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专利名称：热缩组合式微通道芯片、制备及应用方法
技术领域：
本发明涉及一种热缩组合式微通道芯片、制备及应用方法。
背景技术：
生物杂交技术是利用互补的核苷酸序列、蛋白抗原或抗体通过特异性的结合形成稳定的杂合分子，从而实现对靶分子的特异性检测。而生物芯片技术是指在支持物上不同空间位置上固定各种特异的探针分子，然后与经标记的样品分子杂交，实际上就是一种大规模集成固相杂交。毛细管等封闭式微通道内杂交具有杂交反应迅速、灵敏、特异的优势， 但是在毛细管内不同空间位置上的探针分子的固定存在较高的技术壁垒，且造价昂贵，不利于规模生产。

发明内容
本发明的目的是提供一种热缩组合式微通道芯片、制备及应用方法，在基质槽内壁不同位置固定探针分子、利用扩张状态的记忆材料在结晶熔化温度时发生收缩的原理， 使之与基质槽紧密结合形成微通道芯片，并应用于核酸检测、蛋白抗原抗体检测以及环境生物毒素检测的领域。本发明所采用的技术方案为
热缩组合式微通道芯片的制备方法，其特征在于 由以下步骤实现
步骤一将带有U型槽的玻璃基质置于体积浓度为6. 5%的酸溶液中，70°C水浴超声清洗1小时；再置于质量浓度为10%的碱溶液中，80°C水浴超声清洗1小时；超纯水清洗后，真空干燥30分钟；
步骤二 对玻璃基质的U型槽内壁进行氨基化处理和醛基化处理； 步骤三体积为0. 1 μ L、摩尔浓度为10 μ mol/L生物素标记的核酸探针溶液经毛细作用吸入内径为250 μ m玻璃点样管内，加至玻璃基质的U型槽内壁，室温避光静置M小时， 在质量浓度为0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液中超声清洗5分钟，超纯水清洗3次，真空干燥 30分钟，4°C保存；
步骤四将内径为3. 0 mm，热缩比为2 1的铁氟龙透明高聚物热缩材料套管置于体积浓度为6. 5%的酸溶液中，超声清洗30分钟；再置于质量浓度为10%的碱溶液中，超声清洗 30分钟，超纯水清洗；100 μ L无水乙醇来回穿梭冲洗30分钟，超纯水清洗；真空冷冻干燥， 洁净工作区保存，室温保存；
步骤五将U型槽内固定有核酸探针的玻璃基质放置于清洗后的热缩材料套管中， 80°C真空干燥箱内均勻受热5分钟，热缩后套管高度透明，与玻璃基质的U型槽结合紧密。步骤一中的酸溶液为硝酸溶液，碱溶液为氢氧化钠溶液。步骤二中的氨基化处理由以下步骤实现经步聚一处理后的带有U型槽的玻璃基质浸泡于体积比为1 :9的3-氨基丙基三甲氧基硅烷/甲苯溶液中，置于80°C水浴超声30分钟，重复4次，1000转/分钟水平式离心5分钟；依次用分析纯甲苯溶液、体积浓度为95% 的乙醇溶液超声10分钟；
步骤二中的醛基化处理由以下步骤实现将经过氨基化处理过的带有U型槽的玻璃基质置于体积浓度为10%的戊二醛磷酸缓冲液中，室温放置M小时，纯净水内超声清洗5分钟，真空干燥。步骤四中的酸溶液为硝酸溶液，碱溶液为氢氧化钠溶液。如所述的制备方法得到的热缩组合式微通道芯片。热缩组合式微通道芯片的应用方法，其特征在于 由以下步骤实现
步骤一芯片腔道内吸入15μ L的预杂交液，热缩组合式微通道芯片垂直固定于杂交仪内旋转杆上，在42°C、40转/分钟的条件下，预杂交液在微通道芯片腔道内穿梭20分钟， IOml超纯水以30ml/min流速冲洗微通道芯片腔道，1000转/分钟水平式离心3分钟；
步骤二 脱氧核苷酸序列靶分子与杂交溶液按1 :4体积比混合得到杂交反应液，杂交仪内，42 、15μ L杂交反应液、40转/分钟的条件下，在微通道芯片腔道内穿梭30分钟；
步骤三55°C条件下，将5. Oml洗脱液1以lOml/min流速冲洗微通道芯片腔道，然后将 IOml洗脱液2以lOml/min流速冲洗微通道芯片腔道；
步骤四芯片腔道内吸满由PH为7.0的磷酸盐缓冲液经1500倍稀释后的亲和链霉素-碱性磷酸酶，于37°C下避光放置20分钟，再由10ml、pH为7. O的磷酸盐缓冲液以IOml/ min流速冲洗芯片腔道；
步骤五将25 μ L显色液加入微通道芯片腔道，37°C下避光放置20分钟； 步骤六观察实验结果并拍照记录。所述的步骤一中的预杂交液成份为lOOug/ml鲑鱼精、质量浓度为0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液、质量浓度为0. 1%牛血清白蛋白和5X柠檬酸钠缓冲液。所述的步骤二中的杂交溶液的成份为体积浓度为50%的去离子甲酰胺、5X柠檬酸钠缓冲液和质量浓度为0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液。所述的步骤三中的洗脱液1，100 μ L体积的成份为20Χ柠檬酸钠缓冲液10 μ L、 质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液1 μ L和无菌超纯水89 μ L ；所述的洗脱液2，100 μ L 体积的成份为20 X柠檬酸钠缓冲液0. 5 μ L、质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液Iul和无菌超纯水98. 5 μ L。所述的步骤五中的显色液的成分为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、氯化硝基四氮唑蓝和磷酸盐缓冲液，体积比为5 10 :1500.本发明具有以下优点
本发明所涉及制备方法简捷快速，检测应用时灵敏、成本低，且具有较高通量，十分适宜于生物大分样本的检测。


图1为热缩组合式微通道芯片的结构图。图2为热缩组合式微通道芯片上探针分子结合位置的示意图。图3为热缩组合式微通道芯片的化学显色结果示意图。
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图中，1-带有U型槽的玻璃基质，2-铁氟龙透明高聚物热缩材料套管，3-探针分子标记区，① ②阳性对照；③ ④阴性对照；⑤ ⑦野生型检测组；⑧ ⑩突变型检测组。
具体实施例方式下面结合具体实施方式
对本发明进行详细的说明。记忆效应是指辐射交联聚乙烯等结晶或非结晶聚合材料加热到熔点以上时，晶粒虽然溶化，但并不出现流动状态，而具有如橡胶一类物质的弹性。若此时使聚乙烯扩张，那么冷却定型后仍能保持扩张状态；如果将这种扩张聚乙烯重新加热到结晶熔化温度，这种聚合物材料会“记忆”起其未扩张时原来的形态并重新收缩恢复原样。高分子记忆材料就具有这种“形状记忆效应”的功能，是指交联的聚乙烯等结晶或非结晶聚合材料加热到熔点以上时，晶粒虽然溶化，但并不出现流动状态，而具有如橡胶一类物质的弹性，若此时使聚乙烯扩张，那么冷却定型后仍能保持扩张状态，如果将这种扩张聚乙烯重新加热到结晶熔化温度，这种聚合物材料会“记忆”起其未扩张时原来的形态并重新收缩恢复原样的功能。 用高分子记忆材料制造的透明管，加热后管径会收缩，利用这一特性可用于管内器件的固定和密封。本发明利用高分子记忆材料透明管的热缩功能，将进行了多点标记的玻璃基质进行热缩合，以得到具有较高检测通量的微通道生物芯片。本发明所涉及的一种热缩组合式微通道芯片的制备方法如下 1、带有U型槽的玻璃基质的前处理
将长5. 0cm，U型槽内径1. 8mm，外径2. Omm的U型槽玻璃基质置于体积浓度为6. 5%的硝酸溶液中，70°C水浴超声清洗1小时；再置于质量浓度为10%的氢氧化钠溶液中，80°C水浴超声清洗1小时；超纯水清洗后，真空干燥30分钟。前处理的目的是为了对U型槽进行彻底清理，去除U型槽中的尘埃等物质。2、玻璃基质U型槽内壁的化学基团修饰 (a)玻璃基质U型槽内表面的氨基化处理
经步聚1处理后的玻璃基质U型槽浸泡于体积比为1 :9的3-氨基丙基三甲氧基硅烷 /甲苯溶液中，置于80°C水浴超声30分钟，重复4次，1000转/分钟水平式离心5分钟；依次用分析纯甲苯溶液、体积浓度为95%的乙醇溶液超声10分钟。( b )玻璃基质U型槽内表面的醛基化处理
将带有U型槽的玻璃基质置于体积浓度为10%的戊二醛磷酸缓冲液中，室温放置M小时，纯净水内超声清洗5分钟，真空干燥。3、玻璃基质U型槽内表面的核酸探针固定
体积为0. 1 μ L、摩尔浓度为10 μ Lmol/L生物素标记的核酸探针溶液经毛细作用吸入内径为250 μ m玻璃点样管内，加至玻璃基质U型槽内壁的靶分子标记位置，参见图2所示， 室温避光静默M小时，在质量浓度为0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液中超声清洗5分钟，超纯水清洗3次，真空干燥30分钟，4°C保存。4、高分子记忆材料套管清洗
将内径为3. 0mm，热缩比为2 1的铁氟龙透明高聚物热缩材料套管置于体积浓度为 6. 5%的硝酸溶液中，超声清洗30分钟；再置于质量浓度为10%的氢氧化钠溶液中，超声清洗30分钟，超纯水清洗；100 μ L无水乙醇来回穿梭冲洗30分钟，超纯水清洗；真空干燥30 分钟；洁净工作区，室温保存。5、一种热缩组合式微通道芯片的组合
经核酸探针固定的玻璃基质U槽放置于清洗后的热缩材料套管中，80°C烘箱内均勻受热5分钟，热缩后套管高度透明，与玻璃基质U槽结合紧密，参见图1。本发明所涉及的热一种热缩组合式微通道芯片的应用方法如下 1、微通道芯片预杂交
芯片腔道内吸入15 μ L的预杂交液，预杂交液成份为100μ g/ml鲑鱼精、质量浓度为 0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液、质量浓度为0. 1%的牛血清白蛋白和5X柠檬酸钠缓冲液，微通道芯片垂直固定于杂交仪内旋转杆上，在42°C、40转/分钟的条件下，预杂交液在微通道芯片腔道内穿梭20分钟，可适当调整旋转速度以保证预杂交液能穿梭腔道全长。IOml超纯水以30ml/min流速冲洗微通道芯片腔道，IOOOrpm水平式离心3分钟。2.脱氧核苷酸序列靶分子与杂交溶液按1 :4体积比混合得到杂交反应液，杂交溶液的成份为体积浓度为50%的去离子甲酰胺、5X柠檬酸钠缓冲液和质量浓度为0. 1% 的十二烷基硫酸钠溶液，杂交仪内，42°C、15 μ L杂交反应液、40转/分钟的条件下，在微通道芯片腔道内穿梭30分钟，可适当调整旋转速度以保证杂交反应液能穿梭腔道全长。3.杂交混合液洗脱
55°C条件下，将5. Oml洗脱液1以lOml/min流速冲洗微通道芯片腔道，100 μ L洗脱液 1的成份为20Χ柠檬酸钠缓冲液10 μ L、质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液1 μ L和无菌超纯水89 μ L ；然后将IOml洗脱液2以lOml/min流速冲洗微通道芯片腔道，100 μ L洗脱液2的成份为20Χ柠檬酸钠缓冲液0. 5 μ L、质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液 1 μ L和无菌超纯水98. 5 μ L。4.亲和链霉素-碱性磷酸酶与核酸靶序列连接
芯片腔道内吸满由ρΗ为7. O的磷酸盐缓冲液经1500倍稀释后的亲和链霉素-碱性磷酸酶，于37°C下避光放置20分钟，再由10mL、ρΗ为7. O的磷酸盐缓冲液以lOml/min流速冲洗芯片腔道。5.化学显色
将25 μ L显色液加入微通道芯片腔道，37°C下避光放置20分钟，显色液的成分为 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、氯化硝基四氮唑蓝和磷酸盐缓冲液，质量比为5 10 1500。6.结果观察
拍照记录结果。参见图3，检测结果表明阳性结果明显，阴性背景色低；1号样品检测为野性基因型；2号样品检测为野生、突变混合基因型；3号样品检测为突变基因型。
权利要求
1.热缩组合式微通道芯片的制备方法，其特征在于 由以下步骤实现步骤一将带有U型槽的玻璃基质置于体积浓度为6. 5%酸溶液中，70°C水浴超声清洗 1小时；再置于质量浓度为10%的碱溶液中，80°C水浴超声清洗1小时；超纯水清洗后，真空干燥30分钟；步骤二 对玻璃基质的U型槽内壁进行氨基化处理和醛基化处理； 步骤三体积为0. 1 μ L、摩尔浓度为10 μ mol/L生物素标记的核酸探针溶液经毛细作用吸入内径为250 μ m玻璃点样管内，加至玻璃基质的U型槽内壁，室温避光静置M小时， 在质量浓度为0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液中超声清洗5分钟，超纯水清洗3次，真空干燥 30分钟，4°C保存；步骤四将内径为3. 0 mm，热缩比为2 1的铁氟龙透明高聚物热缩材料套管置于体积浓度为6. 5%的酸溶液中，超声清洗30分钟；再置于质量浓度为10%的碱溶液中，超声清洗 30分钟，超纯水清洗；100 μ L无水乙醇来回穿梭冲洗30分钟，超纯水清洗；真空冷冻干燥， 洁净工作区保存，室温保存；步骤五将U型槽内固定有核酸探针的玻璃基质放置于清洗后的热缩材料套管中， 80°C真空干燥箱内均勻受热5分钟，热缩后套管高度透明，与玻璃基质的U型槽结合紧密。
2.根据权利要求1所述的热缩组合式微通道芯片的制备方法，其特征在于步骤一中的酸溶液为硝酸溶液，碱溶液为氢氧化钠溶液。
3.根据权利要求1所述的热缩组合式微通道芯片的制备方法，其特征在于步骤二中的氨基化处理由以下步骤实现经步聚一处理后的带有U型槽的玻璃基质浸泡于体积比为1 :9的3-氨基丙基三甲氧基硅烷/甲苯溶液中，置于80°C水浴超声30分钟， 重复4次，1000转/分钟水平式离心5分钟；依次用分析纯甲苯溶液、体积浓度为95%的乙醇溶液超声10分钟；步骤二中的醛基化处理由以下步骤实现将经过氨基化处理过的带有U型槽的玻璃基质置于体积浓度为10%的戊二醛磷酸缓冲液中，室温放置M小时，纯净水内超声清洗5分钟，真空干燥。
4.根据权利要求1所述的热缩组合式微通道芯片的制备方法，其特征在于步骤四中的酸溶液为硝酸溶液，碱溶液为氢氧化钠溶液。
5.如权利要求1所述的制备方法得到的热缩组合式微通道芯片。
6.热缩组合式微通道芯片的应用方法，其特征在于 由以下步骤实现步骤一芯片腔道内吸入15 μ L的预杂交液，热缩组合式微通道芯片垂直固定于杂交仪内旋转杆上，在42°C、40转/分钟的条件下，预杂交液在微通道芯片腔道内穿梭20分钟， IOml超纯水以30ml/min流速冲洗微通道芯片腔道，1000转/分钟水平式离心3分钟；步骤二 脱氧核苷酸序列靶分子与杂交溶液按1 :4体积比混合得到杂交反应液，杂交仪内，42 、15μ L杂交反应液、40转/分钟的条件下，在微通道芯片腔道内穿梭30分钟；步骤三55°C条件下，将5. Oml洗脱液1以lOml/min流速冲洗微通道芯片腔道，然后将 IOml洗脱液2以lOml/min流速冲洗微通道芯片腔道；步骤四芯片腔道内吸满由PH为7.0的磷酸盐缓冲液经1500倍稀释后的亲和链霉素-碱性磷酸酶，于37°C下避光放置20分钟，再由IOml、pH为7. 0的磷酸盐缓冲液以IOml/ min流速冲洗芯片腔道；步骤五将25 μ L显色液加入微通道芯片腔道，37°C下避光放置20分钟；步骤六观察实验结果并拍照记录。
7.根据权利要求6所述的热缩组合式微通道芯片的应用方法，其特征在于所述的步骤一中的预杂交液成份为lOOug/ml鲑鱼精、质量浓度为0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液、质量浓度为0. 1%的牛血清白蛋白和5X柠檬酸钠缓冲液。
8.根据权利要求6所述的热缩组合式微通道芯片的应用方法，其特征在于所述的步骤二中的杂交溶液的成份为体积浓度为50%的去离子甲酰胺、5X柠檬酸钠缓冲液和质量浓度为0. 1%的十二烷基硫酸钠溶液。
9.根据权利要求6所述的热缩组合式微通道芯片的应用方法，其特征在于所述的步骤三中的洗脱液l，100yL体积的成份为20X柠檬酸钠缓冲液10 μ L、质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液1 μ L和无菌超纯水89 μ L ；所述的洗脱液2，100 μ L体积的成份为 20 X柠檬酸钠缓冲液0.5 μ L、质量浓度为10%的十二烷基硫酸钠溶液Iul和无菌超纯水 98. 5μ L。
10.根据权利要求6所述的一种热缩组合式微通道芯片的应用方法，其特征在于所述的步骤五中的显色液的成分为5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸盐、氯化硝基四氮唑蓝和磷酸盐缓冲液，体积比为5 10 :1500.
全文摘要
本发明涉及一种热缩组合式微通道芯片、制备及应用方法。生物芯片技术中，毛细管等封闭式微通道内杂交具有杂交反应迅速、灵敏、特异的优势，但是在毛细管内不同空间位置上的探针分子的固定存在较高的技术壁垒，且造价昂贵，不利于规模生产。本发明在基质槽内壁不同位置固定靶分子、利用扩张状态的记忆材料在结晶熔化温度时发生收缩的原理，使之与U型槽内固定有探针分子的玻璃基质紧密结合形成微通道芯片，并应用于核酸检测、蛋白抗原抗体检测以及生物毒素检测的领域。本发明制备方法简捷快速，检测应用时灵敏、成本低，且具有较高通量，十分适宜于生物大分样本的检测。
文档编号G01N33/68GK102213718SQ20111007218
公开日2011年10月12日 申请日期2011年3月24日 优先权日2011年3月24日
发明者向安, 郭晏海, 颜真 申请人:中国人民解放军第四军医大学