专利名称：基于微波导的超分辨显微成像方法和装置的制作方法
技术领域：
本发明涉及微观观测测量领域，尤其涉及一种基于微波导的超分辨显微成像方法和装置。
背景技术：
纳米技术与生物技术是21世纪发展最迅速和热门的科学领域。纳米技术应用广泛，包括I IOOnm尺度内的成像、测量、加工、操纵等。许多重要的生物体比如葡萄糖、抗体、病毒等都处于这个尺度范围内，研究这些微小物体的需求推动了高分辨率显微成像技术的发展。反过来，超分辨显微术的发展也推动了整个生命科学的进步。相比其他的显微技术，光学显微技术的一大优势是可以对处于自然状态的活细胞进行研究。自世界上第一台光学显微镜问世以来，提高光学显微成像系统的分辨能力及测量 范围一直是众多科学家致力研究的重要科学问题，特别是近年来，随着物理学、生物医学、微电子学和材料学等学科的迅速发展，对这一问题的研究变得尤为迫切，主要体现在物理学的发展要求人们能观测到微观世界中原子的大�。环肿由镅У姆⒄挂笕嗣悄芄鄄獾交钐逑赴庵指呱⑸湮镏誓谛〉侥擅壮叨鹊牡シ肿樱晃⒌缱蛹际醯姆⒄挂笕嗣悄芗觳獾匠蠊婺＜傻缏分姓绞擅椎南呖沓叽纾荒擅仔虏牧系某鱿忠笕嗣悄芄鄄獾侥擅壮叨却笮〉哪擅卓帕５龋庑┫执蒲У男陆梗哟偈谷嗣遣欢系厝ヌ剿鞲叻直嫦晕⒊上竦男路椒ê托录际�。由于衍射极限的存在，传统的宽场光学显微镜横向和纵向的分辨率分别仅约为230nm和lOOOnm。二十世纪三十年代发展起来的电子显微成像技术及八十年代初崛起的各类非光学的探针扫描显微成像技术具有纳米甚至更高的分辨能力，但它们在不同程度上存在着系统结构复杂、成像检测环境要求苛刻及样品处理繁琐等困难，特别是不能获得样品重要的光学信息(如反射率、折射率、偏振态及光谱等信息)，因而无法完全取代光学显微成像的地位。随着现代激光技术、计算机技术、精密机械及电子技术的迅猛发展，超分辨的光学显微成像技术(Super-resolution Optical Microscopy, SR0M)应运而生。根据原理不同，现有技术可以分为两大类一类是以固体浸没透镜(Solid Immersion Lens, SIL)技术为代表的近场显微技术；另一类则是以激发抵制损耗显微镜(Stimulated EmissionDepletion, STED)为代表的荧光显微技术。然后，两种现有技术都存在着一定的缺陷前者虽然使用宽场照明，但很难将其分辨率压缩在IOOnm以下；后者则是基于荧光显微技术，无法使用于非荧光样品上，因此使用范围受到限制。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明以微波导为核心，提供了一种实现远场超分辨的方法，实现了基于近场照明、远场成像的超分辨显微图像获取。—种基于微波导的超分辨显微成像方法，包括以下步骤
I)将超连续谱激光耦合导入微波导，并将微波导放置在具有亚波长细节的样品表面,表面细节对所述微波导内传输的光产生调制作用，形成散射光；2)收集所述散射光信号，并成像得到相应的图像；3)对所述步骤2)中的图像进行频谱分析，得到频谱分布图；
4)将所述频谱分布图进行频移重构，并反演得到具有亚波长分辨能力的样品表面图像。为实现大面积样品观察，用所述微波导对样品表面进行扫描，通过步骤2)得到单帧图像序列，将单帧图像拼接后得到相应的图像，然后经步骤3)和步骤4)得到大画幅的具有亚波长分辨能力的样品表面图像。频谱分析，是指对图像强度分布进行傅里叶变换，得到其相应的傅里叶频谱。反演，是指对傅里叶谱频进行反傅里叶变换，得到相应的图像强度分布。本发明的工作原理是将微波导与商用光纤进行类比。由于微波导是单层介质可见光波导，因此仅具有商用光纤芯层的作用，一般将其周围的空气介质当作传统商用光纤的包层而构成一个阶跃式光纤结构。当激光被导入微波导后，一部分光能量不能完全被微波导所束缚，而是在微波导表空气的交界面上形成与原有光传播方向同向的倏逝场。由于倏逝场本身极易受到扰动而使光能量产生散射与耦合现象。因此，当将微波导放置于具有亚波长细节的样品表面时，在微波导中传输的光场会受到样品表面亚波长细节的调制而产生散射作用。具体来说，由于频谱面上较大的分量对应于图像的精细结构，因此，具有亚波长细节的样品表面图像的傅里叶频谱中，高频分量的比重很大。通常情况下，由于该部分高频分量在数值上远远大于一般显微镜的传输带宽，因此无法被映射到远场，造成样品细节无法分辨。然而，当其靠近倏逝场并受到其照射时，会产生“频移”现象，即高频分量会通过近场衍射作用被转变为低频分量，在数学上即表现为对应频谱值的减小。可以用如下公式来表不:k/ = kA-ke < kA其中'表示低频分量，kA为原有高频分量，ke为倏逝场光波数。当高频分量被转变为低频分量后，即可以被传输到远场而为感光元件所接收。因此，远场散射信号中即携带有原有的高频信息。此时，对由感光元件记录的图像进行傅里叶变换进行得到频谱图，再通过公式' +ke即可将原有频谱还原，进而通过傅里叶反变换得到相应的图像信息。本发明还提供了一种基于微波导的超分辨显微成像装置，包括用于产生超连续谱激光的超连续光源；用于放置样品的样品台；用于传输超连续谱激光的微波导；将所述超连续谱激光耦合进所述微波导的耦合器；用于收集散射光信号的显微镜；用于将所述显微镜收集的光信号进行成像的宽场感光元件；以及用于对所述宽场感光元件形成的图像进行频谱分析，并得到最终的样品表面图像的计算机。
所述超连续光源的谱宽应大于200nm。为了减小光源相干性对系统性能带来的影响，选用谱宽在200nm以上的超连续光源作为系统激光光源。所述微波导为截面直径在I 3 μ m的微光纤。微波导的截面直径在I 3 μ m之间，可以是微光纤、矩形微波导，也可以是微型全反射器以及表面等离子体器件等，优选为截面直径在I 3 μ m的微光纤。所述的显微镜，是指配置有数值孔径NA = O. 8 O. 95、放大率为100倍的非浸没式显微物镜镜头的光学显微镜，优选为NA = O. 95。由于散射光线自身发散角很大,为保证收集效率，应配置大数值孔径显微镜头。所述的宽场感光元件，可以有多种技术方案。如电荷耦合器件(CCD)、胶片等，优选为(XD，以方便进行数字图像处理。所述微波导为单个或阵列的多个。 为实现大面积样品观察，可以将单个微波导在样品表面进行横向扫描，得到单帧图像序列，将单帧图像拼接后，经计算机得到具有亚波长分辨能力的样品表面图像；也可以由多个并行微波导组成微波导阵列，同时导入超连续谱激光，然后根据本发明的方法得到具有亚波长分辨能力的样品表面图像。相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果(I)分辨率精细度高，可以获取横向75nm的超分辨图像；(2)结构简单，成本低廉；(3)采用宽场成像方式，图像获取速度远高于扫描成像方式，可以获取观察样品的即时动态图像；(4)可根据需要扩大视场范围，方便灵活；(5)可以与其他显微方式配合使用，功能扩展性强。
图I为实现本发明基于微波导的超分辨显微成像装置的结构原理图。图2为本发明中光在微波导中传输时的模式示意图。图3为本发明中频移原理图。图4为本发明中微波导阵列的结构原理图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。图I所示为本发明基于微波导的超分辨显微成像系统的结构原理图。如图I所示，一中基于微波导的超分辨显微成像装置，包括超连续光源1，耦合器
2,微波导3,样品台4,显微镜5,宽场感光兀件6,计算机7。其中，微波导3、样品台4、显微镜5和宽场感光兀件6均位于同轴光路上。为了减小光源相干性对系统性能带来的影响，选用谱宽在200nm以上的超连续光源I作为系统激光光源。由超连续光源I产生的超连续谱激光，将通过耦合器2被耦合到微波导3内。考虑到耦合损失，输入光功率应大于100mW。因此，超连续光源I优选为Fianium公司的FemtoPowerl060 系列产品。
在超连续谱激光被耦合进入微波导3后，将沿着其展开方向进行传输。所谓微波导3，是指是指截面直径在I 3 μ m之间的单层介质可见光波导，包括微光纤、矩形微波导，也可以是微型全反射器以及表面等离子体器件等，优选为微光纤。其中，可传输可见光波长范围为380 780nm。微波导3微波导的制备可以有多种技术方案，如加热拉伸预制棒、纳米生长、纳米光刻加工等，优选为加热拉伸预制棒。为保证系统性能稳定，微波导3内部折射率要求单一且均匀。如将微波导3与商用光纤进行类比，此时，微波导3仅具有商用光纤芯层的作用，一般将其周围的空气介质当作传统商用光纤的包层而构成一个阶跃式光纤结构。当超连续谱激光在微波导3内部传输时，虽然仍然将维持原有模式特性，但是，部分光能量不能完全被微波导所束缚，而是在微波导表空气的交界面上形成与原有光传播方向同向的倏逝�。缤�2所示。倏逝场本身极易受到扰动而使光能量产生散射与耦合现象。因此，当将微波导3放置于具有亚波长细节的样品表面待观察区域时，在微波导3中传输的光场会受到样品表面亚波长细节的调制而产生散射作用。所谓亚波长细节，是指自身大小和相隔间隔小于激光最短波长一半的细节表面形貌。
可以对样品表面细节进行傅里叶变换进行进一步分析。由于频谱面上较大的分量对应于图像的精细结构，因此，具有亚波长细节的样品表面图像的傅里叶频谱中，高频分量的比重很大。通常情况下，由于该部分高频分量在数值上远远大于一般显微镜的传输带宽，因此无法被映射到远�。斐裳废附谖薹ǚ直�。然而，当其靠近倏逝场并受到其照射时，会产生“频移”现象，即高频分量会通过近场衍射作用被转变为低频分量，在数学上即表现为对应频谱值的减小。可以用如下公式来表示k/ = kA-ke < kA其中1 Λ'表示低频分量，1 Λ为原有高频分量，为倏逝场光波数,如图3所示。当高频分量被转变为低频分量后，即变成了可传输量。因此，散射光线中将包含原有样品表面的细节信息。该部分散射光线在远场将被显微镜5收集。由于散射光线自身发散角很大，为保证收集效率，应配置大数值孔径显微镜头，如数值孔径NA = O. 8 O. 95、放大率为100倍的非浸没式显微物镜镜头的光学显微镜，其中优选为NA = O. 95。被收集的散射光线最终会在宽场感光兀件6表面成像。宽场感光兀件6可以有多种技术方案,如电荷耦合器件(CCD)、胶片等，优选为CCD，以方便进行数字图像处理。将由宽场感光元件6直接得到的图像导入计算机7进行进一步处理。主要处理过程如下，首先，对得到的图像进行傅里叶变换得到对应的频谱信息；其次，通过公式kA/ +ke还原原有频谱中的高频分量；最后，对还原后的频谱进行傅里叶反变换，即可以得到原有样品表面亚波长细节信息。通过上述方法和装置，即可以实现光学超分辨显微成像。为实现大面积样品观察，可以将整个装置进行进一步改进，将单个微波导在样品表面进行横向扫描，逐步通过宽场感光元件6进行成像，得到单帧图像序列。将单帧图像横向拼接后成具有更大画幅的图像后，再导入计算机7进行进一步处理。也可以由多个并行微波导组成微波导阵列8，如图4所示。将微波导阵列8中所有微波导3并行放置在样品上，通过耦合器2同时导入超连续谱激光，通过宽场感光元件6进行成像后，交由计算机7进行进一步处理。当使用上述方法和装置Fianium公司的FemtoPower 1060作为超连续光源I (选用波长范围500 800nm，中心波长650nm，初始输入光功率IOOmW)，选用微波导3直径2μ m，选用的显微镜5配有100X、NA = O. 8的非浸没式显微物镜镜头时，可以分辨的样品表面最小细节的大小可以< 75nm。·
权利要求
1.一种基于微波导的超分辨显微成像方法，其特征在于，包括以下步骤 1)将超连续谱激光耦合导入微波导，并将微波导放置在具有亚波长细节的样品表面，表面细节对所述微波导内传输的光产生调制作用，形成散射光； 2)收集所述散射光信号，并成像得到相应的图像； 3)对所述步骤2)中的图像进行频谱分析，得到频谱分布图； 4)将所述频谱分布图进行频移重构，并反演得到具有亚波长分辨能力的样品表面图像。
2.如权利要求I所述的基于微波导的超分辨显微成像方法，其特征在于，用所述微波导对样品表面进行扫描，通过步骤2)得到单帧图像序列，将单帧图像拼接后得到相应的图像。
3.一种基于微波导的超分辨显微成像装置，其特征在于，包括 用于产生超连续谱激光的超连续光源； 用于放置样品的样品台； 用于传输超连续谱激光的微波导； 将所述超连续谱激光耦合进所述微波导的耦合器； 用于收集散射光信号的显微镜； 用于将所述显微镜收集的光信号进行成像的宽场感光元件； 以及用于对所述宽场感光元件形成的图像进行频谱分析，并得到最终的样品表面图像的计算机。
4.如权利要求3所述的基于微波导的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述超连续光源的谱宽应大于200nm。
5.如权利要求4所述的基于微波导的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述微波导为截面直径在I 3 μ m的微光纤。
6.如权利要求5所述的基于微波导的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述显微镜为设有数值孔径NA = O. 8 O. 95、放大率为100倍的非浸没式显微物镜镜头的光学显微镜。
7.如权利要求6所述的基于微波导的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述NA=O.95。
8.如权利要求7所述的基于微波导的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述宽场感光元件为CXD。
9.如权利要求8所述的基于微波导的超分辨显微成像装置，其特征在于，所述微波导为单个或阵列的多个。
全文摘要
本发明公开了一种基于微波导的超分辨显微成像方法，包括以下步骤1)将超连续谱激光耦合导入微波导，并将微波导放置在具有亚波长细节的样品表面，表面细节对所述微波导内传输的光产生调制作用，形成散射光；2)收集所述散射光信号，并成像得到相应的图像；3)对所述步骤2)中的图像进行频谱分析，得到频谱分布图；4)将所述频谱分布图进行频移重构，并反演得到具有亚波长分辨能力的样品表面图像。本发明还公开了一种基于微波导的超分辨显微成像装置。本发明分辨率精细度高，功能扩展性强，可以有效应用于样品表面亚波长细节的超分辨显微成像。
文档编号G01N21/47GK102928384SQ20121041140
公开日2013年2月13日 申请日期2012年10月24日 优先权日2012年10月24日
发明者刘旭, 郝翔, 库玉龙, 匡翠方 申请人:浙江大学
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