也可能包含于其中。又一目的为，提供一种监测多种类癌症病患的治疗反应与疾病状态的方法，包括取得所述病患的生物性样本；判断该生物性样本中I3DPK Fa/GSK-3 a表达，PDPKFA/GSK_3a于病患的细胞内异常聚积状况。一些实施例中，PDPK Fa/GSK-3 a蛋白质的表现程度是通过使用对roPKFA/GSK_3a专一的抗体，以免疫试验方法进行测定。生物性样本可为骨髓、血液、组织样本、肿瘤、腹水或胸膜积水。如果必要，如同Moioli等人(PLoS ONE, 3 e3922,2008)所述，这些细胞可通过特殊磁珠或流式细胞分选仪分离出来，用以侦测 高度表现roPK Fa/GSK-3 a的致死细胞。了解以下详细说明及图式与实例后，本发明的目的及特征将全然显而易见。
图I是急性骨髓性白血病(AML)患者的骨髓衍生干/源祖细胞图，其中图IA是一急性骨髓性白血病患者在骨髓中发现有致死细胞的图；图IB是另一急性骨髓性白血病患者在骨髓中发现有致死细胞的图；图IC是在骨髓中没有致死细胞的急性骨髓性白血病患者的图；如果在骨髓中发现有致死细胞，易并发肺炎及/或骨髓移植失败，如果没有致死细胞，接受治疗或骨髓移植后具有良好预后；图2A是具有致死细胞的肺癌病患和没有致死细胞的肺癌病患的未发病存活率对照图；图2B是具有致死细胞的肺癌病患和没有致死细胞的肺癌病患的整体存活率对照图；图3A是早、晚期肺癌病患具有致死细胞的患者和没有致死细胞的患者的未发病存活率对照图；图3B是早、晚期肺癌病患具有致死细胞的患者和没有致死细胞的患者的整体存活率对照图；图3C是肺癌第一期病患具有致死细胞和没有致死细胞的患者的未发病存活率对照图；图3D是肺癌第一期病患具有致死细胞和没有致死细胞的患者的整体存活率对照图；图4A是罹患不同种类癌症的具有致死细胞和没有致死细胞的患者的未发病存活率对照图；图4B是罹患不同种类癌症的具有致死细胞和没有致死细胞的患者的整体存活率对照图。
具体实施例方式为清楚揭露，而非限定，本发明详细描述细分为以下次段落。A.定义除非有其它定义，在此所用的技术及科学词汇，如为本发明所属技术领域中具有一般人了解具有相同意义。在此指称的所有专利、申请案、公开申请案及其它应用，以及基因库登录号皆以参考文献整合。本章节提出的定义与其它专利、申请案、公开申请案及其它在此引用的参考文献提出的定义相反或不一致，以本章节提出的定义为主。如本发明所使用，“一”是指“至少一个”或“一个或多个。如本发明所使用，术语“PDPK FA/GSK_3a ”指多受质/多功能的脯氨酸指导的蛋白激酶Fa，亦为已知的肝糖合成酶激酶3 a (ffoodgett, EMBO J, 1990,9 :2431-2438 ；Yang,Curr Cancer Drug Targets，2004，4 :591-596)。此蛋白的基因库登录号为 AAD11986 (SEQID NO. I)及 AAH27984 (SEQ ID NO. 2)。如本发明所使用，术语”生物样本”指来自一生物来源的任何样本，包括但并未限制于骨髓、血液、组织样本、肿瘤、腹水或胸膜积水。如本发明所使用，术语”抗体”指包括必要的变异区序列以专一性键结一抗原决定位的分离或重组结合试剂。因此，抗体是表现生物活性的任何型式的抗体或抗体片段，例如，结合特定的目标抗原。因此，只要抗体表现所要求的生物活性，例如专一性结合roPKFa/GSK-3 a时，用于被广泛认知及特定地涵盖单株抗体(包括全长单株抗体)、多株抗体、人类抗体、拟人化抗体、嵌合抗体、奈米抗体、双价抗体、多重专一抗体(例如双特异抗体)及包括但不限定于scFv、Fab及Fab2的抗体片段。如本发明所使用，术语“专一性抗体”指专一抗 PDPK FA/GSK-3 a 抗体。如本发明所使用，术语“致死细胞”指细胞内有roPKFA/GSK_3a异常聚积的骨髓衍生干/源祖细胞。如本发明所使用，术语“同时在细胞质与细胞核表现聚积”指roPK Fa/GSK-3 a聚积于骨髓衍生干/源祖细胞的细胞质或细胞核或同时于细胞质与细胞核内表现聚积。如本发明所使用，术语“大量表现”、“大量聚积”指骨髓衍生干/源祖细胞内有PDPKFa/GSK-3 a 异常聚积。如本发明所使用，术语“疾病状态不佳”指带有致死细胞的癌症患者经治疗后其复发机率高于未带有致死细胞的癌症患者，或其存活率低于未带有致死细胞的癌症患者。如本发明所使用，术语“治疗反应不佳”指带有致死细胞的癌症患者经治疗后其复发机率高于未带有致死细胞的癌症患者，或其存活率低于未带有致死细胞的癌症患者。除非特别说明，对熟悉所属技术领域、本发明所使用的实例、生化及临床病理学的常用技术，所有在此使用的术语具有与一般人知识相同的意义。B.用以侦测致死细胞的方法及诊断试剂盒一方面，有细胞内roPKFA/GSK_3 a异常聚积的骨髓衍生干/源祖细胞提供一鉴别并侦测致死细胞的工具。于另一方面，于一生物性样本中确认致死细胞，对于监测多种癌症病患的治疗反应与疾病状态非常有帮助。因此，本发明目的之一即提供一种侦测受试者具有致死细胞表现的方法，该方法包括由所述受试者获得一生物样本，测定所述样本骨髓衍生干/源祖细胞内PDPKFA/GSK-3 a表达程度，其中该受试者骨髓衍生干/源祖细胞内H)PK FA/GSK-3 a发现异常聚 积，表示此骨髓衍生干/源祖细胞为“致死细胞”。在某些实施例中，PDPK Fa/GSK-3 a的表达通过分析TOPK FA/GSK_3 a蛋白含量而进行测定，例如使用对roPK Fa/GSK-3 a专一抗体的免疫试验法。生物样本可为骨髓、血液、组织样本、肿瘤、腹水或胸膜积水。
本发明的另一目的是提供一种用以测定一生物样本中致死细胞存在的诊断试剂盒(kit)，包括用以测定所述样本骨髓衍生干/源祖细胞中roPK FA/GSK-3 a表现的一试齐U，以及一辅助性试剂，例如生理食盐水、缓冲液等一般实验所需的试剂，用以辅助让该抗骨髓衍生干/源祖细胞抗体与该抗I3DPK FA/GSK-3 a抗体与细胞结合。任何侦测roPK Fa/GSK-3 a于骨髓衍生干/源祖细胞中异常表达的适当装置皆可能被使用。该表现可通过评估生物样本骨髓衍生干/源祖细胞中的蛋白质含量而测定。例如，使用对roPK Fa/GSK-3 a专一抗体的免疫试验法。适当方法包括但不限定于免疫组织化学分析、免疫细胞化学分析、以及流式细胞分析。利用免疫组织化学染色技术，一般利用脱水及固定方式来制备一细胞样本，再与耦合基因产物专一的标帜抗体进行反应，该标帜物通常是视觉上可侦测的，例如酵素标帜物、荧光标帜物、冷光标帜物及其类似物。根据一实施例，由受试者取得组织样本，并且根据传统组织固定技术，包埋该样本再切片为3-5 ym，进行固定及干燥。固定液可包括福尔马林。用以固定切片的包埋液为石蜡。样本可储存于此条件下。去石蜡及再水合后，样本与对roPKFA/GSK_3a专一抗体的免疫试剂接触。抗体包含多株或单株抗体。抗体包括完整抗体或专一性结合roPKFA/GSK_3 a蛋白的抗体片段。适当的多株抗血清或其它抗体可通过roPKF/GSK-3 a蛋白或该蛋白的合适片段寄主动物进行制备，并依据本技术领域一般人所知的技术收集及纯化抗血清。专一地与roPKFA/GSK_3 a反应的单株或多株抗体，单株抗体较佳，可由本领域所熟知的方法制作。参阅=Harlow及Lane (1988)《抗体实验室操作手册》，冷泉港实验室，及Goding (1986)《单株抗体原理及应用》，第二版，学术出版社，纽约。而且，重组蛋白可由本领域所知的方法制作，包括但不限定美国专利号4，816，567所述方法，或由商业上获得。抗体直接或间接地带有一合适侦测标帜物。侦测标帜物可结合至二级抗体，如与一级抗体结合的羊抗兔IgG。标帜多多肽及抗体通常藉共价或非共价结合一提供侦测信号的物质。合适的标帜物包括但不限定于放射性核酸、酵素、受质、辅助因子、抑制剂、荧光试剂、冷光试剂、磁性粒子及类似物。任何合适的方法可由一受试者获得一生物样本。生物样本可为骨髓、血液、组织样本、肿瘤、腹水或胸膜积水。监测多种癌症病患的治疗反应与疾病状态的套组(kit)包括至少一容器，包含一用以测定骨髓衍生干/源祖细胞中的roPK Fa/GSK-3 a表现试剂，及评估一生物样本中的骨髓衍生干/源祖细胞是否为致死细胞的印刷操作说明。如本发明所使用，术语“试剂”指任何完成本发明提供方法的化合物、组合物或生物试剂(即样本、液体、或细胞“剂量”、抗体等)，包括但不限定于用于roPK Fa/GSK-3 a的抗体、缓冲液、及分析用载体。C.实施例除了其它在特定实施例指出，所有免疫组织化学分析、免疫表现型分析、免疫细胞化学分析及统计分析以下列方法进行。专一抗roPKFA/GSK_3 a抗体的生产、鉴定及特征。
对应于TOPK Fa/GSK-3 a氨基酸序列471-483的羧基终端区域的肽QSTDATPTLTNSS由肽合成仪合成(型号9050，Milligen, Bedford,马里兰州)。根据Reichlin(1980)描述的过程，为了便于将肽耦合到牛血清蛋白，利用戊二醛作为交互连接器，将半胱氨酸残基加至NH2端。经过亲和纯化，产物可被roPKFA/GSK-3 a的氨基酸471-483的C端肽阻断，实验结果均证明此抗PDPK Fa/GSK-3 a抗体具有免疫的专一性，因此后续的实验将以此抗体作为检测材料。免疫组织化学分析 以福尔马林固定、石蜡包埋含有最多肿瘤细胞的肿瘤的组织切片(5i!m)于二甲苯中脱蜡，接着于浓度渐减的乙醇中水合。内生性过氧化酶以3%过氧化氢阻断(blocking)，再以牛血清蛋白阻断5分钟。再将玻片培养于0.05M Tris缓冲液(pH 7.4)稀释的抗roPKFA/GSK-3a抗体(2 y g/mL)中，于4°C作用16小时，再与超级增强剂(superenhancer, Super Sensitive Non-Biotin Detection System, BioGenex, San Ramon, CA)于室温培养20分钟，并以polymer-HRP(Super Sensitive )标帜物培养30分钟。免疫染色法系以DAB (3-3，diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色，呈现红掠色。在抑制酵素反应后，将玻片在室温下培养于DS-enhancer (Zymed, San Francisco, CA) 5分钟，以防止两种染色间交互作用。再将玻片于室温下培养于⑶34抗体中I小时。清洗后，将玻片在室温下培养于抗小鼠碱性磷酸酶30分钟。使用BCIP/NBT溶液以显现键结的抗体，结果呈现蓝色。以甲基绿溶液对比染色切片，结果呈现绿色。WI3DPK FA/GSK-3a及⑶34共同染色的细胞呈紫黑色。免疫细胞化学分析于室温、700rpm下将细胞离心(Kubota 5200，日本)3分钟，使细胞贴附在涂覆聚离氨酸(聚赖氨酸，polylysine)的玻片上。染色前，细胞聚落(cytospots)以3. 7%三聚甲醛固定15分钟，并以0.2% TritonX-100处理90秒。内生性过氧酵素(内源性过氧化物酶，endogenous peroxidase)将被3%过氧化氢阻断，再以胎牛蛋白(牛血清白蛋白，bovine serum albumin)阻断10分钟。将玻片培养于4°C、稀释于0. 05M Tris缓冲液(pH7. 4)的抗 PDPK Fa/GSK-3 a 抗体(2 u g/mL)中 16 小时,再与超级增强剂(super enhancer,Super Sensitive Non-Biotin Detection System, BioGenex, San Ramon, CA)于室温培养20分钟，另以polymer-HRP (Super Sensitive )标帜物培养30分钟。免疫染色以DAB (3，3’ diaminobenzidine tetrahydrochloride)呈色,为红棕色。抑制酶反应后，将玻片于室温下培养于DS-enhancer (Zymed, San Francisco, CA) 5分钟，以防止两种染色间交互作用。再将玻片于室温下培养于⑶34、vimentin、⑶68或a-SMA抗体中I小时。清洗后，将玻片在室温下培养于抗小鼠碱性磷酸酶30分钟。使用BCIP/NBT溶液以显现键结的抗体，呈现蓝色。以甲基绿溶液对比染色玻片，呈现绿色。以roPKFA/GSK-3 a及⑶34共同染色的细胞呈紫黑色。统计分析本发明的统计分析中，样本区分为具有与不具有致死细胞存在两个组别。整体存活率系从诊断日至死亡日或后续治疗日止进行计算。未发病存活率系从诊断日至复发日、转移日、死亡日或后续治疗日止进行计算。Kaplan-Meier方法系用以测定存活机率，而对数级距试验系用以比较组间存活曲线。影响系以Cox比例风险模型进行分析。罗吉斯回归系用以计算治疗反应中出现致死细胞的风险。P < 0. 05被认为具统计上地显著意义。本研究由台湾国家科学委员会核准研究计划及经费并在知情同意书及该机构监督伦理委员会核准下执行。以下实施例用以说明但非限定本发明。
实施例I、急性骨髓性白血病患(Acute myelogenous leukemia ;AML)骨髓衍生干/源祖细胞内的roPK Fa/GSK-3 a异常表达与积极治疗后仍预后不良的关联性PDPK FA/GSK-3 a的异常表达经常于AML的骨髓中发现，透过免疫表现分析显示，仅有少数具有I3DPK FA/GSK-3 a异常聚积的⑶34+造血干/前驱细胞及⑶34—间质干/前驱细胞统称为骨髓衍生干/源祖细胞(Moioli et al. PLoS ONE, 2008, 3 e3922)(图IA与B)，会在不良预后的AML病患骨髓中经常被发现，而超过75%这种类型的病患甚至在接受积极治疗后仍死亡。在清楚的对比下，超过80%在骨髓并未出现此种类型的骨髓衍生干/源祖细胞的AML病患(图1C)在接受治疗后痊愈。因此透过初始独立世代研究发现，AML病患若带有致死细胞，如图IA与B，在治疗后将较无起色。AML病患若无致死细胞，如图1C，在治疗后将使病情有较佳结果。实施例II、若肺癌患者带有致死细胞，则疾病状态不佳且对治疗反应不佳肺癌是世界癌症死亡最常见原因。尽管近来治疗进步，肺癌患者的预后仍不甚满意。大多数病患即使在肿瘤完全切除后仍会复发，且最后因疾病转移而死亡。目前肺癌的肿瘤-淋巴结移转分期系统(TNM, tumor-node-metastasis system)被广泛运用以预测预后状况。然而，同一期肺癌不同病患间的预后，尤其是疾病早期是多样化的，且目前尚未针对每一病患建立适当的个人化医疗治疗计划。因此，应该找出更多影响肿瘤进展与转移的生物性功能之可信赖生物性标帜，以于同期病患中鉴别出最可能有不良预后的次群组。156位肺癌病患，皆具有完整临床病理数据以及可作为致死细胞研究的样本。病患的临床病理资料研究统整如表I。在156位肺癌病患中(100位男性与56位女性)，其年龄分布在23到82岁之间(平均62岁)，平均的肿瘤大小为3. 9±2. 3公分(平均值土标准偏差值；中位数为3公分)。其中有72位(46. 2% )病患有吸烟史。在组织学型态上，117位病患(75. 0% )为肺腺癌，36位病患(23. 1% )为鳞状细胞癌，而3位病患(I. 9% )为大细胞肺癌。以分化的程度做分级，有42位病患(26.9%)为分化良好，65位病患(41.7%)为中等分化，以及49位病患(31. 4% )为分化不良。依据病理t的分期，分类为Tl者有50位病患(32. 1% )，T2有59位病患(37. 8% )，T3有30位病患(19. 2% )以及T4有17位病患(10.9%)。在淋巴结转移的程度上，29位病患(18.6% )在NI，21位病患(13.5%)在N2，而12位病患(7. 7% )在N3。94位病患(60. 3% )则无淋巴结转移。肺癌病患分为
I期、II期、III期以及IV期，分别有69位病患(44. 2%),23位病患(14. 7%),55位病患(35. 3% )以及9位病患(5. 8% )。156位肺癌患者五年未发病的存活率以及整体存活率，分别为36. 6%以及45. 3%0表I.肺癌病患特性
权利要求
1.一种侦测受试者中具有致死细胞的方法，其包括 提供一受试者之一生物性样本；以及 检测所述生物性样本中骨髓衍生干/源祖细胞内是否有roPK FA/GSK-3α的大量表现； 其中，若所述生物性样本骨髓衍生干/源祖细胞内具有roPK FA/GSK-3 α的大量表现，表示此骨髓衍生干/源祖细胞为致死细胞。
2.如权利要求I所述的方法，其中所述roPKFa/GSK-3 α的表现是通过评估TOPKFA/GSK-3 α的蛋白质含量来判断。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述TOPKFa/GSK-3 α蛋白质的含量是通过使用对PDPK FA/GSK-3 α专一抗体的免疫试验方法作确认。
4.如权利要求I所述的方法，其中所述roPKFa/GSK-3 α的大量表现是指TOPK Fa/GSK-3 α同时在细胞质与细胞核发现聚积。
5.如权利要求I所述的方法,其中所述生物性样本为骨髓、周边血液、组织样本、肿瘤，腹水或胸膜积水。
6.如权利要求I所述的方法，其中所述骨髓衍生干/源祖细胞为造血干/源组细胞、间质干/源组细胞中的一种或多种。
7.一种监测癌症病患疾病状态与治疗反应的方法，其包括 提供一癌症病患之一生物性样本；以及 检测所述生物性样本中骨髓衍生干/源祖细胞内是否有TOPK Fa/GSK-3 α的大量表现； 其中，若所述生物性样本中的骨髓衍生干/源祖细胞内具有roPKFA/GSK-3 α大量聚积，则可预测所述癌症病患的疾病状态与治疗反应不佳。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述治疗反应为手术，化学治疗，放射线治疗，荷尔蒙疗法或其类似方法中的一种或多种。
9.如权利要求7所述的方法，其中所述癌症病患为膀胱癌、乳癌、脑癌、胆管癌、子宫颈癌、大肠直肠癌、子宫内膜癌、食道癌、胃癌、肝癌、肺癌、鼻咽癌、口腔癌、卵巢癌、胰脏癌、摄护腺癌与肾脏癌、血癌或淋巴癌中的一种或多种。
10.一种用于生物样本中侦测致死细胞的套组，包括 抗骨髓衍生干/源祖细胞抗体； 抗PDPK FA/GSK-3 α抗体；以及 辅助性试剂，用以辅助所述抗骨髓衍生干/源祖细胞抗体与所述抗roPKFA/GSK-3 α抗体与细胞结合。
11.一种方法，用来筛选一测试化合物作为以致死细胞为目标的潜力药物，所述方法包括 使所述测试化合物与致死细胞接触；以及 确定所述检体中I3DPK FA/GSK-3 α的表现； 其中所述检体中，异常细胞内roPK FA/GSK-3 α的聚积降低，指出所述测试化合物是以致死细胞为目标的潜力药物。
12.如权利要求11所述的方法，所述测试化合物包括一种天然产物的提取物。
13.如权利要求11所述的方法，所述测试化合物包括一组合化学库里的一成员。
全文摘要
本发明为提供一种检测致死细胞存在的方法与材料，该检测方法可确认各类癌症病患中致死细胞的存在，并确认该病患的疾病状态与治疗的反应。
文档编号G01N33/573GK102625849SQ201080038981
公开日2012年8月1日 申请日期2010年9月1日 优先权日2009年9月2日
发明者杨孝德 申请人:杨孝德
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