专利名称：禽流感病毒rt-pcr elisa诊断方法及应用该方法的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物病毒学领域，特别涉及生物技术领域内的诊断技术，更具体涉及一种利用RT-PCR ELISA技术对禽流感病毒进行高通量快速诊断及应用该诊断方法制备的试齐U盒。
背景技术：
禽流感是由A型流感病毒引起的一种急性接触性的传染�。芨腥景ㄈ�、禽、 猪、马等多种动物。禽流感不仅给畜牧业带来灾难性的破坏，而且对公共健康也构成了严重威胁。禽流感病毒(AIV)变异迅速，虽然尚未获得在人群中有效传播的能力，但其日益频繁的致人感染的事件表明，AIV病毒正经历着适应于人体的复杂的变异过程，再一次的人类流感暴发已在酝酿之中。对多个种属的易感动物进行长期的流行病学监测，从而密切跟踪AIV 变异的趋势，无疑是应对流感暴发的有效措施。因此，除了研制疫苗外，敏感、快速、经济并能进行大规模样本筛查的病原检测方法是我们目前亟需的应对流感大流行的技术储备。
禽流感的检出方法主要包括病原学、免疫学及分子生物学三个方面。病毒分离和 HA/HI试验是经典的实验室诊断方法，结果可靠但耗时太长；琼脂扩散(AGP)试验具有简便快速的特点，但此法的敏感性较低；RT-PCR虽然能检出禽流感病毒，但敏感性不高，对含毒量低的样本的检出率较低；免疫荧光检测技术虽然具有快速准确等优点，但不能进行大规模检测和容易受检测人员判定水平影响等缺点。RT-PCR ELISA将RT-PCR的特异性和ELISA 的高灵敏性结合起来，具有灵敏度和特异性高、无EB污染、适于高通量检测等特点，已应用于多种疫病的实验室检测中。但是上述方法在AIV的检测方面依然是一个空白。发明内容
本发明的发明人提供的检测方法，首先根据流感病毒保守的M基因设计了特异性引物，该引物特异性强，且上下游引物并分别用生物素和地高辛标记，先用特异性的引物扩增出保守片段，然后用链霉亲和素包被酶标板，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加 TMB显色液，阳性产物即可显色；在此基础上本发明成功研制了专用试剂盒。该方法将PCR 和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍以上，可检出0. OOlEID50的AIV病毒总RNA，而且特异性强，克服了组织样品中AIV含量少而难以检测的困难，与病毒分离方法相比符合率可达95%以上，且排除了化学试剂(如溴化乙锭)的污染，有利于自动化，适于大量样本的检测，为禽流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。
本发明所采用的具体检测方法是
根据流感病毒保守的M基因设计特异性上游引物Ml和下游引物M2， 其中所用的上游引物Ml其序列如kq ID No :1所示，采用生物素标记后5，BI0TIN-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3，，下游引物 M2 其序列如 kq ID No 2 所示，采用地高辛标记后5’ DIG-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’，均采用现有技术直接合成标记，引物在应用时以灭菌双蒸水稀释，浓度为20ρπκ)1/μ L，预期扩增产物长度229bp ；
更为具体的步骤如下
采用常规方法提取待测样品基因组中RNA ；
根据上游引物Ml和下游引物M2 RT-PCR反应获得PCR产物；
将上述获得的PCR产物与0. OlM pH7. 4的PBST按体积比1 50进行稀释，然后加入到以50 μ L 2 μ g/mL链霉亲和素4°C过夜包被好的酶标板中，每孔加样品50 μ L，于 37°C温箱中孵育1. 5h后取出，倒掉孔内液体，再用0. OlM pH7. 4的PBST洗板，洗板时每孔加200 μ LPBST洗板，然后在滤纸上拍干，重复3次；之后每孔加入50 μ L按体积比1 3000 稀释的Anti-Digoxigenin-POD溶液，37°C温箱中孵育lh，倒掉孔内液体，采用上述的洗板方法用PBST洗板3次，之后加入50 μ LTMB底物，室温孵育30min后加入终止液终止反应， 酶标仪中测定0D450值；
反应同时设阳性和阴性对照孔，阴性阳性的判定标准为0D450值大于或等于 0. 1357为阳性，小于0. 1357为阴性，当阳性孔和阴性孔0D450值结果成立时判定结果有效。
其中所述的稀释时使用的PBST溶液规格如下每IOOOmL该溶液种含8g的NaCl， 0. 2g 的 KCl, 2. 9g 的 Na2HPO4 · 12H20,0. 2g 的 KH2P04 和 0. 5mL 的 tween-20，余量为水。
而所述的预先以2 μ g/mL链霉亲和素包被的酶标板为
用50uL含链霉亲和素的包被液4°C包被过夜，以0.01M pH7. 4PBST洗板3次，每次3分钟，加入封闭液，37°C封闭Ih的酶标板，其中所采用的包被液为含15mM NaCO3, 35mM NaHCO3, pH 9. 6的水溶液，其中所述的封闭液为IOOmLPBST中含Ig牛血清白蛋白(BSA)的溶液。
所述的Anti-Digoxigenin-POD是以PBST按体积比1 3000纯水稀释获得的水溶液。
所述的TMB底物为TMB母液10mL，底物缓冲液90mL，H2A 750uL临用前配制而成； 其中所述的TMB母液为0. IgTMB以IOOmL无水乙醇溶解获得的溶液；所述的底物缓冲液为每500mL溶液含14. 2g柠檬酸，10. 5g Na2HPO4 · 12H20以纯净水配制的溶液。
所述的终止液为每IOOmL溶液中含11. lmL98%浓硫酸&S04，88. 9mL纯净水的溶液。
所用阳性对照标准品为在上述扩增M基因的引物基础上，在上游引物Ml 5’ 端加入T7启动子序列，在下游引物M2 5’端加入oligo-dT用于转录M基因，上游引物 F 5，_ GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGG TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3，(斜体部分为 T7启动子序列，下划线部分为上述Ml引物)其序列如％(1 ID No :3所示，下游引物R 5' - TTTTTTTTTTTTTTT AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3，(斜体部分为 01igo-dT，下划线部分为上述M2引物)其序列如％(1 ID No :4所示，引物由现有技术直接合成获得，稀释至20μΜ浓度使用。以禽流感病毒基因组为模板，按前面所述RT-PCR条件扩增该片段，然后使用Τ7体外转录系统(RiboMAX LargeScale RNA Production Systems)按照试剂盒操作步骤加入 Buffer 20 μ L, dNTP30 μ L,上述纯化的 PCR 产物 5-10 μ g、酶混合物(T7) 10 μ L, DEPC 水补至100 μ L体外转录制备M基因RNA，所得RNA经苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，用DEPC水溶解，紫外分光光度计测定浓度后作为标准阳性模板-70°C分装保存备用。
阴性阳性结果判定的临界值为0. 1357，是通过对22份从SPF鸡采取的咽拭子和直肠拭子阴性样品的检测，根据公式阴阳性标准的临界值=阴性样品的平均值+3X标准差确定。
综上所述，本发明的发明人根据流感病毒保守的M基因设计了特异性引物，该引物特异性强，且上下游引物并分别用生物素和地高辛标记，先用特异性的引物扩增出保守片段，然后用链霉亲和素包被酶标板，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加TMB显色液， 阳性产物即可显色；而且发明人在此基础上本发明成功研制了专用试剂盒。该方法将PCR 和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高100倍以上，可检出0. OOlEID50的AIV病毒总RNA，而且特异性强，克服了组织样品中AIV含量少而难以检测的困难，与病毒分离方法相比符合率可达95%以上，且排除了化学试剂(如溴化乙锭)的污染，有利于自动化，适于大量样本的检测，为禽流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。
图1为RT-PCR扩增禽流感病毒M基因电泳图中 M 为 DL2000 marker, 1 为 IpgM 基因 RNA，2 为 0. IpgM 基因 RNA，3 为 0. OlpgM 基因RNA，4为0. OOlpgM基因RNA，5为0. OOOlpgM基因RNA ；从图上可看出1_4泳道条带较清晰，第5泳道条带�：负蹩床坏剑得鞅痉⒚髦械腞T-PCR方法检测灵敏度为0. OOlpg M 基因RNA ；
图2为RT-PCR产物ELISA检测结果灰度图中1-11列为11份阳性样品RT-PCR产物梯度稀释后的ELISA结果，第12列1_4 孔为阳性对照孔，5-8孔为阴性对照孔；从图中可以看出随着稀释度的升高，孔中溶液的颜色也逐渐变浅，即0D450值在逐渐降低，RT-PCR阳性产物稀释到1 6400时其0D450值仍大于阳性对照，而用常规的琼脂糖凝胶电泳法检测，RT-PCR产物稀释到1 40就已检测不到，其灵敏度比凝胶电泳法高出100多倍。
图3为图2的彩色示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐明本发明有关内容。下列实例中未注明的具体试验方法，通常按照分子克隆实验室手册中所述的条件，或按照制造厂商提供的条件。
实施例1
样品中基因组RNA的提取取研磨的临床病理组织或咽拭子、肛拭子样品300 μ L加入800 μ LTRIzol，按照TRIzol试剂盒操作步骤提取RNA。
根据流感病毒保守的M基因设计特异性上游引物Ml和下游引物M2, 其中所用的上游引物Ml其序列如％(1 ID No:l所示，其中采用了生物素标记 5，BI0TIN-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3，，下游引物 M2 其序列如 kq ID No 2 所示，其中采用地高辛标记5’ DIG-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’，均采用现有技术直接合成标记，
RT-PCR 反应利用 Primei^cript One Step RT-PCR 试剂盒进行 RT-PCR 反应，反应体系为buffer 25 μ L, Enzyme Mix 2 μ L，上游引物Ml (20 μ Μ) 1 μ L，下游引物 Μ2 (20 μ Μ) 1 μ L，模板6 μ L，加 DEPC水至 50 μ L。RT-PCR反应程序为:50°C 30min，94°C 2min, 94°C 30sec,58°C 30sec,72°C 30sec，30 个循环。RT-PCR 产物于 _20°C保存备用。
ELISA反应将上述获得的PCR产物与0. OlM pH7. 4的PBST按体积比1 50进行稀释，然后加入到以50 μ L 2μ g/mL链霉亲和素4°C过夜包被好的酶标板中，每孔加样品 501^，于371温箱中孵育1. 后取出，倒掉孔内液体，再用0. 01MpH7. 4的PBST洗板，洗板时每孔加200 μ LPBST洗板，然后在滤纸上拍干，重复3次；之后每孔加入50 μ L按体积比 1 3000稀释的Anti-Digoxigenin-POD溶液，37°C温箱中孵育lh，倒掉孔内液体，采用上述的洗板方法用PBST洗板3次，之后加入50 μ LTMB底物，室温孵育30min后加入终止液终止反应，酶标仪中测定0D450值；
反应同时设阳性和阴性对照孔，阴性阳性的判定标准为0D450值大于或等于 0. 1357为阳性，小于0. 1357为阴性，当阳性孔和阴性孔0D450值结果成立时判定结果有效。
其中所述的稀释时使用的PBST溶液规格如下每IOOOmL该溶液种含8g的NaCl， 0. 2g 的 KCl, 2. 9g 的 Na2HPO4 · 12H20,0. 2g 的 KH2P04 和 0. 5mL 的 tween-20，余量为水。
而所述的预先以2 μ g/mL链霉亲和素包被的酶标板为
用50uL含2 μ g/mL链霉亲和素的包被液4°C包被过夜，以0. OlM pH7. 4PBST洗板3次，每次3分钟，加入封闭液，37°C封闭Ih的酶标板，其中所采用的包被液为含15mM NaCO3, 35mM NaHCO3, pH 9. 6的水溶液，其中所述的封闭液为IOOmLPBST中含Ig牛血清白蛋白(BSA)的溶液。
所述的Anti-Digoxigenin-POD是以PBST按体积比1 3000纯水稀释获得的水溶液。
所述的TMB底物为TMB母液10mL，底物缓冲液90mL，H2O2 750uL临用前配制而成； 其中所述的TMB母液为0. IgTMB以IOOmL无水乙醇溶解获得的溶液；所述的底物缓冲液为每500mL溶液含14. 2g柠檬酸，10. 5g Na2HPO4 · 12H20以纯净水配制的溶液。
所述的终止液为每IOOmL溶液中含11. lmL98%浓硫酸&S04，88. 9mL纯净水的溶液。
所用阳性对照标准品为在上述扩增M基因的引物基础上，在上游引物Ml 5’端加入T7启动子序列获得上游引物F，其序列如％(1 ID No :3所示，上游引物 F5，- GGA TCCTAA TACGACTCACTA TAGGGAGG TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3，(斜体部分为 T7 启动子序列，下划线部分为上述Ml引物)，在下游引物M2 5’端加入oligo-dT用于转录 M基因获得下游引物R，其序列如^^ ID No :4所示，下游引物R5’-77T7T7T7T7T7T7T AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3 ’ (斜体部分为01igo-dT，下划线部分为上述M2引物)，引物由现有技术直接合成获得，稀释至20 μ M浓度使用。以禽流感病毒基因组为模板，按前面所述RT-PCR条件扩增该片段，然后使用Τ7体外转录系统(RiboMAX Large Scale RNA Production Systems)按照试剂盒操作步骤加入:Buffer 20 μ L, dNTP 30 μ L，上述纯化的 PCR产物5-10 μ g、酶混合物(T7)10yL，DEPC水补至100 μ L体外转录制备M基因RNA，所得RNA经苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后，用DEPC水溶解，紫外分光光度计测定浓度后作为标准阳性模板_70°C分装保存备用。
阴性阳性结果判定的临界值为0. 1357，是通过对22份从SPF鸡采取的咽拭子和直肠拭子阴性样品的检测，根据公式阴阳性标准的临界值=阴性样品的平均值+3X标准差确定。
结果判定阴性阳性的判定标准为0D450值大于或等于0. 1357为阳性，小于 0. 1357为阴性，当阳性孔和阴性孔0D450结果成立时判定结果有效。
实施例2
RT-PCR ELISA的敏感性对测定EID5tl的病毒提取RNA模板并梯度稀释后进行 RT-PCR检测，RT-PCR产物一部分用1. 5 %琼脂糖凝胶电泳法检测，一部分作1 100、 1 200、1 400、1 800、1 1600、1 3200、1 6400 稀释，进一步利用本发明建立的 ELISA方法进行检测。结果如图2所示，发现RT-PCR ELISA法能检测到0. OOlEID50的AIV 总RNA，RT-PCR ELISA检测发现阳性产物被稀释到1 6400仍能被检测到，比琼脂糖凝胶电泳法的灵敏度高100多倍(用琼脂糖凝胶电泳法检测，AIV阳性产物被稀释到1 40就已检测不到)。
实施例3
RT-PCR ELISA的特异性用TRIzol试剂盒按照说明书步骤提取AIV H9N2、H5N1、 H4N6、NDV、IBV的RNA，并以它们为模板用已建立的RT-PCR ELISA方法进行特异性检测。检测结果如下表所示，前3种血清型的AIV病毒0D450值均大于0. 65，NDV、IBV病毒0D450 值均小于阴性对照值，说明此方法特异性强，与部分病毒无交叉反应，可用于AIV的鉴别诊断。
表.RT-PCR ELISA方法的特异性试验
权利要求
1.一株禽流感病毒RT-PCR ELISA诊断方法，其特征在于具体方法如下首先根据流感病毒保守的M基因设计特异性引物上游引物Ml和下游引物M2 ；再用特异性的引物扩增出保守片段，然后用链霉亲和素包被酶标板，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加TMB显色液，阳性产物即可显色；其中所述的上游引物Ml和下游引物M2，其中所用的上游引物Ml其序列如％(1 ID No 1 所示，采用生物素标记后5，BI0TIN-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3‘；下游引物M2其序列如kq ID No :2所示，采用地高辛标记后 5’ DIG-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3’ ；上下游引物的浓度均为20ρπιΟ1/μ L，预期扩增产物长度229bp。
2.根据权利要求1所述的诊断方法，其特征在于具体步骤如下采用常规方法提取待测样品基因组中RNA ；根据上游引物Ml和下游引物M2 RT-PCR反应获得PCR产物；将上述获得的PCR产物与0. OlM pH7. 4的PBST按体积比1 50进行稀释，然后加入到以50 μ L 2 μ g/mL链霉亲和素4°C过夜包被好的酶标板中，每孔加样品5(^1^，于371 温箱中孵育1. 后取出，倒掉孔内液体，再用0.01M pH7. 4的PBST洗板，洗板时每孔加 200 μ LPBST洗板，然后在滤纸上拍干，重复3次；之后每孔加入50 μ L按体积比1 3000 稀释的Anti-Digoxigenin-POD溶液，37°C温箱中孵育lh，倒掉孔内液体，采用上述的洗板方法用PBST洗板3次，之后每孔加入50 μ LTMB底物，室温孵育30min后加入终止液终止反应，酶标仪中测定0D450值；反应同时设阳性和阴性对照孔，阴性阳性的判定标准为0D450值大于或等于0. 1357为阳性，小于0. 1357为阴性，当阳性孔和阴性孔0D450值结果成立时判定结果有效。
3.根据权利要求2所述的诊断方法，其特征在于所述的稀释时使用的PBST溶液规格如下每 IOOOmL 该溶液种含 8g 的 NaCl，0. 2g 的 KCl，2. 9g 的 Na2HPO4 · 12H20，0. 2g 的 KH2P04 和0. 5mL的tween-20，余量为水。
4.根据权利要求2所述的诊断方法，其特征在于所述的预先以2μg/mL链霉亲和素包被的酶标板为用50uL含2 μ g/mL链霉亲和素的包被液4°C包被过夜，以0. OlM pH7. 4PBST洗板3次， 每次3分钟，加入封闭液，37°C封闭Ih的酶标板，其中所采用的包被液为含15mM NaCO3, 35mM NaHCO3, pH 9. 6的水溶液，其中所述的封闭液为IOOmLPBST中含Ig牛血清白蛋白的溶液。
5.根据权利要求2所述的诊断方法，其特征在于所述的Anti-Digoxigenin-POD是以 PBST按体积比1 3000纯水稀释获得的水溶液。
6.根据权利要求2所述的诊断方法，其特征在于所述的TMB底物为TMB母液10mL，底物缓冲液90mL，H2O2 750uL临用前配制而成；其中所述的TMB母液为0. IgTMB以IOOmL无水乙醇溶解获得的溶液；所述的底物缓冲液为每500mL溶液含14. 2g柠檬酸，10. 5g Na2HPO4 ·12Η20以纯净水配制的溶液。
7.根据权利要求2所述的诊断方法，其特征在于所述的终止液为每IOOmL溶液中含 11. lmL98%浓硫酸&S04，88. 9mL纯净水的溶液。
8. 一种应用权利要求1所述禽流感病毒RT-PCR ELISA诊断方法的试剂盒。
全文摘要
本发明提供了根据流感病毒保守的M基因设计了特异性引物，借助生物素与链霉亲和素特异性结合的原理，使生物素标记的PCR产物结合到酶标板上，之后加入抗地高辛的过氧化物酶，最后加TMB显色液，阳性产物即可显色；在此基础上本发明成功研制了专用试剂盒。该方法将PCR和高灵敏度的地高辛检测系统相结合，敏感性比常规琼脂糖凝胶电泳检测方法高l00倍以上，而且特异性强，克服了组织样品中AIV含量少而难以检测的困难，与病毒分离方法相比符合率可达95%以上，且排除了化学试剂(如溴化乙锭)的污染，有利于自动化，适于大量样本的检测，为禽流感的早期诊断和分子流行病学调查提供了一条新途径。
文档编号G01N33/569GK102495208SQ20111032593
公开日2012年6月13日 申请日期2011年10月24日 优先权日2011年10月24日
发明者张琳, 张秀美, 杨少华, 胡北侠, 许传田, 颜世敢, 黄艳艳 申请人:山东省农业科学院畜牧兽医研究所
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