专利名称：细胞分选器和细胞分选方法
技术领域：
本发明涉及一种用于分选细胞的细胞分选器和细胞分选方法。
背景技术：
现有技术中提出一种测量细胞的固有复介电常数并使用测量结果信息来分选细胞的介电细胞计数装置(例如参照专利文献1、日本专利2010-181399号公报，图3 图5)。专利文献1公开一种流路装置，用于使包括细胞的流体在其中流通，以便例如在细胞分选之前分析细胞，获得复介电常数。在形成于该流路装置中的流路的一部分上形成狭窄部。该狭窄部具有流路截面区域，该区域小到仅单一细胞能够通过的程度。测量通过该狭窄部的各细胞的复介电常数的分布(介电谱)，从而能够在该狭窄部的下游通过分选单元和用于控制该分选单元的分体控制部来分选细胞。但是，专利文献1中说明的介电细胞计数装置，关于其分选单元、分体控制部及其他部分的特定结构或该装置使用的特定分选方法未明确阐释。目前有待明确其特定结构等，以能够可靠地确保细胞分选。其可能方法之一例如保持流过流路装置的流路的包括细胞的流体恒定，假定细胞以与流体相同的速度流动，在细胞通过复介电常数测量区域后的给定时间中，使分选单元工作。即，根据流路的设计来设定给定延迟时间。但是，这种情况下，流路设计每次改变，都需要设定延迟时间。另外，实际上，由细胞的结构、形状、尺寸和其他因素，细胞流速可能会不同。因此，在给定延迟时间中进行细胞分选的情况下，细胞可能不会被可靠地分选。
发明内容
本发明是鉴于上述问题而研发的，其目的在于提供一种不需要针对每次流路设计来设定延迟时间，能够可靠地分选细胞的细胞分选器和细胞分选方法。根据本发明的实施方式，提供一种细胞分选器，包括测量电极、工作电极、检测电极和输出部。所述测量电极设置在具有用于分选细胞的分支路并且供包括细胞的流体流动通过的流路中所述分支路的上游。该测量电极在所述流路中形成测量电�。饬苛鞫ü隽髀返母魉鱿赴母唇榈绯Ｊ�。所述工作电极设置在所述测量电极的下游、所述分支路的上游。该工作电极在所述流路中形成工作电场，通过对所述细胞施加介电泳力并利用所述流路来分选所述细胞。所述检测电极设置在所述测量电极的下游、所述分支路的上游并与所述工作电极接近设置，检测流动通过所述流路的流体中的所述细胞的存在。输出部获取基于关于所述测量到的复介电常数的信息的分选信号和表明通过所述检测电极进行的所述细胞的所述检测的检测信号。在获取到所述分选信号的情况下，在获取所述检测信号时，该输出部对所述工作电极输出用于形成所述工作电场的工作信号。
在本发明的实施方式中，用于检测细胞的存在的检测电极与测量电极分开设置。当从检测电极获取到检测信号时，对工作电极提供工作信号。由此，不需要针对每次流路设计而设定延迟时间。另外，与在细胞通过复介电常数测量区域后的给定延迟时间中分选细胞的情况相比，能够更可靠地分选细胞。所述工作电极可以沿流体流动通过所述流路的方向配置成多段。这种情况下，输出部对各工作电极输出工作信号。这样能够在流体流动的方向上精细控制细胞的移动，从而缩小含于流体中的细胞间的节距(流体流动的方向上的节距)并提高工作效率。至少两个所述检测电极可以沿流体流动通过所述流路的方向以间隔着所述工作电极的方式设置。这样使后段的检测电极检测通过工作电极的细胞，由此，能够在合适的时间控制下终止利用工作电极形成的电场。所述检测电极和所述工作电极可以结合为整体电极。由于检测电极和工作电极物理上不分离，当获取到检测信号时输出部输出用于形成工作电场的工作信号的情况下能够可靠地分选细胞。本发明另一实施方式提供一种细胞分选方法，包括在具有用于分选细胞的分支路并且供包括细胞的流体流动通过的流路中所述分支路的上游形成测量电�。饬苛鞫ü隽髀返母飨赴母唇榈绯Ｊ辉谒隽髀分行纬伤霾饬康绯〉奈恢玫南掠�、所述分支路的上游形成工作电�。ü运鱿赴┘咏榈缬玖Σ⒗盟龇种防捶盅∷鱿赴患觳饬鞫ü隽髀分兴龇种返纳嫌�、与形成所述工作电极的位置接近的位置的流体的所述细胞的存在；以及、在获取到基于关于所述测量到的复介电常数的信息的确认信号的情况下获取表明所述细胞的存在的所述检测的检测信号时，产生用于形成所述工作电场的工作信号。在本发明的实施方式中，在与形成工作电场的位置接近的位置检测流过流路的流体中的细胞的存在，并且获得在检测产生的检测信号时产生分选信号。由此，不需要针对每次流路设计而设定延迟时间。另外，与在细胞通过复介电常数测量区域(形成测量电场的位置)后的给定延迟时间中分选细胞的情况相比，能够更可靠地分选细胞。因此，根据本发明，不需要针对每次流路的设计来设定延迟时间，并能够可靠地分选细胞。
图1是表示本发明的一实施方式的细胞分析/分选系统的概念图。图2是表示构成图1所示的细胞分析/分选系统的一部分的微型流路装置的立体图。图3是表示图2所示的分选部的结构的平面图。图4是图3中A-A线的截面图。图5表示对电场施加部施加电场后，细胞流动方向改变的方式的图示。图6是表示分选部的电路结构的图示。图7是表示其他实施方式的分选部的结构的平面图。图8是表示实现图7所示结构的分选部的动作的分选电路(第二实施方式的分选电路)的图示。图9是表示另一实施方式(第三实施方式)的分选电路的图示。图10是表示再一实施方式(第四实施方式)的分选电路的图示。
具体实施例方式以下，参照
本发明的优选实施方式。〔细胞分析/分选系统的结构〕图1是表示本发明的一实施方式的细胞分析/分选系统的概念图。图2是表示构成图1所示的细胞分析/分选系统1的一部分的微型流路装置的立体图。如图1所示，从上游沿形成在微型流路装置MF中的流路2顺次配置注入部3、测量部4、分选部5、细胞抽取部6和7、流出部10。例如使用未图示的泵将包括细胞的采样液体(流体)注入到注入部3中。从注入部3注入的液体流通流路2。测量部4以发生细胞的介电弛豫现象的频率范围(例如IMHz 50MHz)中多个频率(三个以上、典型地大约10 20)测量流通流路2的各细胞的复介电常数。与测量部4电连接的未图示的细胞功能分析器根据测量到的各细胞的复介电常数确定是否应该从微型流路装置MF抽取细胞以利用(例如检查和再利用)。当被测量的细胞应该被抽出以利用的情况下，细胞功能分析器输出分选信号(确定信号)。例如，未图示的细胞功能分析器确定测量到的各细胞的复电阻或复介电常数是否处于预先测量并存储在存储器中的标准信息的范围内。当复电阻或复介电常数处于该标准信息的范围内时，细胞功能分析器输出分选信号。分选部5将从注入部3注入的多种细胞中所需要的细胞分选进细胞抽取部6中，将其他细胞分选进细胞抽取部7中。设于分选部5的电场施加部8能够施加在与流体流动的方向X不同的方向、例如与X方向垂直的方向Y方向上具有梯度的电场。例如，当未输入使用分选信号作为确定信号而产生的工作信号(电压信号)时，电场施加部8不施加工作电场。当输入工作信号时，电场施加部8施加工作电场，当然，相反亦可。分支部9分支为分支路加和2b，从而未由电场施加部8施加电场的细胞流过分支路2b而达到细胞抽取部7，由电场施加部8施加电场的细胞流过分支路加而达到细胞抽取部6。细胞抽取部6和7经由流路2与流出部10相连，使用例如未图示的泵，通过细胞抽取部6和7的液体从流出部10向外部流出。在此，若对存在于液体中的细胞施加电�。蛴捎诮橹视胂赴募什煌蚨杏ε技�。若所施加电场不均勻，则在细胞周围不同位置电场强度不同，因而因感应偶极而产生介电泳力。〔微型流路装置〕如图2所示，微型流路装置MF包括基板12和例如由高分子膜构成的片状的部件13。基板12具有流路2、构成该流路2的一部分的分支路加和2b、作为注入部3的液体注入部3a、构成流路2的一部分的分支部9、细胞抽取部6、7以及流出部10。这些构件通过在
5基板12的表面例如形成槽并在其上覆盖片状的部件13而构成，其形成流路2。注入包括细胞的液体的细胞注入部北具有狭窄路，该狭窄路是片状的部件13上的极小孔。当由滴管滴在细胞注入部北上时，包括细胞的液体被卷入经由狭窄路流过流路2的液体，导致包括细胞的液体在流路2中流向下游。由于狭窄路为极小孔，所以细胞是一个接着一个地流入流路2，而不是一次多个地流入流路2。在狭窄路对向两侧设置一对测量电极如和4b。在测量电极如和4b之间施加给定的AC(交流)电压，以在狭窄路内形成测量电场。一测量电极如设置在片状的部件13的前面，另一测量电极4b设置在片状的膜13的背面。构成电场施加部8的一电极对(后述)也设置在片状的膜13的背面。细胞抽取部6和7上部由片状的膜13覆盖。细胞由此经由扎入片状的膜13的滴管抽取。电极垫14将由一对测量电极如和4b检测的信号向外部取出。被取出的信号例如被送给细胞功能分析器(未图示)。作为触发信号，电极对垫15提供使用确定信号产生的、从细胞功能分析器输出的工作信号。另外，经由电极垫15输出从后述的检测电极提供的检测信号。贯通孔沈在将微型流路装置MF与具有分析器和其他装置的细胞分选器连接时用于定位。〔分选部〕图3是表示图2所示的分选部5的结构的平面图。图4是图3中A-A线截面图。如图3和图4所示，分选部5包括用于检测流体内的细胞C的存在的两组检测电极对19 (19a和19b)以及20 (20a和20b)、构成电场施加部8的电极16和17、以及分支部9。例如，在与流体流通流路2的方向(X方向)不同的方向，例如Y方向上，电极16和17以隔着流路2的方式相对配置。电极16和17设置在片状的膜13的背面(流路2的上面)。电极16例如是被施加信号的电极，多个电极指16a朝向电极17突出。电极17例如是共用电极，与电极16不同，不具有凹凸。以下，将一个电极指16a与电极17的组合称作工作电极对18。检测电极对19和20的各电极与工作电极对18接近设置。另外，检测电极对19和20以间隔着工作电极对18的方式设置。所谓“检测电极对19(或20)与工作电极对18接近设置”可以是指在能够保证它们之间的电绝缘的情况下，该电极对可以极限接近。另一方面，检测电极19a和19b，与工作电极对18—样地，在Y方向上以隔着流路2的方式相对配置。检测电极20a和20b也同样。如以上所述构成的分选部5，能够使用检测电极对19检测细胞C的存在，并使用工作电极对18施加各个在Y方向上具有梯度的电场。用于形成该各电场的工作信号使用例如通过在AC电压上迭合DC (直流)偏压而产生的信号。在流路2中的电场施加部8的下游给定位置、通过由电场施加部8施加电场而产生的介电泳力改变流动方向的细胞C使用分支路加被导向细胞抽取部6。例如，细胞被注入到注入部3中偏向细胞抽取部7 —侧的位置。当在注入到偏向细胞抽取部7 —侧的位置上的细胞中，非将被分选的细胞通过电场施加部8时，电场施加部8不施加电场(不工作)。因此，如图3所示，细胞在该偏向侧流过流路2，原样地通过分支路2b并流入细胞抽取部7。但是，当将被分选的细胞通过电场施加部8时，该电场施加部8施加电场(工作)，对细胞施加介电泳力。如图5所示，由此使细胞的流动方向改向细胞抽取部6，导致将被分选的细胞在分支部9改变其方向，通过分支路加并流入细胞抽取部6。如以上所述构成的电场施加部8中，由工作电极对18施加电场，各该电场在Y方向上具有梯度。如此，通过电场施加部8的细胞逐渐改变路线，使细胞能够通过分支路加并流入细胞抽取部6。〔分选部的电路(分选电路)〕接着，关于分选部的电路结构进行说明。图6主要表示该分选部的电路图。图6中概要图示出流路2、检测电极对19和20以及工作电极对18。检测电极对19和20分别连接检测电路21和22。检测电路21通过对检测电极对19施加AC电压，从而在检测电极19a和19b之间、在流路2中Y方向上形成检测用的AC电场。检测电路21监测例如由于在检测电极19a和19b之间细胞的流动而变化(增加)的复电阻。若例如该复电阻超过其阈值，则检测电路21检测出此处存在细胞。检测电路22具有与检测电路21相同的功能。在检测电路21和22上分别连接例如门电路23和24。从检测电路21和22分别向该门电路23和M输入检测信号。另一方面，来自该细胞功能分析器的确定信号(分选信号)被用作如上所述提供给门电路23和M的门信号。来自门电路23的输出信号被提供给触发器25的设置终端(S)。来自门电路M的输出信号被提供给到触发器25的重置终端(R)。触发器25当信号提供给其设置终端时，将开关27变为ON(接通)，当信号提供给重置终端时，将开关27变为OFF (断开)。工作信号发生器观产生施加给工作电极对18的工作信号。该工作信号的施加的0N/0FF能够由开关27切换。在本实施方式中，“输出部”能够主要由检测电路21、工作信号发生器观、门电路23、触发器25、开关27和其他构件实现。说明如以上所述构成的分选电路的动作。当细胞C通过在该分选电路的前段设置的检测电极19a和19b之间时，检测电路21检测细胞C的存在。这时，若对门电路23和M提供确定信号，则在检测到细胞C的存在时设置触发器25，因此将开关27变为ON并对工作电极施加电压。如图3所示，由此改变细胞C的路径。当细胞C通过后段的检测电极20a和20b之间时，检测电路22检测细胞的通过。如此，检测信号提供给门电路对，重置触发器25并将开关27变为OFF。由此，终止利用工作电极对18形成的工作电场。对从细胞抽取部7抽取的各细胞C均执行这样动作。将被从细胞抽取部7抽取的细胞C被导入分支路加。如上所示，在本实施方式中，检测细胞C的存在的检测电极对19与一对测量电极4a和4b分离设置并与工作电极对18接近设置，因此能够在从检测电极对19取得检测信号时，对工作电极对18提供工作信号。由此，不需要针对每次流路设计而设定延迟时间。另外，根据本实施方式，与在细胞通过复介电常数测量区域后的给定延迟时间中分选细胞的情况相比，能够更可靠地分选细胞。〔分选部的其他实施方式〕与以mm/s左右速度在水中流动的细胞受到的粘性阻力相比，在细胞不受致命损伤的电场中细胞受到的介电泳力一般非常小。因此，需要多个用于在与流向垂直的方向确定地形成介电泳力的不均勻电场、或用于形成该不均勻电场的多个工作电极对18的列(在X方向配置的列)。如图3和图5所示，若对该多个工作电极对18同时施加电压，则需要排他地使用该电极列分选区域，会引起低工作能力。因此，如图7所示，将图3所示的工作电极对18沿X方向分为组Gl G5。S卩、具有两个电极指的电极161和与其相对的电极171，例如用作一个工作电极对。通过沿流动的方向配置多段工作电极，形成电场施加部。通过对该工作电极对Gl G5独立控制施加电压，能够允许多个细胞通过电场施加部8，以提高工作效率。即，在图3和图5所示的结构的电场施加部8中，需要使细胞在合适的时间控制下进入流路2，从而该细胞不会在其前一个细胞通过电场施加部8之前进入该电场施加部8。相反，在图7所示的结构的电场施加部8中，能够对通过工作电极对G5的细胞施加电�。酝üぷ鞯缂訥4的细胞不施加电场。如此，各工作电极对Gl G5都能够控制细胞的分选。检测电极对Fl F6为该工作电极对Gl G5配置并与其接近配置。另外，各检测电极对Fl F6以间隔在工作电极对Gl G5的两个之间的方式配置。〔第二实施方式的分选电路〕图8是表示实现图7所示的结构的分选部的动作的分选电路(第二实施方式的分选电路)的图示。该分选电路具有如图6所示多段连接并且动作与图6所示基本相同的多个分选电路。例如，假定受关注的细胞C现在是将由细胞抽取部6抽取的细胞，并且确定信号被送到门电路232。当该细胞C通过工作电极对Gl后，由与检测电极对F2连接的检测电路212检测到时，重置触发器251，从而终止工作电极对Gl施加的工作电场并设置触发器252。由此，产生将由工作电极对G2施加的工作电场。根据本实施方式，如上所述，能够在流体流动的方向上精细控制细胞的移动，从而缩小含于流体中的细胞间的节距(流体流动的方向上的节距)，并能够提高工作效率。〔第三实施方式的分选电路〕图9是表示另一实施方式(第三实施方式)的分选电路的图示。本实施方式中的分选电路具有以上说明的检测电极对与工作电极对结合而成的整体电极对35 (3 和35b)。该电极对35的典型形状可以与图3所示的工作电极对18相同。该电极对35连接检测信号发生器观1。另外，经由开关33，工作信号发生器282与电极对35连接。检测信号发生器观1产生具有频率Π的检测信号，工作信号发生器观2产生具有频率f2的工作信号。由信号发生器281和282产生的各信号迭加并施加给电极对35。检测信号和工作信号的频率设定得彼此充分分离而不干涉。例如，若检测信号的频率Π设定为IOOkHz，而其电压设定为IV，则工作信号的频率f2设定为IOMHz，而其电压设定为20V。
在本实施方式中，“输出部”主要由检测电路31、工作信号发生器28、门电路23、开关33和其他构件实现。当分选电路检测到细胞C的存在时，将开关33变为OFF，并由来自检测信号发生器281的检测信号在电极3 和3 之间形成检测电场。若该检测状态下确定信号被提供给门电路23，并且若细胞C来到该电极3 和3 之间，则根据与上述相同的原理(复电阻的变化)，检测电路31检测细胞C。由此将开关33变为0N，从而来自工作信号发生器观2的工作信号提供给电极对35，形成同时施加检测电场和工作电场的电场。如此，对细胞C施加工作电�。佣谋湎赴鸆的路径。当细胞C流过电极3 和3 之间的位置时，检测电路31检测到细胞C的通过，经由门电路23将开关3变为OFF，终止工作电场的形成。 如上所述，在本实施方式中，检测电极对与工作电极对形成整体。即，检测电极对和工作电极对物理上不分离。因此，当检测电路31检测到细胞C的存在时，输出用于形成工作电场的工作信号，因而能够可靠地分选细胞。〔第四实施方式的分选电路〕图10是表示再一实施方式(第四实施方式)的分选电路的图示。该第四实施方式的分选电路，与图9所示的分选电路不同的主要方面是，信号发生器1 兼做检测信号发生器和工作信号发生器，以及设置电阻衰减器34以取代开关33。在分选电路检测到细胞C的存在时，由信号发生器1 产生的AC电压信号的输出电压例如用作第一输出电压。因此，这种情况下，在电极3 和3 之间形成与该第一输出电压对应的AC电场。若确定信号被提供给门电路23的同时，检测电路31检测到细胞C的存在，则来自检测电路31的信号输出经由门电路23使电阻衰减器34动作。电阻衰减器34控制电流，使得具有比第一输出电压大的第二输出电压的信号例如作为工作信号被施加给电极对35。根据本实施方式，提供一种具有单一信号发生器的分选电路。〔其他实施方式〕本发明的实施方式不限于以上说明的优选实施方式，可以以其他各种实施方式来实现。例如，图3所示的工作电极的电极16和检测电极对19的形状可以不是图示的形状，而是其他形状。例如，各电极指16a在Y方向上的长度可以不同。例如，图9或图10所示的实施方式的分选电路，在与图8所示的实施方式的分选电路相同的构思下可以设置多段。本领域技术人员能够在本发明权利要求所记载的技术范围的基础上根据设计需要和其他因素进行各种修改、结合、再结合和变换。本发明在此引用但不限定于申请日为2010年10月四日、申请号为JP2010-243650的日本优先权专利申请。
权利要求
1.一种细胞分选器，包括测量电极，设置在具有用于分选细胞的分支路且供包括细胞的流体流动通过的流路中，位于所述分支路的上游，该测量电极能够在流路中形成测量电场，测量流动通过流路的各细胞的复介电常数；工作电极，设置在所述测量电极的下游、所述分支路的上游，该工作电极能够在流路中形成工作电�。ü韵赴┘咏榈缬玖σ约袄梅种防捶盅∠赴患觳獾缂柚迷谒霾饬康缂南掠�、所述分支路的上游，并与所述工作电极接近设置，以检测流动通过流路的流体中的细胞的存在；以及输出部，能够获取基于关于所述测量到的复介电常数的信息的分选信号以及表明所述检测电极检测到细胞的检测信号，该输出部能够在获取到所述分选信号的情况下，当获取到所述检测信号时，对所述工作电极输出用于形成所述工作电场的工作信号。
2.如权利要求1所述的细胞分选器，其中，所述工作电极在流路中沿流体流动通过流路的方向配置成多段，所述输出部对各所述工作电极输出工作信号。
3.如权利要求1或2所述的细胞分选器，其中，至少两个检测电极在流路中沿流体流动通过流路的方向以中间隔着所述工作电极的方式设置。
4.如权利要求1或2所述的细胞分选器，其中，所述检测电极和所述工作电极结合为整体电极。
5.一种细胞分选方法，包括在具有用于分选细胞的分支路并且供包括细胞的流体流动通过的流路中的所述分支路的上游形成测量电�。饬苛鞫ü髀返母飨赴母唇榈绯Ｊ辉诹髀分械男纬刹饬康绯〉奈恢玫南掠�、所述分支路的上游形成工作电�。员阃ü韵赴┘咏榈缬玖σ约袄盟龇种防捶盅∠赴患觳饬鞫ü髀分兴龇种返纳嫌�、与形成所述工作电极的位置接近的位置处的流体中的细胞的存在；以及在基于关于测量到的复介电常数的信息获取到确认信号的情况下，若获取了表明检测到细胞的存在的检测信号时，产生用于形成所述工作电场的工作信号。
全文摘要
本发明涉及一种细胞分选器以及细胞分选方法，该细胞分选器包括测量电极、工作电极、检测电极和输出部。该测量电极在流路中形成测量电�。饬苛鞴髀返母飨赴母唇榈绯Ｊ�。工作电极在流路中形成工作电�。ü韵赴┘咏榈缬玖Σ⒗酶昧髀防捶盅∠赴＜觳獾缂觳饬鞴髀返牧魈逯械南赴拇嬖�。输出部获取基于关于测量到的复介电常数的信息的分选信号以及表明由检测电极检测到细胞的检测信号。输出部在获取到分选信号的情况下，在获取检测信号时对工作电极输出用于形成工作电场的工作信号。
文档编号G01N15/10GK102564920SQ20111032259
公开日2012年7月11日 申请日期2011年10月21日 优先权日2010年10月29日
发明者佐藤一雅, 胜本洋一 申请人:索尼公司
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