磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用的制作方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种磁性分子印迹技术的应用，尤其涉及一种磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用。
背景技术：
分子识别在自然界的生物进化中起着重要作用，化学家们利用一些天然化合物或合成化合物模拟生物体系进行分子识别研究，构成了分子印迹技术的雏形。自20世纪70年代以来，分子印迹技术发展十分迅猛，尤其是1993年Mosbach等在《Nature》上发表了茶碱分子印迹聚合物研究的报道后，分子印迹技术成为国内外学者的研究热点[1]。分子印迹技术是通过功能单体的交联聚合作用将模板分子(目标分子，又称印迹分子)固定于高分子共聚物中，洗脱除去模板分子后，形成分子印迹聚合物(molecularly imprintedpolymers, MIPs)。由此制备的分子印迹聚合物可与模板分子在空间结构及结合位点上完全匹配，具有良好的分子识别特异性；而且，该分子印迹聚合物还具有亲和性和选择性好、抗恶劣环境能力强、稳定性好以及使用寿命长等优点，广泛应用于色谱分离[2]、模拟酶催化、临床药物分析[4]、膜分离和固液萃取等领域[5]。近年来，药物和药物中间体分子对映体纯度和组分的分析检测受到了广泛关注，原因在于对手性药物而言，往往是一种异构体有药效，而其对映体的药效则很低或没有药效，有的甚至能引起严重的毒副作用。手性物质与其对映体的分离无法通过过滤、萃取、精馏等普通的分离方法实现，因此，手性物质对映体的分离分析方法研究引起了人们的极大兴趣。分子印迹技术的发展，为解决以上难题提供了一条新途径。采用分子印迹技术合成仿生高分子材料，即分子印迹聚合物，并将其应用于手性分子的识别检测研究受到了研究者的重视Mm。自从Wulff等M首次把分子印迹聚合物作为高效液相色谱(HPLC)的固定相拆分模板分子A-D-甘露吡喃糖苯苷的外消旋体以来，分子印迹聚合物作为色谱固定相已广泛应用于各种手性化合物的拆分。而且，分子印迹聚合物作为毛细管电色谱固定相还有效克服了柱效低等缺点，已成为分子印迹聚合物发展的一个重要趋势。通常，分子印迹聚合物可通过以下方法实现(I)功能单体与模板分子通过官能团之间的共价键或非共价键作用形成单体-模板分子复合物；(2)加入交联剂，在引发剂作用下进行光或热聚合，将功能单体相互交联起来形成共聚物，从而使功能单体上的功能基团在空间排列和空间取向上固定下来；(3)采用合适的方法洗脱除去共聚物中结合的模板分子，制得的分子印迹聚合物留下了与模板分子在空间结构上相匹配且含有与模板分子专一性结合功能基团的三维空穴。可见，在分子印迹聚合物合成过程中，影响分子印迹聚合物性能的主要因素有印迹分子、功能单体、交联剂、引发剂的性质和引发条件以及致孔剂种类和比例等，既有聚合物自身的因素，同时也与聚合物所处的溶剂环境有关。其中，功能单体的选择非常重要，它不但要求能与交联剂进行共聚合反应，而且分子内必须具有能与印迹分子发生化学作用的结构单元。例如，最常用的功能单体A-甲基丙烯酸，其分子内除了有一个碳碳双键外，还有一个羧基，不仅可以通过离子键作用与胺发生作用，还可通过氢键作用与酰胺、氨基甲酸酯和羧基化合物发生作用。尽管分子印迹技术在诸多研究领域中发挥着重要作用，但是仍存在许多如功能单体和交联剂的种类有限、聚合方法不完善等需进一步研究和亟待解决的问题，因此，合成新型功能单体和交联剂、探索新的合成方法及模板分子的快速去除方法等，成为分子印迹技术的研究热点。多巴胺(3，4- 二羟基苯)，是生物体内的一种重要的神经递质，同时，它还是一种绿色的仿生材料，在弱碱性条件下，多巴胺可以发生自聚合作用而生成聚多巴胺(PDA)从而粘附在各种无机和有机材料的表面[9]。此外，多巴胺分子内含有大量如氨基、羧基以及
^键等非共价键功能基团，可满足分子印记聚合物识别相关生物分子(蛋白质和氨基酸等)的需求。因此，当利用分子印迹技术分离生物分子时，可选择多巴胺作为功能单体，利用其在碱性条件下发生的自聚合作用将模板分子印迹到各种无机和有机材料载体表面，从而合成可以特异性识别模板分子的分子印迹聚合物。与现有分子印迹材料和印迹技术相t匕，以多巴胺为功能单体、利用其弱碱性条件下自聚合特性进行印迹的方法，在整个印迹过程中无需额外添加任何有机溶剂、交联剂、引发剂以及致孔剂等其它化学试剂，具有绿色环保、成本低廉、操作简单、快速有效等优点，不仅扩展了功能单体的选择范围，也为发展高效的分子印迹聚合物合成方法提供了一种新思路。本发明以多巴胺为功能单体，以四氧化三铁(Fe3O4)磁性纳米微球为载体，D/L-色氨酸作为模板分子，利用多巴胺弱碱性条件下的自聚合反应，将模板分子D/L-色氨酸印迹与聚多巴胺功能化Fe3O4磁性纳米微球表面，洗脱模板分子后，制备了磁性分子印迹聚合物(MIP-Fe3O4IgPDA NPs)。利用Fe3O4核的良好磁性能，在外磁场作用下将MIP-Fe3O4IgPDANPs固定于PDMS芯片微通道内，构建了对D/L-色氨酸具有特异性识别作用的PDMS微流控芯片系统。根据手性分子D/L-色氨酸在分子印迹聚合物腔体内停留时间的不同，二者在MIP-Fe3O4IgPDA NPs功能化PDMS微流控芯片通道内产生的电迁移率发生改变，从而成功实现了 D/L-色氨酸在PDMS芯片微通道内的手性分离。本发明发展的基于磁性分子印迹技术构建手性选择性PDMS微流控芯片系统的新方法，与现有分子印迹技术相比，一方面，本发明发展的磁性分子印迹技术绿色环保、操作简单、快速有效；另一方面，MIP-Fe3O4IgPDANPs中含有的大量特异性识别D/L-色氨酸的印迹位点，有利于D/L-色氨酸对映体的选择性分离，同时，纳米级的磁性纳米材料在微通道内形成渗透性好、填充均匀的结构，提高了印迹效率和识别能力，从而实现D/L-色氨酸对映体的高效分离。此外，本发明制备的磁性固定相可在外磁场作用下定位于分离管道中的预指定区域，还可方便地调节固定相的填充长度，大大节约了操作时间；而且，当没有外磁场时，磁性固定相很快被冲洗出微芯片通道，有利于芯片的更新，大大提高了芯片的重复利用率。该磁性分子印迹技术还有望用于生物大分子(蛋白质、多肽、核苷酸等)的印迹、分离及检测等领域。参考文献
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发明内容
本发明的目的在于提供一种将磁性分子印迹技术应用于聚二甲基硅氧烷微流控分析系统可控构建的新方法，进而对手性物质进行快速识别检测。以多巴胺为功能单体，D/L-色氨酸(D/L-Trp)为模板分子，Fe3O4磁性纳米微球为载体，利用多巴胺碱性条件下自聚合的特性以及生成的聚多巴胺(PDA)极·强的粘附性，将模板分子同时镶嵌于Fe3O4磁性纳米微球表面，洗脱模板分子后，获得了具有特异性识别D/L-色氨酸印迹位点的磁性分子印迹聚合物(MIP-Fe3O4IgPDA NPs);通过外加磁场的作用将制备的磁性分子印迹聚合物固定于PDMS芯片通道内，从而实现手性化合物在微流控系统内的有效分离。在整个印�：托奘喂讨校扌瓒钔馓砑尤魏稳缬谢芗�、交联剂等其它化学试剂，具有绿色环保、成本低廉、操作简单且快速有效等优点。测试结果表明，在MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物修饰的PDMS通道内，目标分子D/L-色氨酸对映体在60 s内获得了高效分离，分离度高达1. 68。为实现所述的将磁性分子印迹技术用于聚二甲基硅氧烷微流控分析系统可控构建并对手性物质进行快速识别检测，本发明采用以下技术方案
(I)采用水热法合成磁性Fe3O4纳米粒子(NPs):将1.35 g FeCl3 6H20溶于40 mL乙二醇中，超声使其混合均匀；向上述溶液中加入3. 6 g无水NaAc和1.0 g聚乙二醇，超声20min，将混合溶液转入高压反应釜中于180 ° C反应6 h，待高压釜冷却至室温后，将制得的黑色磁性纳米粒子用二次蒸馏水清洗数次；最后将产物溶于4 mL 二次蒸馏水中，得到浓度为 50. 2 mg/mL、平均粒径为 126 nm 的 Fe3O4 NPs0(2)MIP-Fe304iPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备将25 mg Fe3O4 NPs与50 mg模板分子D/L-色氨酸溶解于10 mL 20 mM pH 8. 5的PBS缓冲溶液中，机械搅拌混匀后，向上述溶液中加入15 mg功能单体多巴胺，继续机械搅拌4 h，利用多巴胺在碱性条件下自聚合生成的粘附性极强的PDA将模板分子D/L-色氨酸印迹到Fe3O4 NPs表面，制得磁性分子印迹聚合物。利用磁性分离和清洗技术，用洗脱液(5%(v/v)醋酸和0. 1% (w/v)十二烷基磺酸钠混合溶液)清洗磁性分子印迹聚合物数次，洗脱模板分子后的产物用二次蒸馏水清洗后分散于二次水中，即得到具有特异性识别D/L-色氨酸印迹腔体的磁性分子印迹聚合物。(3)MIP-Fe304iPDA NPs磁性分子印迹聚合物在PDMS微通道内的固定化先在PDMS芯片微通道上下两边各放置一块永久磁铁(使相互吸引的两极彼此对应)，PDMS微芯片通道用二次蒸馏水冲洗10 min后，用真空泵将制备的具有特异性识别手性色氨酸印迹腔体的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物连续抽入分离通道内5 min，在外磁场作用下，MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物被迅速可控地固定于PDMS芯片微通道内指定位置；修饰后的PDMS芯片于4 ° C放置30 min，用缓冲溶液冲洗分离通道5 min，将残留物冲洗干净，即获得MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物修饰PDMS微芯片系统。上述方法中
所述的Fe3O4 NPs的制备方法中，所用FeCl3 MH2CK乙二醇、NaAc、聚乙二醇的量分别为1. 35 g、40 mL、3. 6 g和1.0 g,混合溶液超声时间为20 min。所述的Fe3O4 NPs的制备方法中，所述混合溶液在高压反应釜中的反应温度为180° C，反应时间为6 h。所述的Fe3O4 NPs的制备方法中，所述的Fe3O4 NPs的平均粒径约为126 nm。所述的MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备方法中，所述的Fe3O4 NPs和D/L-色氨酸的量为25 mg和50 mg，即质量比为1:2。所述的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备方法中，所述的PBS缓冲溶液的浓度为20 mM，pHS8.0。所述的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备方法中，所述的功能单体多巴胺的质量为15 mg。所述的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备方法中，所述的功能单体分子多巴胺聚合印迹的反应时间为4 h。所述的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备方法中，洗脱性分子印迹聚合物中的模板分子时，采用的洗脱液为5%(v/v)醋酸和0. 1% (w/v)十二烧基磺酸钠混合溶液。所述的MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备方法中，所述的整个反应过程都需要不停地机械搅拌。所述的MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物在PDMS微通道内的固定化中，通过外加磁场方式将洗脱模板分子后的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物快速可控地固定到PDMS微芯片分离通道内的指定位置。所述的MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物在PDMS微通道内的固定化中，为使MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物布满整个分离通道，需连续真空抽取5 min。所述的MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物在PDMS微通道表面的固定方法中，为更好地将MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物固定于PDMS微芯片通道内，在将该磁性分子印迹聚合物连续抽入分离管道中5 min后，须将修饰后的PDMS芯片于4 ° C放置30 min后使用。本发明的优点是
(I)与现有分子印迹技术相比，本发明发展的磁性分子印迹技术在整个分子印迹过程中无需额外添加任何如有机溶剂、交联剂、引发剂及致孔剂等其它化学试剂，具有绿色环保、成本低廉、操作简单且快速有效的优点。不仅扩展了功能单体的选择范围，也为MIP的合成方法提供了一种新思路。(2) MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物中含有的大量特异性识别D/L-色氨酸的印迹位点，有利于D/L-色氨酸对映体的选择性分离，同时，纳米级的磁性纳米材料在微通道内形成渗透性好、填充均匀的结构，提高了印迹效率和识别能力，大大提高了 D/L-色氨酸对映体的分离效率。(3)本发明制备的磁性固定相可在外磁场作用下定位于分离管道中的预指定区域，还可方便地调节固定相的填充长度，大大节约了操作时间；而且，当没有外磁场时，磁性固定相很快被冲洗出微芯片通道，有利于芯片的更新，大大提高了芯片的重复利用率。(4)该技术还有望用于生物大分子(蛋白质、多肽、核苷酸等)的印迹、分离及检测等领域。

图1是本发明涉及的PDMS微流控芯片结构示意图。(I)样品池，(2)缓冲溶液池，
(3)样品废液池。图2是(A) Fe3O4 NPs和(B) MIP-Fe3O4OPDA NPs分子印迹聚合物的扫描电子显微镜表征。图3 是(a) Fe3O4 NPs，(b) PDA，(c) L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs (印迹聚合物洗脱模板分子L-色氨酸之前)，(d) L-色氨酸，(e) MIP-Fe3O4IgPDA NPs (印迹聚合物洗脱模板分子L-色氨酸之后)的傅里叶变换红外光谱表征。图 4 是(a) Fe3O4 NPs，(b) L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs，(c) MIP-Fe3O4OPDA NPs，(d) Fe3O4OPDA NPs, (e) L-色氨酸和(f) PDA的紫外吸收光谱表征。图5 是(a) PDA, (b) L-色氨酸，(c) Fe3O4OPDANPs, (d) L-Trp-MIP-Fe3O4OPDANPs和(e) MIP-Fe3O4OPDA NPs的荧光光谱表征。图 6 是(a)裸 PDMS，(b) L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs, (c) D-Trp-MIP-Fe3O4 iPDANPs印迹聚合物修饰PDMS芯片对D/L-色氨酸的电泳分离图。运行缓冲溶液，20 mM (pH7. 17) PBS ;分离电压，+1200 V ;进样电压，+800 V ;进样时间，5 s ;检测电极，碳纤维电极；检测电位，+0.6 V (vs. Ag/AgCl)。图7是不同浓度多巴胺印迹MIP-Fe3O4 iPDA NPs修饰PDMS芯片对D/L-色氨酸电泳分离效果的影响(a) 5 mg/mL, (b) 15 mg/mL DA, (c) 20 mg/mL DA, (d) 25 mg/mL DA。其它条件同图6。图8是不同检测电位对D/L-色氨酸电泳分离检测的影响(a) 0. 8 V，(b) 0. 7 V,(c) 0.6 V，(d) 0.5 V，(e) 0.4 V。其它条件同图 6。图9是不同分离电压对D/L-色氨酸电泳分离检测的影响(a) 1400 V, (b) 1300V, (c) 1200 V, (d) 1100 V。其它条件同图 6。
具体实施方案下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步阐述，本发明并不限于此。实施例1 PDMS芯片的制作以砷化镓(GaAs)阳模(南京第55电子研究所制作)为模板，制作十字型PDMS微流控芯片通道，如图1所示。具体制作过程如下取一定量的PDMS单体和固化剂按10:1 (质量比)混合均匀、除气，倾注于GaAs模板上，在70 °C下固化2小时。待冷却后从模板上剥下含十字型通道的PDMS芯片，用刀片切割成所需形状，并用打孔器在缓冲液池、样品池和样品废液池等三处打孔，形成直径为3 mm的孔。同时，以平滑玻璃板为模板，按照同样步骤制备不含微通道的PDMS芯片为盖片。将含十字通道的PDMS芯片和不含通道的PDMS盖片依次用二次水、甲醇、二次水超声清洗10 min，在红外灯下烘干，随即将两片PDMS封合，形成一块可逆的PDMS芯片。PDMS分离通道长42 mm (有效分离长度37 mm)，进样通道长10 mm。所制得的PDMS分离通道呈梯形，上底宽50 iim,下底宽65 iim,深18 u m0实施例2
(I)采用水热法合成磁性Fe3O4纳米粒子(NPs):将1.35 g FeCl3 6H20溶于40 mL乙二醇中，超声使其混合均匀；向上述溶液中加入3. 6 g无水NaAc和1.0 g聚乙二醇，超声20min，将混合溶液转入高压反应釜中于180 ° C反应6 h，待高压釜冷却至室温后，将产物用二次蒸馏水清洗数次，溶于4 mL 二次蒸馏水中，即得到浓度为50. 2 mg/mL、平均粒径为126nm 的 Fe3O4 NPs。(2)MIP-Fe304iPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备将25 mg Fe3O4 NPs与50 mg模板分子D/L-色氨酸溶解于10 mL 20 mM pH 8. 5的PBS缓冲溶液中，机械搅拌混匀后，向上述溶液中加入15 mg功能单体多巴胺，继续机械搅拌4 h，利用多巴胺在碱性条件下自聚合生成的粘附性极强的PDA将模板分子D/L-色氨酸印迹到Fe3O4 NPs表面，制得磁性分子印迹聚合物。利用磁性分离和清洗技术，用洗脱液(5%(v/v)醋酸和0. 1% (w/v)十二烷基磺酸钠混合溶液)清洗磁性分子印迹聚合物数次，洗脱模板分子后的产物用二次蒸馏水清洗后分散于二次水中，即得到具有特异性识别D/L-色氨酸印迹腔体的磁性分子印迹聚合物。所制得的Fe3O4 NPs和MIP-Fe3O4OPDA NPs的扫描电镜结果如图2所示。由图可见，Fe3O4 NPs的平均粒径约为126 nm(图2A)。当在Fe3O4 NPs表面聚合一层PDA后，得到的MIP-Fe3O4OPDA NPs很好地保持了磁性纳米粒子的球形结构，且平均粒径增大至155 nm(图2B)。这表明通过简单的多巴胺自聚合作用生成的PDA已经成功包裹于Fe3O4 NPs表面，并且粒径分布均匀，而且，通过调节聚合时间，可以可控调节PDA在Fe3O4 NPs表面的厚度，有利于得到分布均匀并且能够特异性识别目标分子的印�？涨唤峁梗佣玫厥迪质中陨彼岫杂程逶贛IP-Fe3O4IgPDA NPs功能化PDMS芯片微通道内的高效分离。图3 是(a) Fe3O4 NPs, (b) PDA，(c) L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs (印迹聚合物洗脱模板分子L-色氨酸之前)，(d) L-色氨酸，(e) MIP-Fe3O4IgPDA NPs (印迹聚合物洗脱模板分子L-色氨酸之后)的傅里叶变换红外光谱表征。为了进一步证明利用多巴胺作为功能单体能够将目标分子印迹在磁性Fe3O4 NPs表面，我们对 Fe3O4 NPs、PDA、L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs、L-色氨酸、MIP-Fe3O4OPDA NPs 分别进行了红外光谱表征(图3)。在Fe3O4 NPs的吸收光谱图中，577 cnT1处出现了 Fe-O键的吸收峰(图3a);由图3b可见，当多巴胺自聚合生成PDA后，分别在1629 cm'3420 cm—1和3040 cnT1处出现了芳基环、酚羟基和N-H基团的特征吸收峰；当通过多巴胺的自聚合作用将模板分子L-色氨酸(L-Trp)同时固定于Fe3O4 NPs表面后，制备的洗脱模板分子之前的磁性分子印迹聚合物L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs在1340 cnT1和1410 cnT1处出现了 COCT1的伸缩振动特征吸收峰(图3c)，对应于L-色氨酸的特征吸收(图3d)，表明通过本发明的印迹技术，可实现L-色氨酸在Fe3O4OPDA NPs表面的成功印迹。当用洗脱液去除了模板分子 L-色氨酸后，制备的 MIP-Fe3O4OPDA NPs 保留了 1629 cm'3420 cnT1 和 3040 cnT1 处芳基环、酚羟基和N-H基团的特征吸收峰，而1340 cnT1和1410 cnT1处L-色氨酸的特征吸收峰消失了(图3e)，表明经5%(v/v)醋酸和0. 1% (w/v)十二烷基磺酸钠混合溶液处理后，L-色氨酸可从[email protected] NPs中被成功洗脱出来。此外，在Fe3O4 NPs、Fe3O4OPDANPs和L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs的红外吸收光谱图中，都在577 cnT1处出现了 Fe-O键的特征吸收峰，表明在分子印迹的过程中，Fe3O4 NPs很好地保持了其结构特征。以上结果表明，采用本发明发展的多巴胺自聚合印迹方法，成功地制备了 MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物。为了进一步证明经洗脱液5%(v/v)醋酸和0.1% (w/v)十二烷基磺酸钠混合溶液处理后，镶嵌在磁性分子印迹聚合物中的模板分子L-色氨酸能有效地被洗脱出来，我们采用UV-vis光谱对L-色氨酸洗脱前和洗脱后的磁性分子印迹聚合物进行了表征。图4分别为 Fe3O4 NPs、L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs、MIP-Fe3O4O PDA NPs、Fe3O4OPDA NPs、L-色氨酸和PDA的UV-vis吸收光谱图。在波长200-600 nm范围内，随着波长的增大Fe3O4 NPs的吸收强度逐渐增大，但并未观察到明显的特征吸收峰(图4a)，与文献报道结果一致。当通过本发明发展的多巴胺自聚合分子印迹技术制备了 Fe3O4OPDA NPs (图4d)和在Fe3O4 NPs表面印迹了 L-色氨酸后(图 4b)，制得的 Fe3O4OPDA NPs 和 L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs 分别在 219nm和282 nm处出现了两个特征吸收峰,对应于PDA的特征吸收(图4f),表明通过多巴胺的自聚合作用生成的PDA已成功包裹于Fe3O4 NPs表面。当利用洗脱液对L-Trp-MIP-Fe3O4IgPDA NPs中的模板分子进行洗脱后，获得的MIP-Fe3O4OPDA NPs在219 nm和282 nm处的两个特征吸收峰强度明显降低了(图4c)，表明L-色氨酸在分子印迹的过程中已经成功地镶嵌在Fe3O4 NPs微球表面的PDA薄膜内，并且在洗脱液的作用下成功地被洗脱出来。为了进一步表征本发明方法制备的特异性识别L-色氨酸分子的印迹聚合物，我们采用荧光光谱对磁性分子印迹聚合物的光学性能进行了考察。图5为PDA、L-色氨酸、Fe3O4OPDA NPs、L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs 和MIP-Fe3O4OPDA NPs 的荧光光谱图。当激发波长为280 nm时，PDA (图5a) ,L-Trp (图5b)和Fe3O4OPDA NPs (图5c)的发射波长分别为316 nm、353 nm和318 nm。当PDA通过多巴胺在碱性条件下自聚合包裹在Fe3O4 NPs表面后，Fe3O4OPDA NPs的发射波长比PDA红移了 2 nm，表明PDA与Fe3O4 NPs发生了相互作用。当激发波长为280 nm时，L-色氨酸的发射波长为353 nm (图5b)，当把L-色氨酸印迹于Fe3O4OPDA NPs时，[email protected] NPs的发射波长为347 nm (图5d)，当将模板分子洗脱后，MIP-Fe3O4OPDA NPs 的发射波长为 322 nm (图 5e)。以上结果表明，L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs印迹聚合物经洗脱液洗脱后，模板分子L-色氨酸被成功洗脱出来。MIP-Fe3O4IgPDANPs的发射波长比Fe3O4OPDA NPs的发射波长稍有红移，这可能是由于在分子印迹过程中，模板分子与MIP-Fe3O4IgPDA NPs中的特异性识别位点之间发生了相互作用引起的。实施例3
MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物在PDMS微通道内的固定化 (I) PDMS微流控芯片的制作过程参照实施例1的步骤。(2) MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物在PDMS微通道内的固定化先在PDMS芯片微通道上下两边各放置一块永久磁铁(使相互吸引的两极彼此对应)，PDMS微芯片通道用二次蒸馏水冲洗10 min后，用真空泵将制备的具有特异性识别手性色氨酸印迹腔体的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物连续抽入分离通道内5 min，在外磁场作用下，MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物被迅速可控地固定于PDMS芯片微通道内指定位置；修饰后的PDMS芯片于4 ° C放置30 min后，用缓冲溶液冲洗分离通道5 min,将残留物冲洗干净，即获得MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物修饰PDMS微芯片系统。实施例4
MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物修饰PDMS微流控芯片的应用
(I)MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物功能化PDMS微流控芯片在色氨酸对映体分离分析中的应用。图 6 为 PDMS、L-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs 和 D-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs修饰PDMS芯片对D/L-色氨酸的电泳分离图谱。在裸PDMS芯片微通道内(图6a)，D/L_色氨酸只有一个峰，根本无法实现它们的有效分离；然而在[email protected] NPs (图6b)和D-Trp-MIP-Fe3O4OPDA NPs (图6c)分子印迹聚合物修饰PDMS芯片微通道内，D/L-色氨酸在60 s内获得了有效分离。通过对以L-色氨酸为模板分子([email protected] NPs)和以D-色氨酸为模板分子(D-Trp-MIP-Fe3O4 iPDA NPs)制备的分子印迹聚合物修饰通道内分离D/L-色氨酸的电泳曲线的比较，我们发现，当用印迹不同目标分子的印迹聚合物修饰芯片微通道分离D/L-色氨酸时，D/L-色氨酸对映体的出峰顺序发生了改变，这是由于利用不同模板分子印迹的分子印迹聚合物对各自相对应的目标分子具有特异性识别作用所致。以上结果表明，本发明方法所制备的分子印迹聚合物具有特异性识别目标分子的功能。(2)多巴胺浓度，检测电位，分离电压对D/L-色氨酸对映体电泳分离的影响
图7为多巴胺浓度对D/L-色氨酸对映体电泳分离检测的影响，当多巴胺的浓度低于15mg/mL时,D/L-色氨酸只能获得部分分离(图7a, b)。而当多巴胺的浓度增大到20 mg/mL时，D/L-色氨酸仅在60 s内获得了有效分离(图7c)，此时，D-色氨酸和L-色氨酸的理论塔板数分别为2690000和2850000 plates/m，分离度高达1. 68。当多巴胺浓度超过20 mg/mL时，电泳峰出现了拖尾并且展宽的现象(图7d)。因此在制备分子印迹聚合物时，我们所选择多巴胺浓度为20 mg/mL。图8考察了检测电位对D/L-色氨酸对映体分离检测的影响，当检测电位低于+0. 4V时，D-和L-色氨酸的峰电流均较小。随着检测电位的增加,峰电流也随之增大。当检测电位高于+0. 6 V时，峰电流增加缓慢，当继续增大检测电位时，背景电流也随之增加。此外，由于碳纤维工作电极承受过高电压容易软化，为了延长工作电极的使用寿命以及兼顾检测信号的稳定性、重现性和信噪比，本实验选择+0.6 V (vs. Ag/AgCl)为检测电位。图9为分离电压对D/L-色氨酸对映体分离检测的影响，在MIP-Fe3O4OPDA NPs修饰PDMS芯片微通道内，随着分离电压的增加，安倍响应信号逐渐增大，D/L-色氨酸的迁移时间逐渐缩短，这是因为分离电压与工作电极之间的耦合作用导致检测电位随着分离电压的增大而增大，结合安培检测电位增加和分离电场增强的影响，使得峰电流不断增大。当分离电压低于1100 V时，D/L-色氨酸无法达到有效分离。当分离电压增大到1300 V时，D/L-色氨酸较好地实现了基线分离，且峰形变得更加尖锐和对称。然而，当分离电压超过1300V时，分离度逐渐降低，且噪音随着焦耳热的产生而增大。因此，综合考虑分析时间、检测灵敏度以及信噪比等各方面的因素，本实验选择最优分离电压为1300 V。
权利要求
1.磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用，其特征在于步骤如下 (1)采用水热法合成强磁性的Fe3O4NPs:首先将1. 35 g FeCl3 6H20溶于40 mL乙二醇中，通过超声使其混合均勻；再向上述混合溶液中分别加入3. 6 g无水NaAc和1. O g聚乙二醇，继续超声20 min，溶液混合均匀后转入高压反应釜中180 ° C下反应6 h，待高压釜冷却至室温后，将制得的黑色磁性纳米粒子用二次蒸馏水清洗数次；将产物溶于4 mL 二次蒸馏水中，得到浓度为50. 2 mg/mL平均粒径为126 nm的Fe3O4 NPs ； (2)MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物的制备将25 mg Fe3O4 NPs与50 mg模板分子D/L-色氨酸溶于10 mL浓度为20 mM、pH 8. 5的PBS缓冲溶液中，机械搅拌混匀后，加入15 mg功能单体多巴胺，机械搅拌反应4 h，利用多巴胺在碱性条件下发生自聚合作用生成粘附性极强的PDA将模板分子D/L-色氨酸同时印迹到Fe3O4 NPs表面，制得磁性分子印迹聚合物，通过磁性分离清洗技术，用洗脱液5%v/v醋酸和O. 1% w/v十二烧基磺酸钠混合溶液清洗磁性分子印迹聚合物数次，洗脱模板分子的产物用二次蒸馏水清洗后分散于二次水中，即得到具有特异性识别D/L-色氨酸印迹腔体的分子印迹聚合物； (3)MIP-Fe304iPDANPs磁性分子印迹聚合物在PDMS微通道内的固定PDMS芯片通道先用二次蒸馏水冲洗10 min，再在PDMS芯片微通道上下两边各放置一块永久磁铁(使相互吸引的两极彼此对应)，用真空泵将含有特异性识别色氨酸对映体的印迹腔体的MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物连续抽入分离通道内5 min，在外磁场作用下，MIP-Fe3O4OPDANPs被迅速可控地固定于PDMS芯片微通道内预定的位置；修饰后的PDMS芯片于4 ° C放置30 min后，用背景缓冲溶液连续冲洗分离通道5 min，将通道内的残留物冲洗干净，即获得MIP-Fe3O4OPDA NPs磁性分子印迹聚合物修饰PDMS微芯片系统。
2.根据权利要求1所述的磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用，其特征是所述的Fe3O4 NPs的制备方法，步骤(I)中，所用FeCl3 6H20、乙二醇、NaAc、聚乙二醇的量分别为1. 35 g、40 mL、3.6 8和1.0 g，并且混合溶液超声时间为20 min ;所述混合溶液在高压反应釜中的反应温度为180 ° C，反应时间为6 h;所述的Fe3O4 NPs的平均粒径约为126 nm。
3.根据权利要求1所述的磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用，其特征在于步骤(2)中，所述的Fe3O4 NPs和D/L-色氨酸的量为25 mg和50 mg，即质量比为1:2 ;所述的PBS缓冲溶液的浓度为20 mM, pH为8. O ;所述功能单体多巴胺的量为15 mg ；所述单体分子多巴胺聚合印迹的反应时间为4 h ;所述洗脱性分子印迹聚合物中的模板分子时，采用的洗脱液为5%(v/v)醋酸和O. 1% (w/v)十二烷基磺酸钠混合溶液；所述的整个反应过程都需要不停地机械搅拌。
4.根据权利要求1所述的磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用，其特征在于步骤(3)中，所述的通过外加磁场方式将洗脱模板分子后的MIP-Fe3O4OPDANPs磁性分子印迹聚合物快速可控地固定到PDMS微芯片分离通道内的指定位置；所述的MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物布满整个分离通道，需连续真空抽取5 min ;为更好地将MIP-Fe3O4IgPDA NPs磁性分子印迹聚合物固定于PDMS微芯片通道，在将该磁性分子印迹聚合物连续抽入分离管道中5 min后，须将修饰后的PDMS芯片于4 ° C放置30 min后使用。
全文摘要
本发明公开了一种磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用，利用磁性分子印迹技术构建对手性物质具有选择性识别作用的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片系统的新方法，属于微流控芯片技术领域，该发明发展的基于磁性分子印迹技术构建手性选择性PDMS微流控系统的新方法，具有大量的特异性识别D/L-色氨酸的印迹位点，可实现手性色氨酸的选择性、快速和高效分离。该技术有望用于生物大分子(蛋白质、多肽、核苷酸等)的印迹、分离及检测等领域。
文档编号G01N33/00GK103033596SQ20121047978
公开日2013年4月10日申请日期2012年11月23日优先权日2012年11月23日
发明者梁汝萍, 孟祥英, 邱建丁申请人:南昌大学

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磁性分子印迹技术在微流控分析系统手性识别中的应用的制作方法