专利名称：检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及荧光定量pcr检测鼠疫耶尔森氏菌的方法
技术领域：
本发明涉及检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂及鼠疫病原菌的检测方法，尤其涉及复合 探针鼠疫病原菌标识基因进行扩增，进而利用荧光PCR技术检测鼠疫病原菌的方法。
背景技术：
鼠疫(Plague)由鼠疫杆菌引起的，严重�：θ死嗟囊恢至倚源静�。鼠疫具有传 染性强、传播迅速、病情严重、病死率高等特点，为国际检疫传染病之一。我国颁布的《传染 病防治法》也将鼠疫定为甲类传染病。传染病预防控制的最关键技术环节就是建立病原体侦查检测的实验室诊断方法， 能准确、快速地检出与监测病原体。鼠疫耶尔森氏菌的检测目前仍然主要是依靠细菌培养， 生化反应，血清凝集等方法来鉴定。这些方法已经使用了几十年，并在细菌鉴定中发挥了重 大作用，但普遍存在检测时间滞后，方法的敏感性差等不足，不能满足快速准确的需求。传 统PCR技术和核酸杂交技术的发现大大的促进了细菌检测技术的发展，但存在容易交叉污 染、无法定量分析等不足。实时荧光定量PCR技术解决了传统PCR技术的不足，已经成为细 菌等微生物快速定量检测的首选技术。定量PCR技术可在同一管内实现DNA的扩增和同步 检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，具有高效、快速、特异的优点，非常适用于单一病 原体的检测。Taqman探针、分子信标、杂交探针(Lightcycler)等用于炭疽、鼠疫、霍乱等生 物战剂的检测中，相关仪器可对采集到的样品进行实时检测分析。发展快速、敏感、特异、系 统的病原微生物的筛查技术、方法和试剂，发展先进、系统的病原微生物分离和检测方法， 可以有效地对传染病的暴发和流行进行早期预警、快速确认，控制新发传染病的口岸传入， 并可有助于提高对突发公共卫生事件、暴发疫情和不明原因疾病的快速应急反应和处理能 力。
发明内容
本发明的第一个目的在于针对现有技术的不足，提供一种检测鼠疫耶尔森氏菌的 试剂，可以用于快速准确地检测鼠疫耶尔森氏菌。为此，本发明采用以下技术方案它包括 以下上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针；上游引物的基因序列Pl 为5，-ATTCTGTTGTTTTGCCTTGA-3，，即序列表 SEQ NO 1 所示序列；下游引物的基因序列P2为5，-CTTGGATGTTGAGCTTCCTA-3，即序列表SEQ NO 2所 示序列；荧光探针的基因序列T7 为5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，，即序列表 SEQ NO 3 所示序列；淬灭探针的基因序列SP6 为5，-TAAAATCCACTGTGATATCTT-3，，即序列表 SEQ NO 4所示序列。
本发明另一个目的是提供一种荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法，可以快 速准确地检测鼠疫耶尔森氏菌。为此，本发明采用以下技术方案它采用直接水煮法提取鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA 取50 μ 11 X 109CFU/mL的细 菌样品，置于沸水浴中煮沸10分钟，IOOOOXg离心2分钟，取2μ 1上清作为扩增模板；所述方法的PCR 反应体系为 25 μ 1 :l(kimol/L 的 Tris-HCl，pH 为 8. 0 ；5(kimol/ L 的 KCl ；体积百分比 3% 甲酰胺；5mmol/L MgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ； 0. 5ymol/L的上述上游引物，0. 5ymol/L的上述下游引物，1. 5U Taq酶，100nmol/L的上述 荧光探针，200nmol/L的上述淬灭探针；PCR反应程序为预变性95°C 3min、94°C 5s、扩增的 退火温度为54°C 20s共40个循环；所述方法还包括以下检测步骤提取样本DNA为扩增模板，按上述荧光定量PCR的 反应体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照 的扩增，其中阴性对照采用非鼠疫致病菌，阳性对照采用鼠疫耶尔森氏菌阳性参考品；反应 结束后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因 片段拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中鼠疫耶尔森氏菌的浓度。本发明具有显著的优点，通常传统的鼠疫耶尔森氏菌检测技术操作繁琐，耗时较 长，影响因素多，不能达到快速诊断的目的。根据鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒上特有的致病基 因-血浆凝固酶及胞浆素原活化因子Pla基因，设计引物和探针，与整个genbank数据库进 行BLAST检索，发现其只对鼠疫菌上的pla基因序列特异，和其它物种的核酸序列无同源， 保证了检测方法的特异性。该方法可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR 后进行凝胶电泳分析，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，具有操作简便，高效、 快速、特异的优点。
图Ia为实施例1中组合1的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为 1 X 105cfu/ml的实时扩增曲线、2为lX104cfu/ml的实时扩增曲线、3为1 X 103cfu/ml的实 时扩增曲线。图Ib为实施例1中组合2的检测同一模板的实时扩增曲线图，其中，1为 1 X 105cfu/ml的实时扩增曲线、2为lX104cfu/ml的实时扩增曲线、3为1 X 103cfu/ml的实 时扩增曲线。图2a为实施例1中FP探针的纯度分析图谱。图2b为实施例1中QP探针的纯度分析图谱。图3a为实施例1中上游引物的的HPLC分析图谱。图3b为实施例1中下游引物的的HPLC分析图谱。图4为淬灭探针的淬灭效果图，其中，1表示单有荧光探针组，2表示复合探针组。图5为荧光探针的延伸性能图，其中，1为加上游引物组，2.为不加上游引物组。图6为本发明实施例2绘制的荧光定量PCR标准曲线
具体实施例方式实施例1引物与探针的制备
1.靶基因选择鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒上有产生鼠疫耶尔森氏菌素的pst基因和血浆凝固酶及 胞浆素原活化因子Pla基因，后者被认为与人类致病有关，可作为鼠疫菌的诊断标志。根据 检索genbank数据库，获得pla基因序列。2.荧光探针、淬灭探针与PCR引物的设计和筛选遵循复合探针设计原则，根据pla基因的序列，设计了两组引物和探针。荧光探针 5'端标记荧光分子FAM作为报告基团，3'端标记磷酸，以阻断其延伸。淬灭探针的3'端 连接一淬灭基团Dabcyl。为了从两组复合探针及引物组合中筛选出扩增效率高的一个组合，将这些组合 进行实时PCR分析，采用检测鼠疫耶尔森氏菌标准株ATCC23053-B1的3个不同浓度样本 (1 X 105cfu/ml、1 X 104cfu/mlU X 103cfu/ml)，观察它们同时扩增同一样品的能力来确定 最佳组合。如表1和图la、lb所示，采用组合1进行检测时，其检测样品时的Ct值较�。� 且荧光响应强度值ARFU较高，说明该组合扩增效率较高，因此，在后述的所有实验中，均 采用这个组合。表1引物及探针组合对扩增效率的影响
权利要求
1.检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂，其特征在于它包括以下上游引物、下游引物、荧光探针 和淬灭探针；上游引物的基因序列Pl为5，-ATTCTGTTGTTTTGCCTTGA-3’ ；下游引物的基因序列P2为5，-CTTGGATGTTGAGCTTCCTA-3 ；荧光探针的基因序列T7为5，-TAATACGACTCACTATAGGG-3，；淬灭探针的基因序列 SP6 为5，-TAAAATCCACTGTGATATCTT-3，。
2.一种荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法，其特征在于它采用直接水煮法提 取鼠疫耶尔森氏菌基因组DNA 取50 μ 11 X 109CFU/mL的细菌样品，置于沸水浴中煮沸10分 钟，IOOOOXg离心2分钟，取2 μ 1上清作为扩增模板；所述方法的 PCR 反应体系为 25 μ 1 :10mmol/L 的 Tris-HCl，pH 为 8. 0 ;50mmol/L 的 KCl ； 体积百分比 3% 甲酰胺；5mmoVLMgCL2 ； 100 μ mol/L 的 dATP、dCTP、dGTP、dTTP ；0. 5 μ mol/ L的权利要求1所述的上游引物，0. 5 μ mol/L的权利要求1所述的下游引物，1. 5U Taq酶， 100nmol/L的权利要求1所述的荧光探针，200nmol/L的权利要求1所述的淬灭探针；PCR反 应程序为预变性95°C 3min、94°C 5s、扩增的退火温度为20s共40个循环；所述方法还包括以下检测步骤提取样本DNA为扩增模板，按上述荧光定量PCR的反应 体系及反应程序在实施荧光定量PCR仪上进行扩增，并同时进行阴性对照和阳性对照的扩 增，其中阴性对照采用非鼠疫致病菌，阳性对照采用鼠疫耶尔森氏菌阳性参考品；反应结束 后，将样本循环阈值C(t)与荧光定量PCR标准曲线对照，就得到样本DNA中的靶基因片段 拷贝浓度；按照靶基因片段拷贝浓度判断样本中鼠疫耶尔森氏菌的浓度。
3.如权利要求2所述的一种荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法，其特征在于 荧光定量PCR标准曲线采用以下步骤制得取不同DNA载量的质粒参考品各2 μ 1，按上述荧光定量PCR的反应体系及反应程序在 实施荧光定量PCR仪上进行扩增；反应结束后根据得到的各个浓度的循环阈值C (t)，采用 计算机自动绘制荧光定量PCR标准曲线。
全文摘要
本发明提供了一种检测鼠疫耶尔森氏菌的试剂，它包括上游引物、下游引物、荧光探针和淬灭探针。本发明还提供了利用上述试剂荧光定量PCR检测鼠疫耶尔森氏菌的方法。本发明根据鼠疫耶尔森氏菌6MD质粒上特有的致病基因-血浆凝固酶及胞浆素原活化因子pla基因，设计引物和探针，与整个genebank数据库进行BLAST检索，发现其只对鼠疫菌上的pla基因序列特异，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法可在同一管内实现DNA的扩增和同步检测，而无需在PCR后进行凝胶电泳分析，对样本的定量检测只需2小时左右即可完成，具有操作简便，高效、快速、特异的优点。
文档编号G01N21/64GK102146467SQ20111003845
公开日2011年8月10日 申请日期2011年2月15日 优先权日2011年2月15日
发明者吕沁风, 吴忠华, 李 禾, 郑伟 申请人:浙江国际旅行卫生保健中心
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