专利名称：一种免疫荧光组织化学技术的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫分析和生物技术应用领域，具体为一种免疫荧光组织化学技术。
背景技术：
免疫荧光组织化学技术是现代生物学和医学中广泛应用的技术之一，是由Coons和他的同事(1941)建立。免疫荧光技术与形态学技术相结合发展成为免疫荧光组织(或细胞)化学技术。它与葡萄球菌A蛋白(SPA)、生物素与卵白素、植物血凝素(ConA等)相结合拓宽了领域；与激光技术、电子计算机、扫描电视和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫突光组织化学技术；突光激活细胞分类器Fluorescin activated cell sorter (FACS)的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使免疫荧光细胞技术发展到更高阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。细胞显微分光光度计与图像分析仪的结合使免疫荧光组织化学的定量检测更加准确。80年代到90年代相继又有新的荧光素的出现，均在流式细胞仪和激光共聚焦显微镜中得到广泛应用。免疫荧光组织化学是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗体(或抗原)标记上荧光素，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检测细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，荧光素受激发光的照射，由低能态进入高能态，而高能态的电子是不稳定的，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的低能态，这时发出明亮的荧光，利用荧光显微镜可以观察荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术测定含量。例如标本来源于心梗大鼠的心肌组织，检测A，B, C，D蛋白在心肌组织的表达情
况及相互联系。1、研究发现A，B, C，D蛋白在心肌梗死区、危险区和正常区域有不同表达，那么在心肌组织不同层面就会有不同的结果，若需同时观察这四种蛋白的表达情况则应在同一标本层面中实现。2、目前普通免疫荧光常采用三种颜色的荧光标记除了检测细胞核用DAPI蓝色荧光标记外，还可以用另外两种不同荧光分别标记两种蛋白。如检测A蛋白-兔抗大鼠(A蛋白对应一抗)_山羊抗兔-FITC(二抗)黄绿色荧光标记，吸收波长490-495nm，B蛋白-小鼠抗大鼠(B蛋白对应一抗)_山羊抗小鼠-TRITC (二抗)橙红色荧光标记，吸收波长为550nm，借助普通荧光显微镜即可观察到这三种颜色的荧光。3、若需要同时观察A，B, C蛋白在心肌组织中的表达情况，则需C蛋白所结合的一抗种属来源于非兔、小鼠之外的抗体。然而目前抗体的种属来源较为单一，若C蛋白-兔抗大鼠(C蛋白对应一抗)_山羊抗兔-FITC (二抗)黄绿色荧光，将会无法区分A，C蛋白，且二抗会发生免疫交叉反应。同理，C蛋白的一抗若为小鼠来源，则与B蛋白无法区别。如果C蛋白-驴抗大鼠(C蛋白对应一抗)，则相应的二抗又需要采用不同荧光素标记的抗驴的抗体，且激发该荧光需要不同的吸收波长，这是普通荧光显微镜所不能实现的，需采用激光共聚焦显微镜或更高级设备。若需要同时分析四种蛋白，则抗体的种属来源会受到更多限制，且更容易发生免疫交叉反应。4、激光共聚焦显微镜虽然具有多通道的激发波长，具有可以同时检测几种不同荧光标记的蛋白的优点，但介于目前抗体的种属来源较少，仍然存在容易发生免疫交叉反应的问题，难以实现多种抗原的同步共定位。另外激光共聚焦显微镜使用费用相对较高，研究者常受到研究经费的限制，以及激光共聚焦显微镜还未得到普及等不足，因此不能被广泛应用。综上所述，目前的免疫荧光组织化学技术常使用三种不同颜色的荧光标记，即细胞核DAPI蓝色突光标记和两种抗原(或抗体)的另外两种不同突光标记,通过突光观察两种抗原(或抗体)在组织或细胞中的定位。若需同时观察第三种或更多种抗原(或抗体)在组织细胞中的定位，则只能通过选取另一层面标本观察。然而，目前该技术还存在一定的局限性1、由于组织不同层面所反映的结果不尽相同，那么在不同层面标本上的结果则不能准确揭示各蛋白(抗原或抗体)之间的关系和特点；2、介于抗体的种属来源较少，实现多种抗原的同步共定位则尤为困难，且容易存在免疫交叉反应；3、不同荧光的激发需要不同的激发波长，若同时观察三种以上的荧光，则采用一般的普通荧光显微镜较难实现；4、激光共聚焦显微镜的使用费用较高，且所需抗体种属来源的限制以及激光共聚焦显微镜的使用由于受到各种因素的影响还难以广泛普及。
发明内容
本发明为了解决现有免疫荧光组织化学技术在使用过程中存在上述诸多缺陷的问题，提供一种新的免疫荧光组织化学技术，利用普通荧光显微镜和有限的抗体来源实现多于三种抗原(或抗体)在同一标本中的共定位。从而对相应抗原(或抗体)进行组织或细胞的准确定性、定位、定量。本发明是采用如下技术方案实现的一种免疫荧光组织化学技术，包括以下步骤
(I)初染
①、制备待测细胞或组织切片、用H2O2/甲醇处理，降低内源性过氧化物酶所造成的非特异性背景、暴露抗原结合位点、封闭、孵育待测细胞或组织切片中所含待测蛋白A的相应一抗和所含待测蛋白B的相应一抗(如果只检测一种蛋白A，则只需孵育A蛋白相应抗体；如需同时检测A、B两种蛋白，则同时孵育A、B蛋白所对应抗体)、孵育待测蛋白A的荧光素标记的二抗和待测蛋白B的荧光素标记的二抗；⑦、DAPI初染、普通荧光显微镜镜检、拍照，分析蛋白A和蛋白B在待测细胞或组织切片的表达情况。(2)复染
①、利用磷酸盐缓冲液清洗初染后的待测细胞或组织切片，镜检观察至荧光消失；②、重新封闭、孵育待测细胞或组织切片中所含待测蛋白C的相应一抗，然后孵育荧光素标记的二抗；④、DAPI复染； 、普通荧光显微镜镜检、拍照，得到待测蛋白C的镜检照片，将其与初染得到的镜检照片进行叠加，进而在同一标本层面分析已测蛋白A、已测蛋白B和待测蛋白C的表达情况。可以重复上述复染的步骤，分别得到待测细胞或组织切片中相关待测蛋白的镜检照片，然后在同一标本层面分别分析所有已测蛋白与待测蛋白的表达情况，本方法可以实现同一标本重复利用。本发明的另一种优选方案，复染时，采用的磷酸盐缓冲液pH值为7. 4，每5分钟清洗一次，清洗3次，这是申请人经过长期的实践及经验总结所得到的，既可以把被染的细胞核、蛋白A和蛋白B等已测蛋白的荧光抗体洗掉，又能保证同一标本的可重复利用次数。本发明的另一种优选方案，复染时，重新封闭后，将已测蛋白A或已测蛋白B与待测蛋白C同时进行复染，普通荧光显微镜镜检，即可同时得到蛋白A或蛋白B与蛋白C的镜检照片，进而在同一标本层面直接分析蛋白A或蛋白B和待测蛋白C的表达情况。采用该方法，可避免单独对蛋白C进行镜检后，还得保证再和蛋白A或蛋白B同一视野下进行拍照所带来的操作繁琐。本发明所述的免疫荧光组织化学技术一方面可以将免疫荧光染色后的组织标本进行再利用，实现同一组织标本的多次观察利用，避免实验误差，节约成本，更具有代表性；另一方面有利于观察多种抗原(或抗体)在同一标本中的共定位，并且直观地揭示蛋白(抗原或抗体)之间的联系，使研究更具有说服力，与现有技术相比，具有以下优点1.该技术可实现多种抗原(或抗体)在同一组织或细胞同一层面标本的 共定位，准确反映实验结果，而且可以更充分的利用标本。2.本发明可实现多种抗原(或抗体)在同一组织的同一层面标本中的共定位，避免了同一蛋白在同一组织不同层面表达差异的问题，在此基础上得出的结论更准确，更具有说服力。3.本发明是在已有基础上的复染，仍为两种蛋白的免疫荧光染色，无需更多种属来源的一抗，同时还可避免多抗原(或抗体)的免疫交叉反应。4.该技术无需多种荧光素标记的二抗，可以更为有效地利用二抗。5、该技术对免疫荧光显微镜光源激发波长的要求较低，无需激光共聚焦显微镜的使用，仅需通过普通免疫荧光显微镜就可实现，可有效降低对荧光显微镜光源激发波长的要求，还可有效节约实验成本。总之，本发明所述技术操作可控性强、特异性强、准确度高、可以用较低的实验成本实现较高的研究要求，为临床免疫荧光组织化学研究提供更为广泛的应用范围。
图1为初染后蛋白A (Κ 67)的镜检照片；
图2为初染后蛋白A (Κ 67)与DAPI叠加后的镜检照片；
图3为初染后蛋白B ( a -SMA)、蛋白A (Κ 67)与DAPI叠加后的镜检照片；
图4为复染后蛋白C ( Η3Ρ)的镜检照片；
图5为复染后蛋白C ( Η3Ρ)和DAPI叠加后的镜检照片；
图6为复染后蛋白C ( H3P)、DAPI与已测蛋白A (Κ 67)的镜检照片叠加图；图7为初染后蛋白A (cyclinB)的镜检照片；
图8为初染后蛋白B ( α -SM)的镜检照片；
图9为初染后蛋白B ( a -SMA)、蛋白A (cyclinB)与DAPI叠加后的镜检照片图10为复染后蛋白C ( cyclinA)的镜检照片；
图11为复染后蛋白C ( cyclinA)和DAPI叠加后的镜检照片；图12为复染后蛋白C图13为初染后蛋白A图14为初染后蛋白B图15为初染后蛋白A图16为复染后蛋白A图17为复染后蛋白C图18为初染后蛋白A
(cyclinA)、DAPI与已测蛋白A (cyclinB)的镜检照片叠加图；(EDl)的镜检照片；
(P-JNK)的镜检照片；
(EDl)与蛋白B (p-JNK)叠加后的镜检照片；
(EDl)的镜检照片；
(p-c-JUN)的镜检照片；
(EDl)与蛋白C ( p-c-JUN)叠加后的镜检照片。
具体实施例方式通过以下具体实施例来进一步说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1 :心肌缺血后处理模型标本，采用本发明所述免疫荧光组织化学技术检测Ki67(蛋白A)、H3P(蛋白C)及a-SMA(蛋白B)的表达，包括以下步骤
(1)初染
①、制备心肌缺血后处理模型标本的组织切片
石蜡切片
脱蜡石蜡切片首先在二甲苯中脱蜡10分钟，重复3次。其次在梯度酒精中(无水乙醇2次、95%乙醇2次、80%乙醇、75%乙醇、50%乙醇)各5分钟，最后蒸馏水中置5分钟。②、用O. 39Γ3%Η202/甲醇处理室温湿盒孵育30分钟，降低内源性过氧化物酶所造成的非特异性背景。③、抗原修复，根据不同的抗原和抗体，选择把切片放置在如下抗原修复液中，IOmM枸橼酸钠，ρΗ6. O或ImM EDTA, ρΗ8. O或IOmM Tris中，利用高压、微波或水浴等进行
加热至抗原结合位点暴露，缓慢冷却至室温。④、封闭加入正常山羊血清封闭液，37°C湿盒孵育60分钟。(注意样品的保湿，避免样品干燥，否则易产生较高的背景。)
⑤、孵育组织切片中所含待测蛋白A的相应一抗和所含待测蛋白B的相应一抗，参考抗体说明书，按照适当比例用抗体稀释液稀释一抗，4°C冰箱孵育过夜。回收一抗，用PBS洗涤液洗涤5分钟，3次。⑥、孵育待测蛋白A的荧光素标记的二抗和待测蛋白B的荧光素标记的二抗；参考二抗说明书，按照适当比例用抗体稀释液稀释荧光标记的二抗，37°C孵育60分钟。回收二抗，用PBS洗涤液洗涤5分钟，3次。(整个操作过程均应避光。)
⑦、DAPI初染DAPI在室温下染色2分钟，然后用PBS洗涤液洗涤5分钟，3次。⑧、普通荧光显微镜镜检、拍照，除了蓝色的细胞核外，主要检测荧光标记的红色A蛋白和绿色B蛋白，结果如下图1中的红色荧光代表目的蛋白A，图2中的蓝色荧光代表DAPI (细胞核)，图3中的绿色荧光代表目的蛋白B。三者Merge后，结果显示B蛋白表达于胞浆，A蛋白定位于细胞核；
如果除了检测蓝色细胞核、红色A蛋白和绿色B蛋白外，还需要检测C蛋白，按照以下方法进行操作
(2)复染
①、利用磷酸盐缓冲液清洗进行初染后的待测细胞或组织切片，磷酸盐缓冲液PH值为7. 4，每5分钟清洗一次，清洗3次，通过PBS清洗，镜检观察至荧光消失；
②、重新封闭加入正常山羊血清封闭液，37°C湿盒孵育60分钟。(注意样品的保湿，避免样品干燥，否则易产生较高的背景。)
③、孵育待测细胞或组织切片中所含待测蛋白C的相应一抗，然后孵育荧光素标记的二抗，方法同初染的步骤⑤和⑥；
④、DAPI复染，方法同初染的步骤⑦；
⑤、普通荧光显微镜镜检、拍照，如图4所示，得到待测蛋白C的镜检照片，图中绿色荧光代表目的蛋白C，将其与初染得到的镜检照片进行叠加，如图6所示，与初染后蛋白A的镜检照片进行叠加，图中红色荧光代表目的蛋白A，绿色荧光代表目的蛋白C，进而在同一标本层面很直观的分析出已测蛋白A和待测蛋白C的表达情况，显示C蛋白表达于细胞核。结果分析心肌缺血后处理模型标本，采用上述免疫荧光组织化学技术检测Ki67(蛋白A)、H3P(蛋白C)及a-SMA(蛋白B)的表达，检测结果见图1_6，如图所示Ki67、DAP1、a-SMA为初次染色后结果，结果显示Ki67定位表达于细胞核，a-SMA定位表达于细胞浆；Η3Ρ为复染后结果，显示Η3Ρ与Ki67共同定位表达于细胞核，从而反映细胞的增殖。 实施例2
心肌缺血/再灌注标本，采用如实施例1所述的免疫荧光组织化学技术检测细胞周期cyclinB(蛋白A)、a-SMA(蛋白B)、cyclinA(蛋白C)的表达，如图7_12所示，其中图7-9为cyclinB、DAP1、a -SMA初次染色后结果，结果显示cyclinB定位表达于细胞核，a -SMA定位表达于细胞衆；图10为cyclinA复染后结果，将cyclinA与初染得到的cyclinB、DAPI的镜检照片进行叠加，如图11、12所示，cyclinA与cyclinB共同定位表达于细胞核,证明缺血/再灌注可以启动心肌细胞周期。实施例3 :采用本发明所述的免疫荧光组织化学技术检测激活的小神经胶质细胞EDl (蛋白A)、p-JNK (蛋白B)、p-c-JUN(蛋白C)的表达，步骤如下
(I)初染
①、制备小神经胶质细胞；
②、用O.39Γ3%Η202/甲醇处理室温湿盒孵育30分钟，降低内源性过氧化物酶所造成的非特异性背景。③、用O. 5%-1%的Triton处理，使得抗原结合位点暴露；
④、封闭加入正常牛血清白蛋白，37°C湿盒孵育60分钟。(注意样品的保湿，避免样品干燥，否则易产生较高的背景。)
⑤、孵育细胞中所含待测蛋白A的相应一抗和所含待测蛋白B的相应一抗，参考抗体说明书，按照适当比例用抗体稀释液稀释一抗，4°C冰箱孵育过夜。回收一抗，用PBS洗涤液洗涤5分钟，3次。⑥、孵育待测蛋白A的荧光素标记的二抗和待测蛋白B的荧光素标记的二抗；参考二抗说明书，按照适当比例用抗体稀释液稀释荧光标记的二抗，37°C孵育60分钟。回收二抗，用PBS洗涤液洗涤5分钟，3次。(整个操作过程均应避光。)
⑦、DAPI初染DAPI在室温下染色2分钟，然后用PBS洗涤液洗涤5分钟，3次。⑧、普通荧光显微镜镜检、拍照，主要检测荧光标记的红色A蛋白和绿色B蛋白，结果如下图13中的红色荧光代表目的蛋白A，图14中的绿色荧光代表目的蛋白B。两者Merge后，如图15，结果显示，EDl激活的小神经胶质细胞表达磷酸化的p-JNK。如果除了检测红色A蛋白和绿色B蛋白外，还需要检测C蛋白，按照以下方法进行操作
(2)复染
①、利用磷酸盐缓冲液清洗进行初染后的待测细胞，磷酸盐缓冲液PH值为7.4，每5分钟清洗一次，清洗3次，通过PBS清洗，镜检观察至荧光消失；
②、重新封闭加入正常牛血清白蛋白，37°C湿盒孵育60分钟。(注意样品的保湿，避免样品干燥，否则易产生较高的背景。)
③、孵育待测细胞中所含待测蛋白C和已测蛋白A的相应一抗，然后孵育荧光素标记的二抗，方法同初染的步骤⑤和⑥；
④、DAPI复染，方法同初染的步骤⑦；
⑤、普通荧光显微镜镜检、拍照，如图17所示，得到待测蛋白C的镜检照片，图中绿色荧光代表目的蛋白C,如图16所不，为已测蛋白A的镜检照片，两者Merge后,如图18,结果显示p-c-JUN发生了核易位。
权利要求
1.一种免疫荧光组织化学技术，其特征是包括以下步骤 (1)初染 ①、制备待测细胞或组织切片； ②、用H2O2/甲醇处理，降低内源性过氧化物酶所造成的非特异性背景； ③、暴露抗原结合位点； ④、封闭; ⑤、同时或单独孵育待测细胞或组织切片中所含待测蛋白A的相应一抗和所含待测蛋白B的相应一抗， ⑥、同时或单独孵育待测蛋白A的荧光素标记的二抗和待测蛋白B的荧光素标记的二抗; ⑦、DAPI初染； ⑧、普通荧光显微镜镜检、拍照，分析蛋白A和蛋白B在待测细胞或组织切片的表达情况； (2)复染 ①、利用磷酸盐缓冲液清洗进行初染后的待测细胞或组织切片，镜检观察至荧光消失; ②、重新封闭； ③、孵育待测细胞或组织切片中所含待测蛋白C的相应一抗，然后孵育荧光素标记的二抗； ④、DAPI复染 ⑤、普通荧光显微镜镜检、拍照，得到待测蛋白C的镜检照片，将其与初染得到的镜检照片进行叠加，进而在同一标本层面分析已测蛋白A、已测蛋白B和待测蛋白C的表达情况； 可以重复上述复染的步骤，分别得到待测细胞或组织切片中相关待测蛋白的镜检照片，然后在同一标本层面分别分析所有已测蛋白与待测蛋白的表达情况。
2.根据权利要求1所述的一种免疫荧光组织化学技术，其特征是复染时，采用的磷酸盐缓冲液PH值为7. 4，每5分钟清洗一次，清洗3次。
3.根据权利要求1或2所述的一种免疫荧光组织化学技术，其特征是重新封闭时采用的封闭剂为正常山羊血清或牛血清白蛋白。
4.根据权利要求1或2所述的一种免疫荧光组织化学技术，其特征是复染时，重新封闭后，将已测蛋白A或已测蛋白B与待测蛋白C同时进行复染，普通荧光显微镜镜检，即可同时得到蛋白A或蛋白B与蛋白C的镜检照片，进而在同一标本层面直接分析蛋白A或蛋白B和待测蛋白C的表达情况。
全文摘要
本发明属于免疫分析和生物技术应用领域，具体为一种免疫荧光组织化学技术，解决现有免疫荧光组织化学技术在使用过程中存在诸多缺陷的问题，包括初染，分析蛋白A和蛋白B在待测细胞或组织切片的表达情况；然后复染利用磷酸盐缓冲液清洗待测细胞或组织切片，镜检观察至荧光消失；重新封闭；孵育待测细胞或组织切片中所含待测蛋白C的相应一抗，然后孵育荧光素标记的二抗；DAPI复染；普通荧光显微镜镜检、拍照，得到待测蛋白C的镜检照片，与初染得到的镜检照片进行叠加，分析已测蛋白A、B和待测蛋白C的表达情况。操作可控性强、特异性强、准确度高、用较低的实验成本实现较高的研究要求，为临床免疫荧光组织化学研究提供广泛的应用范围。
文档编号G01N33/68GK103048470SQ20121055467
公开日2013年4月17日 申请日期2012年12月20日 优先权日2012年12月20日
发明者覃秀桃, 王耀琴, 杨利军, �：Ａ�, 许素铭, 张旻 申请人:山西医科大学
