专利名称：用于检测多聚体形式的A－β或其它聚集多肽的时间分辨荧光测定法的制作方法
技术领域：
本发明涉及对在许多人类疾病状态中观察到的多肽聚集的调控物进行检测的方法。
背景技术：
影响人群的许多严重疾病可能与不正确的多肽片段聚集密切相关，其特征为聚集体在损伤或斑块处沉积，常常导致斑块部位的异常生理学功能。例如，已经提出特定蛋白质中一段聚谷氨酰胺重复片段是许多神经学紊乱的起因，包括亨廷顿氏病和脊髓延髓性肌萎缩，而提出其它无关蛋白质聚集是朊病毒疾病(PrP聚集)、帕金森氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)(α-共核素(α-synuclein)聚集)、透析相关淀粉样变(β-2微球蛋白聚集)、角膜营养不良(角质-上皮沉积)的起因，另外在超过95％的II型糖尿病中有胰岛淀粉状蛋白多肽聚集。特别感兴趣的是阿耳茨海默氏病中β-淀粉状蛋白多肽的聚集。
阿耳茨海默氏病(AD)是神经退化性紊乱，其特征为与淀粉状蛋白斑块形成、神经纤维缠结、和相关神经元毒性有关的认知功能逐渐下降和记忆丧失。据信阿耳茨海默氏病的开始和发作既具有遗传起源又具有偶发的环境影响发作(Davies P.，Annals of the N.Y.Acad.ofSci.，9248-16，2000)。至今已经鉴定了与家族性发作AD有关的几处遗传突变。已经在淀粉状蛋白前体蛋白(amyloid precusor protein，APP)自身以及早老素-1或早老素-2基因中发现了显著参与AD发作的突变。然而，所有这些突变中的共同点是形成由称为淀粉状蛋白贝塔(Aβ)的APP分子切割片段衍生的蛋白质或老年斑，APP在患病个体的大脑中沉积，并导致神经元细胞毒性和死亡。在与AD非直接相关的另一种遗传缺陷，即与唐氏综合症有关的21号染色体三体性中，也可以检测到这种斑块形成现象。
淀粉状蛋白前体蛋白(APP)是具有大型胞质结构域和较短胞内C端区域的单一跨膜糖蛋白，天然存在几种剪接形式，它们或是751个氨基酸(Ponte等人，Nature，331525-527，1988；Tanzi等人，Nature，331528-530，1988)，或是695个氨基酸(Kang等人，Nature，325733-736，1987)，称为“正常”APP。APP695变体在神经元中更加广泛表达。
淀粉状蛋白前体蛋白切割是通过由α、β、和γ分泌酶(secretase)介导的一系列酶促反应进行的。α-分泌酶在APP770的大约第687位残基处切割APP跨膜结构域N端约12个残基，产生大型可溶性蛋白质s-APPα(它是非致病性的)以及83个氨基酸的C端片段。γ-分泌酶在C末端第711或712位氨基酸之后切割，产生称为p3的游离肽。或者，可以由β-分泌酶(天冬氨酰蛋白酶家族的成员)在第672位天冬氨酰残基之前切割APP跨膜结构域N端(Yan等人，Nature，402533-537，1999)，形成截短形式的sAPPα，称为sAPPβ。剩余C端片段还可以由γ-分泌酶在第711位残基附近切割，产生可溶性Aβ肽。γ-分泌酶根据其切割位点而生成第1-39位、第1-40位、第1-42位、或第1-43位(其中第1位紧邻随β-分泌酶切割位点)氨基酸的Aβ肽。Aβ1-40是更加丰富的切割产物，大多数细胞类型都生成这种肽。
除了由Aβ片段形成老年斑以外，在非纤维状、粒状联合中还可以检测到Aβ沉积，称为扩散斑(Tagliavini等人，Neurosci.Lett.，93191)。在正常的、健康的个体的大脑中能够检测到扩散Aβ斑，但在未患AD的个体的大脑中检测到很少的淀粉状蛋白生成性老年斑。针对Aβ肽的抗体染色揭示了扩散斑主要由高度淀粉状蛋白生成性Aβ1-42构成(Iwatsubo等人，Neuron，1345，1994)，而老年斑包含Aβ1-42和Aβ1-40肽二者的混合物。
已经鉴定了导致APP切割成Aβ肽增加的几种淀粉状蛋白前体蛋白突变。“瑞典”突变即APP770第670/671位氨基酸残基KM变成NL的突变增加了Aβ1-40和Aβ1-42二者的产量(Citron等人，Nature，360672-674，1992；Lannfelt等人，Neurosci.Lett.，15385-87，1993)。“伦敦”突变即第717位残基V变成I、G、或F的突变同样导致Aβ肽片段的产量增加(Schenk等人，Nature，400173-177，1999)。还鉴定了其它几种突变，都围绕在APP中三个分泌酶切割位点之一周围，都导致Aβ切割增加。
试图治疗AD的许多疗法都针对由分泌酶活性形成Aβ肽的过程，特别是参与将APP切割成Aβ肽的β和γ分泌酶。将APP切割成Aβ是天然酶促反应，在与神经元损伤无关的区域诸如基底膜、小动脉、和小静脉以及与AD病理学无关的大脑区域内生成Aβ肽。这些Aβ沉积通常自然扩散而非在纤维中沉积，而且细胞在整个生命过程中组成性分泌Aβ，在所有正常个体的脑脊液和血浆中都存在(Haas等人，Nature，359322-325，1992；Seubert等人，Nature，359325-327，1992)。这些和其它数据说明Aβ聚集(而非Aβ形成)代表了治疗性干预的另一个标靶。
关于阿耳茨海默氏病和与多肽聚集有关的其它疾病的治疗性干预的一种最新方法是用抑制多肽成核/聚集的试剂进行处理。目前有几种筛选测定法可用于检测与各种人类衰弱性疾病有关的聚集蛋白质或聚集多肽。
用于检测蛋白质聚集的一种独特方法称为时间分辨各向异性测量法(TRAMS Time Resolved Anisotropy Measurements)(Allsop等人，Biochem.Biophy.Res.Comm.，28558-63)，它测量溶液中荧光颗粒的运动。TRAMS要求将经过荧光标记的肽与未标记的肽以期望浓度混合，并在一段时间内进行各向异性测量。对于这种特殊测定法，使用经过修改的单一光子计数器来测量光发射光谱，其中光发射二极管的重复率为1MHz。荧光颗粒的运动随时间而减慢与聚集体数目增加有关。尽管TRAMS测定法可以测量蛋白质聚集的初始步骤，然而这种检测肽复合物的方法非常复杂，它需要不易获得的装备，且难以解释数据。
闪烁近似测定法(scintillation proximity assay，SPA)也可用于评估β-淀粉状蛋白多肽的聚集。在SPA法中，采用了三种β-淀粉状蛋白1-40，即未标记的β-淀粉状蛋白、生物素化的β-淀粉状蛋白、和[125I]标记的β-淀粉状蛋白。让这三种肽的混合物于37℃聚集4小时。此时，向混合物中加入1mg经链霉亲和素包被的SPA珠(Amersham)，并于37℃保温几个小时，在不同时间点测量(珠中的)[125I]掺入。为了执行此方案，每次测定需要大量的β1-40，而且每次测定需要大量的时间来完成。因此，这种测定法不具有制药工业所需要的高通量能力，并且会使用潜在有害的试剂来完成该方案。
在用于检测β-淀粉状蛋白聚集的标准酶联免疫吸收测定法(ELISA)方案中(Howlett等人，FEBS Letters，417249-251，1997)，用针对β-淀粉状蛋白肽的单克隆抗体(如抗体6E10，Senetek，纳巴，加利福尼亚州)包被聚苯乙烯微量滴定板。在另一个微量滴定板中，用适当缓冲液将β-淀粉状蛋白稀释至期望浓度，并在存在或缺乏测试化合物时让其聚集过夜。保温24小时后，将聚集混合物由微量滴定板转移至经β-淀粉状蛋白抗体包被的板，并让其结合抗体。然后向测定板中加入第二生物素化的6E10抗体以结合β-淀粉状蛋白聚集体。第二6E10只有在测定孔中存在与其它β-淀粉状蛋白肽而非第一抗体很好结合的β-淀粉状蛋白分子时才会发生结合。为了检测结合的生物素化抗体，向孔中加入经Eu3+标记的链霉亲和素，并通过适当波长的激发来进行检测。检测到的Eu3+荧光的量将随着测试化合物对β-淀粉状蛋白聚集的抑制而降低。
尽管这种方法可用于检测β-淀粉状蛋白肽的聚集，然而对肽特异性单克隆抗体的要求使这种测定法受到了特定抗体的可用性以及抗体对肽的特异性和结合亲和力的限制。
Berthelier等人在Anal.Biochem.，295227-236，2001中描述了用于检测聚谷氨酰胺聚集体延伸的测定法，其中用添加了额外生物素化聚谷氨酰胺肽的预先形成的聚谷氨酰胺聚集体包被微量滴定板。使用经Eu3+标记的链霉亲和素测量这些新加入的肽的掺入速率，以检测结合的生物素分子，其对应于整合的聚谷氨酰胺。然而，这种测定法不能确定测试化合物是否影响聚集或成核事件的预防，而只能提供调控多肽继续聚集的化合物。
为此目的，Perutz和Windle在Nature，412143-144，2001中讲道“对于在以年计的时间尺度上发生的任何过程，控制步骤将是成核，而非生长，而且它将以随机时间间隔发生”。
因此，本领域需要有改进的材料和方法，能够克服设计用于检测多肽聚集的现有方案的缺点，由此促进新疗法的开发并降低开发成本。
发明概述本发明涉及用于测定β-淀粉状蛋白和其它诱导疾病的聚集多肽的起始聚集或成核的起因以及用于描绘专门针对几种人类疾病状态中多肽聚集和斑块形成的化合物和附加疗法的材料和方法。本发明提供了可用于鉴定能调节多肽聚集的化合物的改进方法，这样的化合物可用于开发针对特征在于多肽有害聚集的许多人类疾病状况的疗法。
例如，本发明提供了用于鉴定多肽聚集调控物的方法，包括1)提供附着了第一结合配偶体的基质，其中第一结合配偶体结合第二结合配偶体；2)提供包含多肽单体的多肽组合物，其中至少一些单体可经修饰而包含第二结合配偶体；3)在存在和不存在待测试剂时在多肽单体聚集形成多聚体的条件下将多肽组合物保温；4)使多肽组合物接触附着了第一结合配偶体的基质；并5)通过检测与基质结合的多肽聚集体来测量多肽聚集，其中检测包括测量第二结合配偶体，而且其中根据存在和不存在待测试剂时多肽聚集不同指示待测试剂为调控物。
在执行该方法时，可以在接触步骤之前或同时进行保温步骤。
本发明的第一和第二结合配偶体是显示彼此有高结合亲和力和特异性且彼此非�？焖俳岷�(相对于多肽聚集的发生速率而言)的成对分子。其中至少一种必须可附着于固相基质，而且至少一种必须可附着于多肽。例示类型的结合配偶体包括高亲和力结合小分子；肽标签及其单克隆抗体；荧光团及其单克隆抗体；和酶及其底物。例示配对包括链霉亲和素/生物素、抗六聚组氨酸(His6标签)抗体/His6肽标签、抗生物素/生物素分子、以及抗谷胱甘肽/谷胱甘肽标签。在一个优选的实施方案中，本发明的第一和第二结合配偶体对是由链霉亲和素/生物素分子构成的。
“第一”结合配偶体如此命名是因为它附着于基质上。基质可以是适用于定量测定法的任何固相支持物，诸如聚合物珠或固相容器诸如聚苯乙烯培养皿。为了能够以高通量形式进行测定，特别涵盖了微量滴定板，优选96孔、384孔、或1536孔聚苯乙烯微量滴定板，更优选384孔聚苯乙烯微量滴定板。使用任何合适技术将第一结合配偶体附着于基质，诸如在适当缓冲液中用第一结合配偶体预先包被板，所述缓冲液例如是磷酸盐缓冲盐水(PBS)、不含镁/钙的PBS、碳酸钠、或类似。
上文所述方法包括提供包含多肽单体的多肽组合物的步骤。多肽单体是能够在生理学条件下与相似多肽结合而形成聚集体的未聚集的肽或多肽。该方法在其聚集体与疾病发病机理有关的多肽的实践中特别有用，诸如在阿耳茨海默氏病、朊病毒疾病、帕金森氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、透析相关淀粉样变性、角膜营养不良、和糖尿病中聚集的那些多肽。例示多肽包括β-淀粉状蛋白、朊病毒蛋白质、α-共核素、β-2微球蛋白、和胰岛淀粉状蛋白多肽。
多肽组合物优选包含其聚集与病理学疾病状态有关的多肽。例示多肽单体包括但不限于β-淀粉状蛋白1-40、β-淀粉状蛋白1-42、β-淀粉状蛋白1-43、聚谷氨酰胺重复片段、朊病毒蛋白质(PrP)、α-共核素、或胰淀粉状蛋白。在一个优选的实施方案中，本发明的多肽选自β-淀粉状蛋白1-40、β-淀粉状蛋白1-42、β-淀粉状蛋白1-43，最优选的是β-淀粉状蛋白1-40。也可以采用不同Aβ形式的混合物。已经发现上述多肽的聚集与病理学状态有关，诸如阿耳茨海默氏病、唐氏综合症、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、朊病毒疾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、卢伊体(Lewy Bodies)、或II型糖尿病。在一个优选的实施方案中，病理学状态选自阿耳茨海默氏病、唐氏综合症、卢伊体、或II型糖尿病。本发明特别涵盖了阿耳茨海默氏病中多肽聚集的评估。
“多肽组合物”是通过在溶液中以能够发生聚集的浓度(不含抑制剂时)一起混合多肽单体而形成的。这些溶液和浓度易于根据经验和文献确定，或者通过简单的剂量-应答型分析来选择以期望速率(如以分或小时计)发生可检测到的聚集的浓度。Aβ的例示溶液和浓度范围是溶于0.1％乙酸的2mg/mlβ-淀粉状蛋白肽储液至在含任何或所有下列成分的适当测定或反应缓冲液中稀释至20-50μg/ml的Aβ肽牛血清清蛋白、牛乳蛋白质、或相似高分子量蛋白质、以及温和去污剂诸如吐温20、吐温40、或相似。
为了执行该方法，至少一些多肽单体经“修饰”或化学偶联而包含第二结合配偶体。换言之，第二结合配偶体并非多肽的表位或其它天然特性。事实上，多肽经修饰而附着第二结合配偶体。在一种变化中，修饰包括表达嵌合多肽，其中多肽氨基酸序列通过附着表位标签诸如His6标签或血球凝集素(HA)标签而得到修饰。在一种优选的变化中，多肽通过化学反应而得到修饰，如通过常规技术将生物素分子附着于肽上。在一个优选的实施方案中，至少一些单体不含第二结合配偶体。
“混合”在这里可以定义为在相同板/孔中将本发明包含第二结合配偶体的多肽单体的溶液或悬浮液任选与不含第二结合配偶体的多肽单体一起保温。根据经验选择包含与不含第二结合配偶体的单体的比例以改进测定法的信号背景测量值。对于上一段落中描述的Aβ溶液而言，不含第二结合配偶体的单体与包含第二结合配偶体的单体的优选比例的范围是5∶1至1∶1，更优选的是，不含第二结合配偶体的单体与包含第二结合配偶体的单体的比例是2∶1。可以在存在或不存在待测试剂时进行这一单体混合而形成多肽组合物。
接触优选在液态环境中进行，诸如水性缓冲液，诸如不含镁/钙的PBS。在一个实施方案中，多肽组合物接触基质的时间范围是15分钟至2小时。在一个优选实施方案中，多肽组合物与基质的接触时间是30分钟。
该方法任选包括清洗步骤，其中在测量多肽聚集之前清洗基质，以降低由未结合多肽引起的背景测量值。在将多肽组合物保温之后和检测聚集之前用适当缓冲液加去污剂清洗基质。例如，在一个优选实施方案中，用含温和去污剂且不含镁/钙的PBS进行清洗，尤其可使用温和去污剂吐温20。
测量步骤必需测定(优选定量)多肽聚集体是否结合基质以及具体结合量，而且包括检测(测量)与基质结合(间接)的第二结合配偶体。在一个优选实施方案中，测量是如下实现的在第一结合配偶体将结合第二结合配偶体的条件下使基质接触经标记的第一结合配偶体，清洗基质以除去未结合的标记第二结合配偶体，然后测量仍然与基质保持结合的标记物的量。依照这种测定法设计，由于基质上的第一结合配偶体对至少一些所述多肽上存在的第二结合配偶体的亲和力，在接触步骤的过程中基质将结合多肽单体和/或多肽聚集体。然而，与基质结合的未聚集多肽单体在测量步骤中将不会检测到，因为经标记的第一结合配偶体不能附着到这些单体上(第二结合配偶体被基质附着所占据)。
相反，包括包含第二结合配偶体的至少两个单体的多肽聚集体在测量步骤的过程中可检测到，因为只有一个第二结合配偶体附着于包含第一结合配偶体的基质上，而且聚集体中的至少一个第二结合配偶体是未附着的且暴露的，因而在检测步骤中可以结合经标记的第一结合配偶体。因此测量与基质结合的标记物可测定出聚集的情况。
标记物优选在很低浓度可以检测且可以定量。在优选的实施方案中，附着于第一结合配偶体的标记物是放射性核素、荧光团、发色团、诸如此类。在高度优选的实施方案中，标记物选自下组35S、125I、32P、3H、铕(Eu3+)分子、荧光素、藻红蛋白、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、以及在本领域常用检测方法中展示可预测的激发的类似分子。尤其优选其中第一结合配偶体包含铕标记物的实施方案。
标记物的检测方法取决于与第一结合配偶体相连的标记物的类型。在一个实施方案中，使用闪烁计数法来检测放射性核素，使用适当的激发波长来检测荧光团诸如异硫氰酸荧光素(FITC)，使用混合后变色并可在适当波长下检测的底物/酶复合物来检测发色团。在一个优选实施方案中，通过用所需波长的光来激发和使用本领域常用方法进行定量来检测铕可检测标记物。
在一种变化中，本发明的方法还包括制造在制药学可接受载体中包含如上文概述所鉴定的调控物化合物的调控物组合物的步骤。这样的制造步骤是有用的，因为它能够将调控物导入基于细胞的测定法和/或活的动物模型或人中，从而在与疾病治疗功效更加相关的系统中评估其调控效果。“制药学可接受载体”意指与本发明调控物组合物相容且适合施用于人或动物的任何赋形剂、稀释剂、佐剂或载体。通常，载体将是无菌的且不含热原，可以是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、或本领域常用于投递治疗剂的其它载体。
该方法任选还包括将调控物组合物施用于易受多肽聚集影响或因多肽聚集而展示病理学状态的哺乳动物，更优选人，并测定因施用该调控物组合物而引起的多肽聚集或病理学状态改善的步骤。
“施用”意指通过本领域知道的任何医学可接受手段将本发明的调控物组合物导入展示由聚集诱导的病理学状态的受试者。可以通过几种路径来施用调控物组合物，包括但不限于静脉内注射、皮下注射、鼻内摄取、口服摄取、局部施用、诸如此类。优选能够实现将试剂投递至多肽聚集部位的路径。还包括在其它哺乳动物受试者中实践本发明的方法，尤其是常规用作证明人体内治疗功效的模型的哺乳动物(如灵长类、猪、犬、或小型啮齿类诸如兔、大鼠和小鼠)。
聚集或病理学状态的“改进”意指因施用调控物化合物而导致任何可检测多肽聚集的减轻、由多肽聚集引起的病理学状态的症状(诸如阿耳茨海默氏病患者中的痴呆)的减轻。疾病发展减缓或停滞也可认为是疾病方面的改进，所述疾病诸如是阿耳茨海默氏�。渌媸奔涠⒄购投窕�。
在一个相关方面，本发明提供了包括以有助于实践本发明方法的方式一同包装的材料的试剂盒。在一个最简单的实施方案中，这种试剂盒包括组合物(如基质、第一结合配偶体、第二结合配偶体、多肽单体、可检测标记物)，它们包装在诸如密封瓶或管等贴有标签的容器中，或者置于描述了组合物在实践本发明方法时的用法的包装中。在另一个实施方案中，该试剂盒包括与附着了第二结合配偶体的聚集多肽一起包装的附着了第一结合配偶体的基质。该试剂盒还优选包括附着了可检测标记物的第一结合配偶体。
由本申请的整体内容，本领域熟练技术人员十分清楚本发明的其它特征和变化，所有这些特征意欲作为本发明的方面。
同样，本文所述发明特色可以重新组合成额外实施方案，它们同样意欲作为本发明方面，不管上文是否专门提到这些特色组合作为本发明的方面或实施方案。同样，只有本文描述成对本发明至关重要的那些限定可以理解成限定；本文没有描述成至关重要的、未作限制的本发明变化意欲作为本发明的方面。
除了上文以外，作为额外的方面，本发明还包括以任何方式与上文专门提及的变化相比范围更窄的本发明所有实施方案。尽管申请人发明了本文所附权利要求的完整范围，本文所附权利要求并非意欲将其他人的现有技术工作涵盖到它们的范围内。因此，如果专利局或其他实体或个人向申请人指出现有技术涵盖在本发明权利要求范围内，申请人保留按照适用的专利法修改权利要求以重新限定这种权利要求的保护主题、从而由这种权利要求的范围内专门排除这些现有技术或其明显变化的权利。由这些修改权利要求限定的发明也意欲作为本发明的方面。
附图描述
图1的示意性流程解了依照本发明的聚集体测定法。
图2描绘了使用调控聚集的测试化合物进行的聚集体测定法。
发明详述本发明提供了用于鉴定可用于调控与许多人类疾病状态发作有关的多肽聚集的化合物的方法。这些化合物可用于开发以多肽聚集为特征的疾病的治疗。例如，已经提出特定蛋白质中的聚谷氨酰胺重复片段是许多神经学紊乱的起因，包括亨廷顿氏病和脊髓延髓性肌萎缩，而提出其它无关蛋白质的聚集是朊病毒疾病(PrP聚集)、帕金森氏病和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)(α-共核素聚集)、透析相关淀粉样变性(β-2微球蛋白聚集)、角膜营养不良(角质-上皮沉积)的起因，另外在超过95％的II型糖尿病中有胰岛淀粉状蛋白多肽的聚集，以及在阿耳茨海默氏病中有β-淀粉状蛋白多肽的聚集。
本发明方法的一个优点是这种快速检测多肽聚集的方法能够快速评估大量的潜在调控物化合物。本发明的另一个优点是降低每项测定所需要的试剂量可降低每份样品的测定成本。
可以如下文所示执行本发明的例示性方法，该方法概述于图1中。正如图形10所描述的，用第一结合配偶体4诸如链霉亲和素包被96孔聚苯乙烯皿基质2，即将基质2与含有第一结合配偶体4的溶液一起保温，从而生成图形10的包被板。
如图形20所示，通过制备其中一些单体16连接第二结合配偶体12的溶液来提供多肽单体组合物8，如β-淀粉状蛋白1-40单体，其中所述第二结合配偶体12的实例是与链霉亲和素结合的生物素。如图形30所示，首先将单体组合物保温24，从而使单体形成多肽聚集体28、44。在存在或缺乏可能调控即抑制或促进单体聚集的测试化合物时进行保温24。
如图形30所示，保温后，多肽组合物可以包含多种种类，诸如多肽单体8、连接了生物素的多肽单体16、和多肽聚集体28、44。然后将此经过保温的多肽组合物接触32图形10中所描述的包被板，其中包含含有链霉亲和素第一结合配偶体4的基质2。如图形40所描述的，在接触步骤中包含至少一个生物素分子的多肽种类将结合图形10的包被板。来自与图形10的包被板结合的多肽组合物的分子可能包含几种分子只连接了生物素第二结合配偶体34且只包含一个链霉亲和素结合位点的单一多肽单体；含有联合了缺乏第二结合配偶体的单体44的生物素化多肽单体、并因此也只包含一个链霉亲和素结合位点的聚集分子；以及含有联合了其它生物素化单体28的生物素化多肽单体、并因此包含两个或多个链霉亲和素4结合位点的聚集化单体。聚集分子28中的多个链霉亲和素结合位点使得至少一个β-淀粉状蛋白1-40-生物素能够附着到基质包被的板10上，而相联合的β-淀粉状蛋白1-40-生物素分子上未占用的生物素12使得能够使用与可检测标记物54诸如铕3+相连的链霉亲和素第一结合配偶体4来检测聚集单体28。附着于基质上的单体34缺乏任何游离生物素。
通过检测已经结合至图形10的包被板上的多肽聚集体28来测定多肽聚集。通过使图形50(包含与可检测标记物54相连的第一结合配偶体4)中的检测剂接触45图形10的基质包被板来检测结合的聚集分子。如图形60所示，检测剂50只附着于结合于基质、包含两个或多个生物素化多肽单体28的聚集多肽上。使用本领域常用技术，通过在恰当波长64激发Eu3+标记物54并随后用检测仪65以吸光度单位测量所发射的铕3+荧光66来检测结合于基质的链霉亲和素-Eu3+50。测量到的铕3+54激发程度反映了所结合的检测剂50的量，并因此与保温步骤24中所发生的单体聚集量相关。与对照化合物相比导致Eu3+54检测水平改变的测试化合物认为是多肽单体聚集的调控物。
使用图1中所描述和定义的相同符号和图形，图2展示了聚集测定法根据保温步骤24过程中所添加的测试化合物而可能发生的三种结果。图2B展示了图1所示的聚集，使用不调控单体聚集天然过程的对照化合物(或只使用缓冲液)进行。图2A展示了在保温步骤24过程中所添加的测试化合物是多肽聚集抑制剂时所发生的聚集。图2A的图形40例示了对多肽聚集的抑制导致较少的聚集单体28结合于基质包被板10上。如图2A的图形60所示，聚集单体的减少导致经标记的第一结合配偶体50与基质结合的机会较少，从而降低了通过Eu3+荧光测量可检测到的标记物54的量。
图2C概述了在保温步骤24过程中所施用的待测试剂可增强多肽聚集的条件。图2C的图形40显示多肽单体聚集的促进将导致结合于基质包被板10上的聚集单体28增加。如图2C的图形60所示，多肽聚集的增强导致更大量的经标记第一结合配偶体50附着于聚集单体28上的游离第二结合配偶体处。聚集增加以及随后经标记第一结合配偶体50的结合增加导致结合于基质的可检测标记物54的增加，导致所发射的Eu3+信号与对照化合物相比有所扩大，从而可对对测试化合物调控多肽单体聚集的能力进行定量测量。
本发明中所使用的聚集多肽包括已知与人类疾病状态有关的多肽，其中“聚集”定义为多肽单体彼此结合而形成更高级的分子结构。在一个优选发明中，多肽可以选自下组由β-分泌酶切割APP所产生的任何肽构成的β-淀粉状蛋白多肽，尤其包括β-淀粉状蛋白1-39、β-淀粉状蛋白1-40、β-淀粉状蛋白1-41、β-淀粉状蛋白1-42、和β-淀粉状蛋白1-43；至少27个谷氨酰胺残基至多达45个谷氨酰胺重复的聚谷氨酰胺重复片段，最优选38个谷氨酰胺残基的重复片段；由α-共核素中发现的共有11残基重复片段构成的至少11个氨基酸的α-共核素肽；朊病毒蛋白质，以及其中所述肽包含序列NFGAIL(Azriel等人，J.Biol.Chem.，27634156-34161，2001)的胰淀粉状蛋白肽(长度范围为6-37个氨基酸)。
本发明的第一结合配偶体和本发明的第二结合配偶体选自显示彼此间有高结合亲合力且易于应用于许多不同多肽的分子对，可以选自但不限于下组链霉亲和素/生物素、抗六组氨酸(His6标签)抗体/His6肽标签、抗生物素/生物素分子。第一结合配偶体可以选自但并不限于下组链霉亲和素、抗His6抗体、抗myc标签、抗血凝素、抗荧光团(如抗异硫氰酸荧光素)、抗生物素、诸如此类。
本发明的第二结合配偶体可选自但并不限于下组生物素分子、碱性磷酸酶、荧光团、遗传工程化的肽标签(诸如与聚集多肽相连的组氨酸His6标签)、myc标签、血凝素标签、诸如此类。通过本领域众所周知的方法，诸如商品化生产的生物素化试剂盒(Sigma，圣路易斯，密苏里州)，或有机化学中常用的将小分子化学附着于肽或蛋白质的其它方法(参阅如《Current Protocols in Protein Chemistry》即《蛋白质化学通用方案》，John Wiley & Sons，2001)，可以将生物素、荧光团、和包含第二结合配偶体的其它涵盖小分子与本发明的多肽相连。使用本领域众所周知的标准重组DNA方法(参阅如《Current Protocols in Molecular Biology》即《分子生物学通用方案》，John Wiley & Sons，2001)或常规肽合成技术，将遗传工程化标签如His6和myc标签可操作连接本发明的多肽。
在一个优选的实施方案中，本发明的第一和第二结合配偶体对由链霉亲和素/生物素分子构成。
本发明的第一结合配偶体附着于本发明的基质上。本发明的基质可以是适于执行本发明方法的任何材料或物质，诸如聚合物珠或固相容器诸如聚苯乙烯培养皿，尤其包括聚苯乙烯微量滴定板，优选96孔、384孔、或1536孔聚苯乙烯微量滴定板，更优选384孔聚苯乙烯微量滴定板。第一结合配偶体在合适缓冲液中附着于基质上，诸如磷酸盐缓冲盐水(PBS)、不含镁/钙的PBS、碳酸钠、或类似。
为了测量多肽聚集，可以将第一结合配偶体可操作连接标记物，其中标记物是可检测的标记物，优选在很低浓度下可探测和可定量的标记物。在一个优选的实施方案中，附着于第一结合配偶体上的标记物可以是放射性核素、荧光团、发色团、诸如此类。在一个更优选的实施方案中，标记物可以选自下组35S、135I、32P、3H、铕(Eu3+)分子、荧光素、藻红蛋白、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、以及在本领域常用检测方法中展示可预测激发的类似分子。
本发明方法中所采用的待测试剂可以是期望测试其调控多肽聚集的能力的任何有机或无机化学或生物学分子。由于最优选的待测试剂是那些可以作为治疗剂施用的试剂，因此显然优选具有有限毒性的分子。然而，可以在后续测定中筛选毒性并常�？杀灰┪锘Ъ矣煞肿印吧杓葡钡舳拘�。尤其包括筛选化学文库，诸如那些通常由制药公司保存的、由化学合成化合物和天然化合物组成的文库以及组合文库。
化学文库可以包括已知化合物、已知化合物的专有结构类似物、或由天然产物筛选所鉴定的化合物。
天然产物文库是由天然来源分离的物质的集合，所述天然来源通常指微生物、动物、植物、或海洋生物。通过微生物发酵及随后分离和提取发酵液或者通过从微生物或其组织(植物或动物)直接提�。梢越烊徊镉善淅丛粗蟹掷氤隼�。天然产物文库包括聚酮化合物、非核糖体肽、及其变体(包括非天然存在的变体)。有关综述请参阅Cane等人，Science，282，63-68，1998。
组合文库是由大量的相关化合物诸如肽、寡核苷酸、或其它有机化合物组成的混合物。这些化合物可以相对直接的通过传统自动合成方案、PCR、克隆或专有合成方法来设计和制备。特别感兴趣的是肽和寡核苷酸组合文库。
其它感兴趣的文库包括肽、蛋白质、拟肽(peptidomimetic)、多种类似物合成集合(multiparallel synthetic collection)、重组体、和多肽文库。关于组合化学及由此产生的文库的综述参阅Myers，Curr.Opin.Biotechnol.，8701-707，1997。
通过评估待测试剂而鉴定的调控物化合物可以配制成组合物，其中还包括担当制药学载体、赋形剂、或介质的制药学可接受(即无菌且无毒)液体、半固体、或固体稀释剂。还可以对以这种方式配制的调控物进一步筛选其在体内如在疾病的动物模型中的调控活性；或者可以施用于临床试验中的人；或者可以作为药物而生产和出售。依照本发明的调控物组合物可使用适当的制药学可接受载体以任何合适方式施用，如制药学可接受稀释剂、佐剂、赋形剂、或载体。依照本发明方法施用的组合物优选包含制药学可接受载体溶液，诸如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、或常规用于投递治疗剂的其它载体。
调控物组合物可以包装成便于投递的形式。可以将组合物装入胶囊、囊片(caplet)、小袋(sachet)、扁囊、明胶、纸、或其它容器内。剂量单位可以包装成如片剂、胶囊、栓剂、或扁囊剂。
还可以通过任何常规方法将本发明所鉴定的调控物组合物导入由于多肽聚集造成病理学状态而需要治疗的受试者，包括如通过静脉内、皮内、肌肉内、脑内、腹膜内、或皮下注射；通过口服、经皮、舌下、鼻内、肛门、或阴道投递。治疗可以包括在一段时间内的单一剂量或多重剂量。可以通过标准的剂量-应答研究来确定服药量，首先是动物模型，然后是临床测试，找出针对特定疾病状态和患者群的最佳剂量。指定剂量中调控物组合物的量将根据接受治疗的个体的体重(通常以mg/kg为基础)以及所治疗疾病的特征而变化。
参考下文实施例将更容易理解本发明的方法，提供这些实施例只是作为例示而非意图限制本发明。
实施例1β-淀粉状蛋白多肽聚集体的时间分辨荧光测定法下文实施例是本发明的一个实施方案，它例示了用于鉴定β-淀粉状蛋白多肽聚集的调控物的方法。在体外使溶液状态的β-淀粉状蛋白多肽单体倾向于由肽单体聚集形成较大的多聚体分子。β-淀粉状蛋白单体在体内的聚集是造成阿耳茨海默氏病中神经元损伤的主要原因。本发明可以对β-淀粉状蛋白聚集以及外界化合物或待测试剂对β-淀粉状蛋白肽聚集体形成程度的影响进行灵敏的体外分析。
β-淀粉状蛋白1-40(Aβ)和生物素标记的β-淀粉状蛋白1-40肽购自Biosource(卡马里奥，加拿大)。分别将在0.1％乙酸中稀释并调整至80％肽含量的β-淀粉状蛋白和生物素化β-淀粉状蛋白贮液用反应缓冲液(Dulbecco氏PBS pH7.4，0.02％吐温20)稀释至83μg/ml和42μg/ml。然后将两种β-淀粉状蛋白产品的等量混合物调节至总β-淀粉状蛋白终浓度为62.5μg/ml，未生物素化的Aβ多肽与生物素化的Aβ多肽的最终比例是2∶1。在存在测试化合物的条件下分析聚集时，向384孔聚苯乙烯板(Nunc)中进行分析的每个孔中加入5μl稀释过的测试化合物(120μM，溶于10％DMSO)。以一定浓度范围加入测试化合物。将20μlβ-淀粉状蛋白反应混合物分配到384孔板的每个孔中，最终的测定条件是在25μl的终体积中含有24μM测试化合物、2％DMSO、和50μg/mlβ-淀粉状蛋白。然后用锡箔(Corning)密封平板，并于37℃保温24小时。
24小时后，用多滴头移液枪将35μl反应缓冲液加到经链霉亲和素包被的平板中。用多滴头移液枪将与待测试剂一起保温后所产生的、现在包含聚集形式或单体形式Aβ的14μl聚集测定平板培养液加到装有35μl缓冲液的经链霉亲和素包被的平板中。将平板于室温保温30分钟，用反应缓冲液清洗三次(90μl/次洗涤)，并将溶于DELFIA测定缓冲液(Wallac)中的Eu3+标记链霉亲和素(250ng/ml，Wallac，/Perkin Elmer Life Sciences，波士顿，马萨诸塞州)以50μl/孔的量加到测定孔中并于室温保温2小时。用反应缓冲液清洗平板并向每个孔中加入75μl DELFIA增强液(Wallac)，并在TRF读板仪上读数(激发波长为337nm，发射波长为620nm)。
TRF聚集测定法的结果表明，添加诸如已知Aβ聚集抑制剂ApoE3或QKLVFF肽等测试化合物(Lowe等人，Biochemistry，407882-7889，2001)(Bachem Bioscience，费城，宾夕法尼亚州)分别防止了75％和44％的Aβ聚集。使用优先化合物文库进行的进一步筛选显示，与未加入测试化合物的对照孔相比，对Aβ聚集的抑制超过90％。此TRF测定法的背景小于由阳性对照孔观察到的总Eu3+吸光度的0.7％。因此，这种非常灵敏的TRF聚集测定法被证明是可用于鉴定以高或中水平抑制而防止Aβ聚集的化合物的有效方法。
实施例2TRF测定法与标准ELISA方案的比较在β-淀粉状蛋白聚集ELISA方案(Howlett等人，见上文)中，在存在或缺乏2μl在DMSO中稀释的聚集抑制剂测试化合物的条件下，将96μl稀释后的β淀粉状蛋白溶液(51μg/ml)加到96孔聚苯乙烯板中。将Aβ保温过夜使其聚集，并将等分试样转移到另一个96孔聚苯乙烯板上，后者已经用抗Aβ抗体(6E10，Senetek，纳巴，加利福尼亚州)预包被过夜、清洗、并用Dulbecco氏PBS/1％BSA溶液封闭过。3-4小时后，清洗平板，将展示与包被用抗体相同特异性但经过生物素化(6E10-bio)的抗Aβ二抗加到平板中。生物素化二抗与DELDIA检测缓冲液中的200μl Eu3+-链霉亲和素(100ng/ml)结合，洗去过量物，然后如上所述将平板在DELFIA增强液中显影并在TRF平板读数仪上读数。
对ELISA中荧光团吸光度的分析显示背景吸光度可以是阳性对照孔的1.3％、2％至13％之间的任何数值，远远大于TRF聚集测定法中看到的背景，且显示更大的不稳定性。另外，在将新鲜Aβ肽加到经抗体包被的平板中后(用作背景读数)，ELISA测定法只能检测高1.5倍的Aβ聚集体，指示在检测Aβ聚集体方面此测定法不如TRF测定法灵敏。已知的Aβ抑制剂利福平在ELISA中对Aβ聚集的抑制显示抑制Aβ聚集约30％，与此相比，其它测试化合物在TRF测定法中则看到几乎完全的抑制。这可能指示ELISA的灵敏度小于本发明的TRF测定法，因此ELISA更难以检测到更小的聚集变化。
因此，使用本文公开的TRF测定法来检测多肽聚集的聚集体是比本领域目前实施的聚集体检测方法更灵敏的测定法。
实施例3提高对β-淀粉状蛋白成核和聚集化的调控物的检测速率将上文所述TRF测定法与混浊度或光密度相偶联的测定法能够极大的提高检测β-淀粉状蛋白成核和聚集调控物的能力。混浊度测定法测量聚集蛋白质的聚集或成核的开始。成核事件的特征是测定溶液中沉淀出的聚集体的显现发生可观的滞后时间，并产生光密度(OD)读数，随后因聚集的加速而OD迅速增加。
已经在TRF测定法中确定为可调控β-淀粉状蛋白聚集的待测试化合物也可以在光密度测定法中进行测定(Findeis等人，Biochemistry，386791-6800，1999；和WO98/08868)，以证实β-淀粉状蛋白聚集体的成核是否涉及此化合物，或者此化合物是否只在聚集体的起始种核出现后才抑制β-淀粉状蛋白聚集。
对于混浊度测定法，将悬浮于100％DMSO中的测试化合物或5μl100％DMSO加到未处理的96孔或384孔透明聚苯乙烯板(Corning)中。将β-淀粉状蛋白溶于0.1％乙酸中，并将肽含量校准至20倍浓度(1.02mM)，然后用测定缓冲液(10mM磷酸钠、100mM氯化钠，pH7.4)稀释至51μM。将稀释后的肽加到测试化合物中至终体积245μl，最终的测定条件是在250μl体积中含有50μMβ-淀粉状蛋白肽和2％DMSO。通过测定405nm处的光密度而将溶液的混浊度定量。使用合适的读板仪(即Spectramax)每隔10分钟进行一次光密度读数。在各时间间隔内将平板置于室温平板摇床上(4.2设置，800rpm)。OD读数的增加指示溶液中β-淀粉状蛋白的聚集。在存在和缺乏测试化合物时所获得的OD读数将指示测试化合物是否是β-淀粉状蛋白聚集的抑制物(与阳性对照相比OD读数下降)，更具体的说是否是β-淀粉状蛋白成核的抑制物(测定开始与混浊溶液混合物出现之间的滞后时间延长)。
使用本发明的TRF测定法，可以在一次测定中筛选多达352种待测试剂。将当前TRF测定法的这种起始大筛选能力与混浊度测定法相偶联能够更加有效和方便的测定多肽聚集的可行调控物。因此，现在公开的TRF分析法显著节约了完成聚集测定法所需要的时间，减少了测定法所使用的试剂量，继而因在每次测定中使用了较少的试剂并加快了对由聚集多肽所诱发的阿耳茨海默氏病和许多其它病理学状态的潜在重要治疗剂的分析而节约了成本。
实施例4可用于检测许多种类的聚集多肽的新型TRF测定法上文TRF测定法可用于检测许多不同目的蛋白(PrP、α-共核素、胰岛β-淀粉状蛋白、β-2微球蛋白)的多肽聚集，使之成为本领域中一种高适应性的实用技术。在当前公开的TRF测定法中，使用链霉亲和素/生物素分子对或其中一种结合配偶体化学或重组连接了目的肽的其它高亲和力结合分子能够使本发明的方法适用于任何上述蛋白质或多肽。本领域常用的标准ELISA方案则没有这样的适应性，因为它需要抗原特异抗体来评估多肽聚集。因此，使用ELISA来检测多肽聚集受到了在进行测定时能获得何种多肽特异试剂的限制。
例如，如上文概述，首先用第一结合配偶体如链霉亲和素包被基质。如实施例1所概述的，使用标准方法(如商品化的生物素化试剂盒，Sigma)将一定量的目的肽或蛋白质(如α-共核素或朊病毒蛋白质)生物素化，在存在或缺乏测试化合物的条件下使生物素化和未生物素化的目的蛋白聚集。然后如实施例1所概述的，将目的多肽组合物在基质上与附着了可检测标记物的第一结合配偶体一起保温，并根据测定法中测量得到的可检测标记物的量而对测试化合物评估其调控即刺激或抑制所测定蛋白质或多肽的聚集的能力。以这种方式，可以对许多的蛋白质评估聚集和聚集抑制剂。
实施例5TRF测定法试剂盒的配方本发明还可以包装成用于快速筛选多肽聚集的试剂盒，它包含本发明的一种或多种化合物或组合物。在最简单的实施方案中，这样的试剂盒包括依本文所述可用于实施本发明方法的化合物或组合物(如用于用生物素分子标记蛋白质或多肽的试剂)，它包装在诸如密封瓶或管等的容器中，并有标签贴在容器上或者置于包装中，其中描述了化合物或组合物在本发明方法实施时的用法。在更具体的实施方案中，试剂盒将包括未标记的和生物素化的多肽(如β-淀粉状蛋白1-40和/或A-β1-42多肽)以用于筛选测定法中。试剂盒还包括微量滴定板以用于本发明，其或是96孔或是384孔，预先包被了链霉亲和素以便结合由试剂盒所制备的或包含的生物素化多肽，以及设计用于检测本发明生物素化化合物的最适水平的检测剂Eu3+-链霉亲和素。试剂盒在包装时还可任选包括阳性对照调控物化合物，以比较存在待测试剂时检测到的聚集体与存在阳性对照化合物时检测到的聚集体，并确定待测试剂作为多肽聚集调控物的效力。
显然，除了上文描述和实施例的具体描述，本发明还可用于其它实践。因此，根据上文传授，有可能对本发明进行许多修改和变化而属于本发明的范围之内。
权利要求
1.用于鉴定多肽聚集调控物的方法，包括i)提供附着了第一结合配偶体的基质，其中第一结合配偶体结合第二结合配偶体；ii)提供包含多肽单体的多肽组合物，其中至少一些单体经修饰而包含第二结合配偶体；iii)在存在和不存在测试试剂时，在多肽单体可聚集形成多聚体的条件下将多肽组合物保温；iv)使多肽组合物接触附着了第一结合配偶体的基质；并v)通过检测与基质结合的多肽聚集体来测量多肽聚集，其中检测包括测量第二结合配偶体，根据存在和不存在测试试剂时多肽聚集的不同将测试试剂鉴定为调控物化合物。
2.权利要求1的方法，还包括制造包含在制药学可接受载体中的通过权利要求1的方法所鉴定的调控物化合物的调控物组合物的步骤。
3.依照权利要求2的方法，还包括将该调控物组合物施用于易受多肽聚集影响或因多肽聚集而展示病理学状态的哺乳动物、并测定因施用调控物组合物而引起的多肽聚集或病理学状态的改进的步骤。
4.依照权利要求3的方法，其中哺乳动物是人。
5.依照权利要求1的方法，其中保温步骤是在接触步骤之前进行的。
6.依照权利要求1的方法，其中保温步骤是与接触步骤同时进行的。
7.权利要求1的方法，其中第二结合配偶体与多肽单体发生了化学偶联。
8.依照权利要求1的方法，其中多肽组合物是通过混合包含第二结合配偶体的多肽单体与缺乏第二结合配偶体的单体而形成的。
9.依照权利要求8的方法，其中多肽组合物包含缺乏第二结合配偶体的单体和包含第二结合配偶体的单体的比例是5∶1至1∶1。
10.依照权利要求8的方法，其中缺乏第二结合配偶体的单体与包含第二结合配偶体的单体之间的比例是2∶1。
11.依照权利要求1的方法，其中第一结合配偶体包含链霉亲和素，而第二结合配偶体包含生物素分子。
12.依照权利要求1的方法，其中测量步骤包括使基质接触包含附着了可检测标记物的第一结合配偶体的组合物，并通过测量附着于基质的标记物来检测多肽聚集体。
13.权利要求1的方法，其中包括清洗基质的步骤，该清洗步骤是在测量多肽聚集之前进行的。
14.依照权利要求1-13的方法，其中所述多肽选自下组β-淀粉状蛋白1-40、β-淀粉状蛋白1-42、β-淀粉状蛋白1-43、聚谷氨酰胺重复片段、朊病毒蛋白质(PrP)、α-共核素、或胰淀粉状蛋白，该多肽的聚集与病理学疾病状态有关。
15.依照权利要求14的方法，其中所述病理学状态选自下组阿耳茨海默氏病、唐氏综合症、亨廷顿氏舞蹈病、帕金森氏病、朊病毒疾病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、卢伊体、或II型糖尿病。
16.权利要求1的方法，其中所述多肽单体是β-淀粉状蛋白单体。
17.依照权利要求16的方法，其中所述单体选自下组β-淀粉状蛋白1-40、β-淀粉状蛋白1-42、β-淀粉状蛋白1-43、及其混合物。
全文摘要
本发明提供了用于检测多肽聚集的调控物的多肽聚集筛选测定法，它能够为与多肽聚集有关的病理学状态提供新的疗法，尤其是阿耳茨海默氏病。
文档编号G01N33/68GK1642545SQ03807348
公开日2005年7月20日 申请日期2003年4月28日 优先权日2002年4月30日
发明者M·L·比奇, A·L·拉波德 申请人:法玛西雅厄普约翰美国公司
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