专利名称：一种检测三聚氰胺的间接竞争酶联免疫试剂盒的制作方法
技术领域：
一种检测三聚氰胺的间接竞争酶联免疫试剂盒，属于免疫分析技术领域。
背景技术：
三聚氰胺(英文名Melamine)，是一种三嗪类含氮杂环有机化合物，重要的氮杂环有机 化工原料。简称三胺，又叫2， 4， 6-三氨基-1， 3， 5-三嗪、1， 3， 5-三嗪-2， 4， 6-三胺、2， 4， 6-三 氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，分子式为C3N必6、 C3N3(NH2)3，分子量126. 12。
通用的蛋白质测试方法"凯氏定氮法"是通过测出样品中的含氮量来估算蛋白质含量。 蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%。而三聚氰胺的含氮量为66.7%。 一些 不法商人利用食品和饲料工业蛋白质含量测试方法的缺陷，在食品和饲料中添加三聚氰胺， 以提升样品检测中的蛋白质含量指标，来获取暴利。因此三聚氰胺也被人称为"蛋白精"。
目前的研究显示，三聚氰胺具有轻微毒性，大鼠口服的半数致死量大于3g/kg体重。动 物实验显示，动物长期摄入三聚氰胺会造成生殖、泌尿系统的损害，膀胱、肾部结石，并可 进一步诱发膀胱癌。1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安 全手册》第三巻和国际化学品安全卡片说明长期或反复大量摄入三聚氰胺可能对肾与膀胱 产生影响，导致产生结石。2007年美国发生宠物中毒死亡事件，最后的调査结果显示掺 杂了三聚氰胺的小麦蛋白粉所制成的宠物食品是导致宠物中毒死亡的原因。2008年9月，中 国爆发婴幼儿奶粉受污染事件， 一些食用了受污染奶粉的婴幼儿发生肾结石病症，并导致一 些婴幼儿死亡，调査结果表明奶粉中含有三聚氰胺。随后在一些以牛乳或乳粉为原料的食 品如含乳饮料、冰淇淋、巧克力、饼干、糖果等相继检出三聚氰胺。
目前三聚氰胺的检测方法主要是使用大型仪器，如HPLC、 GC-MS、 LC-MS等。但由于仪器 设备价格昂贵，操作复杂，十分费时，不适用于大批量样品的快速检测，因此不能用于大批 量样品的现场快速筛査，不能在基层单位和企业得到推广。而酶联免疫分析(ELISA)法， 由于其特异性强、灵敏度高、操作简便、检测速度快，特别适于大批量样品的现场快速检测 等优点而越来越被人们所重视和采用。目前在真菌毒素、藻毒素等的快速检测中ELISA法已 经是最常用的方法。
目前三聚氰胺的ELISA方法及其试剂盒也有见报道，但所用抗体都为多克隆抗体，其对 三聚氰胺的特异性识别不如单克隆抗体，因此其试剂盒检测的灵敏度、准确性、重现性和稳定性不如使用单克隆抗体的试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测三聚氰胺的酶联免疫分析试剂盒及其检测方法，用于对 饲料及食品中三聚氰胺的检测。
本发明的技术方案该检测三聚氰胺的试剂盒是由(1) 96或48孔包被板，(2)三聚 氰胺标准品，(3)三聚氰胺的抗体冻干品，(4)酶标记的羊抗兔抗体冻干品，(5)洗涤 液，(6)显色液A，(7)显色液B，(8)终止液所组成。
所述的酶标记的羊抗兔抗体冻干品为HRP —羊抗兔抗体冻干品，洗涤液为含有吐温的 Tris—HCl缓冲溶液，显色液A为含有过氧化氢的柠檬酸一磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为 四甲基联苯二胺的乙醇水溶液，终止液为硫酸溶液。
本发明主要采用酶联免疫分析法(ELISA)来检测三聚氰胺。采用ELISA的技术主要有两 个方面第一，特异性单克隆抗体的制备，利用抗原免疫小鼠，经细胞融合、选择培养、腹 腔注射，经培养后抽取腹水，得到抗三聚氰胺的单克隆抗体；第二，三聚氰胺的ELISA试剂 盒的制备。
检测三聚氰胺的酶联免疫分析试剂盒的制备详见实施例1和2。
三聚氰胺的测定方法为取包被有三聚氰胺-BSA的微孔包被板，加入三聚氰胺标准或处 理好的样品到各自的微孔中，再加入三聚氰胺抗体，振荡反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊 抗兔抗体，进行标记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加终止液， 在450nm处测量吸光度，对照标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
本发明的有益效果该试剂盒结构简单，使用方便、廉价、灵敏度高，检测限可达 10ng/mL，特别适于大批量样品的现场快速检测。
图1为三聚氰胺酶联免疫分析法的标准曲线。
具体实施例方式
提供以下实施例是为了更好地理解本发明，而决不对本发明的内容和保护范围构成任何 限制。
实施例l抗三聚氰胺的单克隆抗体的制备
三聚氰胺是典型的半抗原，在免疫反应中只具有反应原性，需与大分子物质结合后才有 免疫原性。我们采用多元酸酐法活化三聚氰胺，用混合酸酐法将活化的三聚氰胺与载体蛋白 (KLH， BSA)偶联，制备了免疫抗原三聚氰胺-KLH和包被抗原三聚氰胺-BSA。以合成的三聚
氰胺-KLH作为人工合成的免疫抗原进行动物免疫，制备抗体。
1. 三聚氰胺-KLH和三聚氰胺-BSA抗原的制备
称取三聚氰胺25. 2mg (约0.2mmo1)，加入4ml含22. 8mg (约0.2mmo1)戊二酸酐的吡啶 溶液中，室温搅拌反应22h。反应完成后，氮气吹干吡啶。残留物用8mL溶剂(DMF和l，4-二 噁烷l:l混合)溶解，加入O. 0524mL (约O. 2mmo1)正三丁胺，冰中搅拌10min，加入氯甲酸 异丁酯0.0288mL (约0.2mmo1)，室温搅拌反应lh。将活化的三聚氰胺溶液逐滴加入10mL冰 冷含载体蛋白的O. lmol/L硼酸钠液(pH 8.5)中，lh内加完，室温搅拌反应过夜。载体用量为 BSA 50mg, KLH 100mg。
偶联物过S印hadex G-25层析柱提纯。用紫外吸收法测定载体浓度作为偶联物浓度。提 纯的偶联物于-2(TC保存。
2. 抗三聚氰胺单克隆抗体的制备
将免疫抗原三聚氰胺-KLH与等量的福氏完全佐剂乳化，以皮下多点及腹腔注射途径对8 周龄左右的BalB/c雌性小鼠进行基础免疫。间隔14天后，改为福氏不完全佐剂追加免疫， 14天后再免疫一次。检测多抗效价达到l: 2000后，经尾静脉用水剂抗原加强免疫一次，3 4天后处死取出小鼠脾脏，得到脾细胞进行细胞融合。每次免疫抗原用量为每只鼠0.025 0.05mg。
得到的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(Sp2/0)以8 : l混合，用聚乙二醇(PEG，丽4000) 作融合剂。融合细胞悬于含20X小牛血清的HAT培养液内，分别于加有BalB/c小鼠腹腔渗出 细胞作滋养层的96孔细胞培养板中，置6XC02中在37。C培养。以三聚氰胺-BSA为包被抗原， 用iELISA法对上清液中杂交瘤进行筛�。⒂胕cELISA法确证。
对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克隆。置6XC02中在37。C继续培养，直至所 有细胞生长孔的培养液均呈阳性为止。当连续3次100%阳性时，即可进行单抗的扩大培养。
采用小鼠腹腔内诱生单克隆抗体的方法进行扩大培养。取已成年的BalB/c小鼠，于腹腔 内注入液体石蜡O. 5mL， l周后再于腹腔内注入杂交瘤细胞。用生理盐水将杂交瘤细胞悬浮混 匀，并将细胞数调至4Xl(^个/mL，每只BalB/c小鼠腹腔注射0. 5mL杂交瘤细胞。10 14天后 收集腹水。检测腹水效价，稀释至工作浓度后分装冻干，于-2(TC长期冻存。
实施例2 96孔ELISA试剂盒的制备
1.包被板固相抗原制备
将三聚氰胺-BSA用50mmol/L的Na2C03-NaHC03缓冲液(pH9. 6)稀释至10mg/L的包被液， 96孔微孔板各孔加0. lmL， 4"C放置过夜。弃去包被液，冲洗三次，每孔加O. 15mL含3g/L
BSA的上述缓冲液封闭，4'C放置过夜。弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-2(TC冷冻保 存。
2. 试剂的配制
(1) 标准品三聚氰胺0ng/mL， 10ng/mL， 20ng/mL， 40ng/mL， 80ng/mL， 200ng/mL， 从三聚氰胺纯品中稀释得到，稀释液为甲醇水体积比为l : 9。
(2) 抗三聚氰胺抗体冻干品的制备见实施例l。
(3) HRP标记的羊抗兔抗体冻干品(HRP-羊抗兔抗体)市售，珠海百奥生物科技有限 公司生产。
(4) 洗涤液14.5mmol/L NaCl、 0. 2mL/L Tween-80和0. 2。/。NaN3的50mmol/L Tris-HC1 pH7. 8。
(5) 显色液A: 0.2M Na2HP04 25. 7mL， 0. 1M柠檬酸24. 3mL和0. 04%的11202 50mL。
(6) 显色液B:称取20mg四甲基联苯二胺(TMB)加入10mL无水酒精中，可加热至37。C 4(TC直到TMB完全溶解，加去离子水至100mL。
(7) 终止液2mol/L的,4。
3. 试剂盒的组成
(1) 96孔板(8条X12孔，可以拆分为单孔)，包被有三聚氰胺-BSA。
(2) 三聚氰胺标准液，6瓶，0.5mL/瓶，标准液浓度为Ong/mL， 10ng/mL， 20ng/mL， 40ng/mL， 80ng/mL， 200ng/mL。
(3) 三聚氰胺抗体冻干品，l瓶，用时6mL蒸馏水溶解。
(4) HRP-羊抗兔抗体冻干品，l瓶，用时12mL蒸馏水溶解。
(5) 洗涤液，l瓶，10mL，用时以蒸馏水l : 25稀释。
(6) 显色液A， l瓶，6mL。
(7) 显色液B， l瓶，6mL。
(8) 终止液，l瓶，6mL。 实施例3饲料样品中三聚氰胺的检测
1. 样品前处理
称取5g样品(固体样品需粉碎过20目筛或研磨均匀)于磨口的100mL三角瓶中，准确加 入提取液25mL (甲醇水为l: 1)，加塞振荡10min，滤纸过滤后收集2mL滤液，加水8mL摇 匀即为待测液。
2. ELISA操作
ELISA试剂盒的制备见实施例2 。
取三聚氰胺-BSA板条室温下放置10min。每孔加O. 25mL洗涤液洗二次，拍干。加入 0. 05mL的三聚氰胺标准或处理好的样品到各自的微孔中，每个标准和样品必须使用新的吸 头。加O. 05mL三聚氰胺抗体，移液器管尖不要接触到孔中的液体。37。C下暗处静置30min 后，甩掉反应液，洗涤液洗三次，拍干。每孔加O. lmL HRP-羊抗兔抗体，37。C下暗处静置 30min后，甩掉反应液，洗涤液洗三次，拍干。每孔加O. 05mL显色液A和0.05mL显色液B，暗 处静置15min后，每孔加O. 05mL终止液测量吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚氰胺含
3.结果计算
(1) 定量
三聚氰胺标准溶液浓度为Ong/mL， 10ng/mL， 20ng/mL， 40ng/mL， 80ng/mL， 200ng/mL， 用酶标仪(450nm)测得每孔的吸光度值(A)，绘制标准曲线。通过标准曲线，可准确定量 样品中三聚氰胺含量。
标准曲线用坐标纸进行绘制，横坐标为三聚氰胺标准溶液浓度的对数，纵坐标为百分 比，即各标准品孔和样品孔吸光度值除以Ong/mL标准品孔吸光度值(AO)再乘以100%所得。 相应每个样品的三聚氰胺浓度可从曲线上获得，乘以样品稀释倍数可计算样品中三聚氰胺含
有计算机软件可对ELSIA数据进行处理，特别适用于大量数据的处理。用免疫测定软件 Ridasoft Win所得标准曲线见附图l。
(2) 半定量
半定量的结果可通过对比样品与某一标样孔的颜色获得样品的颜色比标样孔的颜色浅 则三聚氰胺的浓度比标样孔的浓度高，样品的颜色比标样孔的颜色深则三聚氰胺的浓度比标 样孔的浓度低。可根据质控限直接判定是否为阳性，无需仪器测定吸光度值和数据计算。
实施例4牛奶及乳粉样品中三聚氰胺的检测
1.样品前处理
量取5mL牛奶样品于小烧杯中，力n20mL石油醚，将样品移于125mL分液漏斗中，准确移取 15mL提取液(甲醇水为l: 1)分次洗小烧杯，洗液一并移入分液漏斗中，振摇5min，静置 分层后，放出下层提取液层，再准确移取5mL提取液重复振摇提取一次，合并下层提取液层 摇匀取2mL提取液(提取液如果不清澈需过膜)，加水8mL摇匀即为待测液。
乳粉样品水溶后前处理同牛奶。
ELISA操作与结果计算同实施例3。
权利要求
权利要求1一种检测三聚氰胺的间接竞争酶联免疫试剂盒，其中包括96或48孔包被板(1)，三聚氰胺标准品(2)，抗三聚氰胺的抗体冻干品(3)，酶标记的羊抗兔抗体冻干品(4)，洗涤液(5)，显色液A(6)，显色液B(7)和终止液(8)。
2.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述酶标记的羊抗兔 抗体冻干品为HRP-羊抗兔抗体冻干品，洗涤液为含有吐温的Tris-HCl缓冲溶液，显色液A为 含有过氧化氢的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲溶液，显色液B为四甲基联苯二胺的乙醇水溶液，终 止液为硫酸溶液。
3.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述的包被板(1) 包被固相抗原三聚氰胺-BSA;用50mmol/L pH9. 6的Na2C03-NaHC03缓冲液将三聚氰胺-BSA稀释 至10mg/L做为包被液，96或48孔微孔板每孔加0. lmL包被液，4"C放置过夜，弃去包被液，冲 洗三次，每孔加O. 15mL含3g/L BSA的50mmol/L pH9. 6的Na2C03-NaHC03缓冲液封闭，4。C放置 过夜，弃去封闭液，真空抽干，板条密封后置-2(TC冷冻保存。
4.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述的三聚氰胺标准 品(2)共6瓶，浓度分另J为Ong/mL， 10ng/mL， 20ng/mL， 40ng/mL， 80ng/mL， 200ng/mL。
5.根据权利要求l所述的试剂盒，其特征在于所述的抗三聚氰胺的 抗体冻干品(3)，为抗三聚氰胺的单克隆抗体的冻干品。
6.根据权利要求5所述的抗三聚氰胺的单克隆抗体，其制备方法如 下将三聚氰胺和BSA或KLH或OVA偶联作为抗原，免疫雌性BalB/c小鼠，检测多抗效价达到 1: 2000后，在PEG-4000作用下将免疫的小鼠脾细胞与Sp2/0小鼠骨髓瘤细胞进行融合，经过 HAT选择培养，用间接ELISA法检测培养上清，对检出的阳性克隆孔采用有限稀释法进行亚克 �。菩孕∈驜alB/c腹腔注射液体石蜡、杂交瘤细胞，经培养后抽取腹水，腹水中即含有抗 三聚氰胺的特异性单克隆抗体。
7. 一种用权利要求l所述的试剂盒检测三聚氰胺的方法，其特征在 于取包被有三聚氰胺-BSA的微孔包被板，加入三聚氰胺标准品或处理好的样品到各自的微 孔中，再加入三聚氰胺抗体，暗处静置反应，洗涤液洗涤，加酶标记的羊抗兔抗体，进行标 记免疫反应，洗涤液洗涤，加显色液A和显色液B，暗处静置后加终止液，在450nm处测量吸 光度值，对照标准曲线计算样品中的三聚氰胺含量。
8.根据权利要求7所述的检测三聚氰胺的方法，其操作为样品前处 理；取包被有三聚氰胺-BSA的微孔包被板，加入O. 05mL的三聚氰胺标准品或处理好的样品到 各自的微孔中，力叫.05mL抗三聚氰胺抗体，37。C暗处静置30min，洗涤液洗三次，加O. lmL 酶标记的羊抗兔抗体，37。C暗处静置30min，用洗涤液洗三次，力叫.05mL显色液A和0. 05L显 色液B，暗处静置15min后加终止液，在450nm处测吸光度值，从标准曲线计算样品中的三聚 氰胺含量。
全文摘要
一种检测三聚氰胺的间接竞争酶联免疫试剂盒，属于免疫分析技术领域。本试剂盒采用特异性强的抗三聚氰胺单克隆抗体。微孔板包被有三聚氰胺-BSA，加入三聚氰胺标准品或样品，再加入三聚氰胺单抗。游离的三聚氰胺与微孔板上的三聚氰胺-BSA竞争三聚氰胺单抗，没有连接的三聚氰胺单抗被洗涤除去，加入HRP-羊抗兔抗体，标记免疫反应后没有连接的HRP-羊抗兔抗体被洗涤除去。加显色液、终止液后，用酶标仪测定其吸光度，吸光度的值与样品中的三聚氰胺浓度成反比，对照标准曲线即可确定被测样品中三聚氰胺的含量。本试剂盒结构简单、使用方便、廉价、灵敏度高，检测限可达10ng/mL，主要用于大批样品的现场快速筛查。
文档编号G01N21/77GK101382547SQ200810304768
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月8日 优先权日2008年10月8日
发明者军 肖, 肖付刚 申请人:军 肖
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