专利名称：人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型属于涉及生物技术领域，具体而言，涉及人胃泌素酶联免疫吸附测定(ELI SA)试剂盒。
背景技术：
胃泌素(GT)是一种重要的胃肠激素，它主要由G细胞分泌。G细胞是典型的开放型细胞，以胃窦部最多，其次是胃底、十二指肠和空肠等处。人胰岛的D细胞亦能分泌胃泌素，1978年Rehfeld证明人的脑脊液和某些脑组织中存在胃泌素，胃泌素几乎对整个胃肠道均有作用，它可促进胃肠道的分泌功能，能刺激ECL细胞分泌组胺，间接促进壁细胞分泌盐酸；促进胃窦，胃体收缩，增加胃肠道的运动，同时促进幽门括约肌舒张，故其主要作用是促进胃排空；促进胃及上部肠道粘膜细胞的分裂增殖；促进胰岛素和降钙素的释放。胃泌 素还能刺激胃泌酸腺区黏膜和十二指肠黏膜的DNA、RNA和蛋白质合成，从而促进其生长。产物以氨基酸的长度分成五种GT-71、GT-52、GT-34、GT-17、GT-14。GT-14有14个氨基酸，而14个氨基酸就有全部的生理活性。近年发现，颊粘膜、舌、食道、中枢神经系统也含有胃泌素。在临床上能观察到，切除胃窦的病人，血清胃泌素水平下降，同时可发生胃粘膜萎缩；在患有胃泌素瘤的病人，血清胃泌素水平很高，且多伴有胃粘膜的增生、肥厚。血清胃泌素是胃泌素瘤诊断和疗效监测的重要指标。血清胃泌素测定是一种特殊的诊断手段，正常人和消化性溃疡病患者空腹血清胃泌素为50 150pg/ml，本病常大于500pg/ml，甚者高达1000pg/ml。当空腹血清胃泌素大于1000pg/ml，伴有相应的临床症状者，可确诊为本病。恶性贫血患者的空腹血清胃泌素显著增高，平均值为1000pg/ml，甚至高达10000pg/ml。其他如胃窦G细胞增生、肾功能衰竭、甲状腺功能亢进、萎缩性胃炎、残留胃窦及H2受体阻断剂、酸泵抑制剂的治疗，均可使血清胃泌素增高，应注意鉴别。通过胃液分析和血清胃泌素的测定，约95%以上的患者可确立诊断。目前报道的GT定量测定方法主要是放射免疫法。放射免疫分析技术的灵敏度高、特异性强、精密度好，常用于各种激素、微量蛋白质、肿瘤标志物和药物等微量物质的测定。但由于放射污染和�：ΓＳ煤怂匕胨テ诙蹋约梁形榷ㄆ诓怀さ戎疃嗖蛔悖琑IA将逐渐被取代。酶联免疫吸附测定(ELISA)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。利用抗原-抗体之间特异性的免疫反应识别生物液体中的靶分子，并利用酶-底物的显色反应定量的反应待测样本中靶分子的含量。它是基于RIA的基础上发展起来的，ELISA在继承了 RIA的高灵敏度、精密度好的特点，同时ELISA还克服了 RIA的一些缺点，如放射污染、试剂盒稳定期不长等，现广泛用于生物样本的定量检测试验中。制备高质量的ELISA试剂盒的关键因素是抗原和其对应的高特异性、高亲和力的抗体。但是如前所述，GT是分子量小于IOkD的多肽。通常情况下，分子量在5kD以下的肽类一般无免疫原性；分子量在5-10kD之间的肽类的免疫原性较弱。因此，本专利旨在将GT偶联到大分子的载体蛋白上，赋予GT较强的免疫原性，从而刺激机体产生大量针对GT的高特异性和高亲和力的抗体，为试剂盒的制备提供高质量的原材料。因此，有必要选用一种快速、简便能够定量且灵敏度、准确度和特异性高的方法来进行胃泌素的测定。
实用新型内容本实用新型目的是提供人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，其操作简便，成本低，稳定性好，可以满足普通实验室的要求。为了实现本实用新型的目的，拟采用如下技术方案本实用新型一方面涉及人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的包被层含有人胃泌素抗体，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的多个微孔是指96个微孔。在本实用新型的一个优选实施方式中，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。本实用新型的试剂盒一次可处理大量样品，节约了大量的人力、物力，提高了工作效率。
图I为本实用新型一具体实施例酶标板结构示意图。I固相载体，2包被层,3封闭层。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本实用新型作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本实用新型并能予以实施，但所举实施例不作为对本实用新型的限定。本试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中GT的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的GT，形成待测标本中的GT和生物素化的GT竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的制备方法，其具体步骤为a、GT全抗原的制备将60mg GT与50mg牛血清白蛋白溶于4mL O. lmol/L磷酸钠缓冲液(PB, pH 7. 4)中，加O. 2mL 25%的偶联剂戊二醛(GA)连接成GT-GA-BSA复合物，室温反应20h后，用
O.Olmo 1/L磷酸钠缓冲液(pH 7. 0-7. 4)透析。b、抗人GT抗体的制备[0021]健康雄性新西兰大白兔I只，用GT-GA-BSA复合物免疫。将上述透析后的偶联产物进行紫外扫描、蛋白质谱、BCA(或其它方法如Bradford)进行偶联比例的分析及蛋白的定量。蛋白定量后分装冻干_80°C保存。取上述冻干偶联产物若干，用高压除菌的蒸馏水或去离子水重悬GT-GA-BSA至终浓度为200 μ g/mL。取600 μ I重悬好的GT-GA-BSA然后加入等体积的弗氏完全佐剂充分乳化混匀。兔后足垫、背部皮下多点免疫。14d后，进行加强免疫，剂量与基础免疫剂量相同。每两周免疫一次，共免疫四次，第四次免疫后14天，从颈动脉取全血，测定抗体效价。C、人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的研制人胃 泌素酶联免疫吸附测定试剂盒应用竞争抑制酶联免疫分析法测定血清或血浆样本中GT的水平。制备过程如下使用96孔聚苯乙烯试剂板(PS)作为固相载体，先将其置于紫外光下辐照2小时，使PS板活化。在试剂板微孔条上预先包被一定浓度的抗体，4°C过夜，经洗板及牛血清白蛋白封闭处理后制成包被好的酶标板。检测时，依次加入待测标本及生物素化的GT，形成待测标本中的GT和生物素化的GT竞争结合酶标板上包被的抗体的局面，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信号，以3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)及硫酸分别作为底物及终止液，完成人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒的制备。2、经过对试剂盒一系列的质量指标检测，包括灵敏度、重复性、特异性、回收率及线性测定，表明该检测体系成熟，本试剂盒各项指标检测结果a.标准曲线
浓度 Log
、标准品OD值OD值平均值
(pg/ml) (浓度)
18. 52I. 27I. 9182.038I. 978
55.56I. 74I. 372I. 3911.3815
166.672.22O. 912O. 881O. 8965
5002. 70O. 533O. 511O. 522
I, 5003. 18O. 2550.2660.2605表I人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒标准曲线b.灵敏度ELI SA法检测人血清标本时最低检测限为6. 14pg/ml ；c.回收率用同一血清样本分别添加不同量的定值标准品，作回收试验(η = 5)。平均回收率98. 73% (表2)。
定值标准品(pg/ml) 回收率(％ )
~1200106. 78500^~102. 52
10097.86
平均回收率98. 73表2人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒回收率测试3、实用新型专利技术路线I中所述的人胃泌素酶联免疫试剂盒的研制方法，其特征在于本实用新型的原料的制备和试剂盒的制备方法，比常规的检测方法灵敏度更高、特异性好。技术效果我们对比了 ELISA法(本公司生产的人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒)和RI A 法定量检测，可见ELI SA试剂盒有操作简单、快捷、试验成本低的特点。
ELISA 法RIA 法
保质期 6个月6周
检测限 15. 6-1000 pg/ml10-1280 pg/ml
灵敏度4. 83 pg/ml45. 7pg/ml
操作时间 2. 5小时2-3天
防护措施放射人员防护服，防护眼镜，手
普通实验服，手套
套
实验室条件普通实验室放射性同位素实验室
实验废物毒性�。扌杼厥獯矶曰肪秤肮螅杼厥獯肀�3EL I SA法和RI A法比较实施例I.精密度实验用两法对高、中、低值质控品分别进行精密度实验，实验方法为分别用这两个试剂盒测定三个定值样本967. 3pg/ml、405. 6pg/ml、57. 8pg/ml，每个样本重复测定20次，表4中结果可见ELISA方法精密度较好。
权利要求1.人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，包括酶标板，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。
2.根据权利要求I所述的人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的包被层含有人胃泌素抗体，所述的封闭层包含有牛血清白蛋白。
3.根据权利要求I或2所述的人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的多个微孔是指96个微孔。
4.根据权利要求I或2所述的人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，所述的固相载体是聚苯乙烯试剂板。
专利摘要本实用新型公开了人胃泌素酶联免疫吸附测定试剂盒，所述酶标板包括固相载体和包被层，其特征在于所述固相载体上设置有多个微孔，所述包被层附着在所述固相载体的微孔表面，所述封闭层位于包被层上。本实用新型的试剂盒一次可处理大量样品，节约了大量的人力、物力，提高了工作效率。
文档编号G01N33/543GK202583193SQ20122022443
公开日2012年12月5日 申请日期2012年5月13日 优先权日2012年5月13日
发明者杨娟, 李华渊, 李庆, 童晓玲, 从旭霞, 何峰容 申请人:武汉优尔生科技股份有限公司
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