专利名称：抗hla－g的单克隆抗体及分泌它的杂交瘤细胞株、癌症诊断方法、诊断试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种单克隆抗体，具体地说，涉及一种抗人类白细胞抗原G(HLA-G)的单克隆抗体及其分泌该抗体的杂交瘤细胞株。
本发明还涉及检测常见恶性肿瘤病变中的HLA-G异常表达来诊断癌症的方法。
本发明还涉及利用该抗体制备的诊断恶性肿瘤的免疫组化试剂盒，以及该试剂盒在癌症诊断，评价癌症转移和预后以及治疗指导中的应用。
背景技术：
为了防止机体受到诸如病毒和细菌等外来病原的侵袭，哺乳动物在其进化过程中形成了称为主要组织相容性复合物(MHC)的复杂系统，可以将自体与异体相区别。人类的MHC基因组，也称为人类白细胞抗原(HLA)体系，位于6号染色体的短臂上，被分隔成三个不同的族I，II和III族。经典的HLA I族抗原(HLA-A，-B和-C)为高度多态性的细胞表面糖蛋白，分子量为40～50kD。在绝大多数的组织细胞都有表达。经典的HLA I族抗原与在细胞内处理后的多肽结合然后将其带至细胞表面呈递给CD8阳性的细胞毒性的T淋巴细胞(CTLs)。后者(CTLs)的功能是检查这些细胞有无异体蛋白合成，并将合成异体蛋白的细胞摧毁。因此，经典的HLA I族抗原对于经免疫系统消除以下细胞极为重要病毒感染的细胞(感染)，经历癌变的细胞(癌)，或同种异体移植细胞(器官移植)。(关于与HLA系统有关的生物学过程的综述，参见Sherman等的文章，Am Rev.Immunol.11385，1993。)人类白细胞抗原G(在本发明中均称为HLA-G)为非经典的I类抗原。在正常情况，其表达局限于胎盘的绒毛膜滋养层细胞。而在绒毛膜滋养层细胞，经典的HLA I族和II族抗原则表达缺失。(见McMaster等，J.Immunol.1543771，1995。)HLA-G的基因序列和结构与经典的HLA I基因高度同源，由8个外显子、7个内含子及1个3’末端的非翻译区组成。HLA-G蛋白的氨基酸顺序在重链的α1、α2和α3区域以及轻链的β2-微球蛋白区域与HLA-A、-B和-C蛋白顺序的同源性超过86％。HLA-G蛋白已鉴定为一组分子量为37～39KD的分子，(见Geraghty等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84945，1987；Parham等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.854005，1988；Shimizu等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.85227，1988。)与经典的HLA I族基因相反，HLA-G基因的多态性较低，至今仅发现4个等位基因。(见Ellis等，Am J.Reprod.Immunol.2384，1990；Kovats等，Science 248220，1990。)不过，HLA-G基因的转录产物可被剪切成为异构体。现已观察到四种表达膜蛋白的HLA-G mRNA的异构体HLA-G1、HLA-G2、HLA-G3和HLA-G4和三种表达可溶性蛋白的HLA-G mRNA的异构体HLA-G5，HLA-G6和HLA-G7。(见Ishitani等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.853947，1992；Kirszenbaum等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.914029，1994；Fujii等，J.Immunol.1535516。)这些mRNA编码的蛋白具有全长或缺少一两个区域，进而造成蛋白产物的分子量和功能都有很大的变异。
胎儿一半基因来至父亲，因而对母亲来讲是一种半同种异体物。母亲的免疫系统可能会对胎儿产生排斥。大量研究已经证明，HLA-G在胎盘的绒毛膜滋养层细胞表达能抑制母体免疫反应。换言之，HLA-G的作用在于通过抑制母体免疫反应维持母体对半同种异体胎儿的免疫耐受性。(关于HLA-G在妊娠中功能的综述，可参见Rouas-Freiss等，J.Biol.Regul.Homeost.Agents.1493，2000.)在肿瘤生物学中，HLA I族基因表达的下调是一个常见的现象。(有关综述见Garrido等，Immunology Today 1889，1997。)由于HLA I族分子在细胞毒性的T淋巴细胞的活化中发挥中心作用，HLA I族基因表达的下调就成为肿瘤逃逸机制之一。不过，由于NK细胞能水解HLA I族分子表达减少或者缺失的细胞，而使HLA I族基因表达下调的癌细胞可能受到NK细胞的攻击。(见Lanier LL和Philips JH，Immunol.Today 1786-9，1996。)但因为HLA-G具有抑制NK细胞的功能，如果因肿瘤细胞出现HLA-G的异常表达，就可能为其提供另一种逃避宿主免疫监视的机制。(见Dietl等，Gynecol.Obstet.Invest.33197，1992；Chumbley等，Cell Immunol.155312，1993。)因此，了解HLA-G是否参与了肿瘤免疫逃逸机制就具有重要的意义。自90年代以来，各国对不同癌症类型和各种癌细胞株的HLA-G表达进行了大量研究。绝大多数研究小组证实，HLA-G的表达在转录水平上呈阳性。然而，在蛋白质水平上对HLA-G表达的研究结果则不完全一致。在这些研究中，测定HLA-G蛋白的方法包括定性和定量多种技术，如流式细胞计数、免疫印渍、免疫细胞化学和酶联免疫(ELISA)等。部分采用抗HLA-G单克隆抗体(87G，01G，223G和MEMG/9)的研究得出阴性结果。(见Amiot等，Human Immunol.59524，1998；Real等，Int.J.Cancer 81512，1999；Frumento等，Tissue Antigens 5630，2000；Hurks等，Invest．Ophthalmol.Vis.Sci.423081，2001。)在主要是采用4H84抗HLA-G单克隆抗体的其它研究中，有21％～51％的结果则为阳性。(见Mizuno等，Br.J.Haematol.111280，2000；Urosevic等，Am.J.Pathol.159817，2001；Urosevic等，Blood 99609，2002；Lefebvre等，J.Pathol.196266，2002；Yang等，Chinese J.Histochem.Cytochem.1070。2001。)根据文献和调查，迄今为止，所有对癌组织或癌细胞株的HLA-G蛋白测定均采用合成的多肽或细菌合成的重组HLA-G蛋白免疫小鼠产生的抗HLA-G单克隆抗体来进行。所有的抗体都与重链结合，主要在HLA-G分子的α1区或α2区。
如上所述，在多数癌组织中均检测到HLA-G的mRNA的表达。最近还进一步证明在不同类型的恶性肿瘤可能表达不同HLA-G的转录异构体。(见Ritau等，Transplant Proc.332360，2001。)和HLA-G蛋白翻译后的各种糖蛋白的异构体(见McMaster等，J.Immunol.1605922，1998。)。这些发现提示，在绝大多数类型的癌症中都出现HLA-G蛋白的表达，只是在翻译的前后以不同的异构体出现。所以，对于检测癌症的HLA-G蛋白表达来说，检测试剂如抗体，必须能够同时与多种异构体反应才能得到好的结果。而这些由合成多肽和/或细菌合成的重组HLA-G蛋白免疫小鼠产生的抗体是不能令人满意的，因为合成多肽只有氨基酸平面顺序而细菌合成的重组HLA-G蛋白不能糖基化，产生的抗体不能同时与多种天然形态(接近生理条件下的形态)的异构体发生免疫反应，从而造成在一些癌症检测中呈阳性结果而另一些癌症检测中呈阴性结果，故在肿瘤病理检测中准确率不高。因此，有必要改进抗HLA-G的单克隆抗体，使之对所有的异构体都具有更高的检测特异性和灵敏度。最重要的是，HLA-G不在非妊娠的正常成人组织中表达，而在多种恶性肿瘤组织中表达，具有高度的恶性肿瘤的特异性，适宜用作癌症诊断，预后和治疗指导的新肿瘤标志物。研究表明，HLA-G在癌症中的表达与癌细胞组织学和疾病发展阶段有关，其应用前景是十分乐观的。(见Ugurel等，Cancer 92369，2001；Urosevic等，Am.J.Pathol.159817，2001；Urosevic等，Blood 99609，2002。)发明内容针对现有抗HLA-G单克隆抗体作为癌症检测标志物的缺陷，本发明的目的是提供一种新的单克隆抗体，命名为HGY。该单克隆抗体是抗人类白细胞抗原G单克隆抗体，即抗HLA-G单克隆抗体，属IgG3亚型，进一步地，该单克隆抗体能够与7种HLA-G异构体发生抗原抗体反应。
本发明的单克隆抗体可以通过本发明的杂交瘤细胞株产生，因此可以从培养本发明的杂交瘤细胞株的培养液中获得，或用杂交瘤细胞株细胞种植到实验动物腹腔产生腹水而获得。然而，产生本发明的单克隆抗体的方法不受特别的限制，如通过基因工程方法得到的能够与7种HLA-G发生抗原抗体反应，属IgG3亚型的抗体，也属于本发明的范围之内。
本发明的另一目的是提供一种杂交瘤细胞株，它能够产生属IgG3亚型的抗HLA-G单克隆抗体，进一步地，它能够产生与7种HLA-G异构体发生抗原抗体反应的单克隆抗体。
本发明的杂交瘤细胞株可以用本领域技术人员所熟知的细胞融合技术产生，因此，用近似生理条件下的(天然的HLA-G)作为抗原免疫小鼠等动物，将该动物的脾细胞或淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，产生杂交瘤细胞株，并从中筛选出产生IgG3亚型的，能够与7种HLA-G异构体发生抗原抗体反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，从而获得本发明的杂交瘤细胞株。
所述的杂交瘤细胞株，优选的是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO.C200416的杂交瘤细胞株细胞系。
本发明的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体构成了本发明的一个方面。
本发明的一种恶性肿瘤的免疫检测方法构成了本发明的另一个方面，该方法使用至少一种上述的单克隆抗体来检测。
进一步地，该方法使用上述的任意一种单克隆抗体来检测。该方法可以用于诊断恶性肿瘤；也可以用于评价恶性肿瘤发展、转移及预后，还可以指导癌症的治疗。
优选的是本发明的免疫检测方法，是使用免疫印渍法进行，也可以用ELISA技术进行。
本发明的另一方面是，含有至少一种上述的单克隆抗体的试剂盒，优选的试剂盒是含有上述的任意一种单克隆抗体。本发明的试剂盒可以用于诊断恶性肿瘤，也可以用于恶性肿瘤发展、转移及预后，及治疗指导。本发明的试剂盒优选采用免疫印渍法或ELISA技术进行检测。
由于本发明的单克隆抗体与其他类型的HLA I族抗原不存在交叉反应，因此本发明的单克隆抗体对于HLA-G具有高度的特异性。并且本发明的单克隆抗体与所有HLA-G异构体相结合，虽然不同类型的癌症可能表达出不同的HLA-G异构体，但是对不同类型癌症的各种表达产物，本发明单克隆抗体都能够加以检测，因此具有很高的灵敏性。同时，本发明的单克隆抗体稳定，可以通过本领域技术人员所公知的方法，将本发明的单克隆抗体制备成各种形式的试剂盒，以方便临床的大规模使用，为癌症的诊断，发展转移的评价以及治疗指导提供了一种可靠的有价值的途径。
图1.纯化天然HLA-G蛋白的SDS-PAGE和免疫印渍。
用抗体亲和层析技术分离一期妊娠胎盘组织裂解物中的HLA-G蛋白(A)。纯化的蛋白用SDS-PAGE，考马斯亮蓝染色分析(B)并转移至PVDF膜，与抗-HLA-G单克隆抗体4H84进行印渍反应(C)。
图2.本发明抗体HGY与抗-HLA-G单克隆抗体4H84的比较。
用纯化天然的HLA-G蛋白4℃过夜包被ELISA板。洗板和封闭后用不同剂量的抗-HLA-G单抗HGY和4H84室温保温1小时。洗板4次，与羊抗鼠抗体-HRP复合物室温保温1小时。以TMB为底物显色，1M HCl终止显色反应。在酶标仪上读450/630nm波长的光密度。抗体浓度相同时，HGY与纯化HLA-G蛋白的结合力高于4H84。
图3.抗体竞争性ELISA。用纯化天然HLA-G包被ELISA板，生物素标记的抗-HLA-G单抗4H84与不同剂量的未标记4H84和本发明的抗-HLA-G单抗HGY一起再室温保温1小时。洗板后与抗生物素-HRP结合物室温保温1小时。显色反应用TMB底物液进行，1M HCl终止反应。未加抗体的孔用作对照(100％结合)计算未标记抗体4H84和HGY的竞争百分比。HGY不与生物素标记的4H84竞争，表明HGY的结合位点不同于4H84。图4.免疫印渍抗-HLA-G单抗HGY与4H84的性质比较。用SDS-PAGE分离培养的绒毛癌细胞株JEG-3细胞和妊娠三个月内流产的胎盘组织裂解物(PL)，转移至PVDF膜，分别与HGY和4H84进行印渍反应。对于JEG-3细胞裂解物，两种抗体的印渍均为对应于HLA-G1异构体的、分子量为38KD的单带。从胎盘裂解物来看，4H84可与HLA-G的膜结合和可溶性异构体反应，而HGY可以识别所有的HLA-G蛋白异构体HLA-G1(37～39KD)，G2(～30KD)，G3(～20KD)，G4(～29KD)和G5(～34KD)。图5.抗-HLA-G单克隆抗体HGY对细胞株的免疫印渍分析。将乳腺癌细胞株(MB231和MB468)，卵巢腺癌细胞株(SK-OV-3)，转移的前列腺癌细胞株(LnCap)和绒毛癌细胞株(JEG-3)的培养细胞裂解，SDS-PAGE分离后用抗-HLA-G单抗进行免疫印渍分析。在JEG-3和LnCap细胞株中有一条38KD的对应于HLA-G1的带。在MB231，MB468和SK-OV-3细胞株中，印渍带大于38KD，与高度糖基化的HLA-G分子对应。在MB468中，有一条对应于HLA-G的可溶形式的带，而在MB231，SK-OV-3和LnCap细胞株中有其它异构体出现。
图6.细胞株免疫印渍分析。先用HGY抗体亲和琼脂糖珠对匀浆后的培养细胞裂解液进行免疫沉淀，然后用同一抗体进行免疫印渍分析。1＝MB231，2＝人宫颈上皮癌细胞株(CaSki)，3＝SK-OV-3，4＝LnCap，5＝人胚胎癌株(CaTes-1B)，6＝JEG-3，7＝LCL221(淋巴瘤细胞株)。在JEG-3中鉴定出一条对应于HLA-G1的单带而在HLA-G表达阴性的LCL221细胞株中未发现表达。其它细胞株中HLA-G不同的异构体表达。
图7A原发性乳腺癌免疫印渍分析。先用HGY抗体亲和琼脂糖珠对匀浆后的样品进行免疫沉淀，然后用同一抗体进行免疫印渍分析。样品1-4和7为乳腺癌，5为乳腺纤维瘤，6为正常乳腺组织。乳腺癌1-3有对应于HLA-G可溶异构体的34KD带，表达弱。乳腺癌4有37KD和39KD两条强带，与HLA-G1对应，而乳腺癌7有一分子量较高的区带，与含不同糖基化的HLA-G1的异构体相对应。乳腺纤维瘤和正常组织未见表达。图7B原发性乳腺癌的免疫印渍分析。匀浆样品直接用于免疫印渍分析。抗-HLA-G单克隆抗体为HGY。样品2为强烈表达HLA-G1及其它异构体的原发性乳腺癌。样品5为只表达HLA-G1的乳腺癌。乳腺纤维瘤(3和4行)和正常乳腺组织(1行)无表达。6为妊娠三个月内流产的胎盘组织裂解物，HLA-G1和HLA-G5异构体均有表达。
图8.原发性乳腺癌的组织化学染色切片图9.膀胱移行细胞癌和正常膀胱组织HLA-G组织化学染色切片对比图10.大肠癌和正常肠腺体组织HLA-G组织化学染色切片对比图11.肺鳞癌和正常肺组织HLA-G组织化学染色切片对比图12.乳腺导管癌和正常乳腺导管组织HLA-G组织化学染色切片对比图13.子宫内膜癌和正常子宫组织HLA-G组织化学染色切片对比发明的具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明作进一步说明，所列举的本发明抗体在癌症检测和诊断中的特殊应用范例有助于更好地了解本发明的特点，并非对本发明的限制。
实施例1本发明单克隆抗体的制备本发明的基础是，采用从妊娠三个月内流产的胎盘组织中纯化的天然HLA-G蛋白质，其中含有全部HLA-G转录异构体和糖蛋白异构体，来制备抗HLA-G的单克隆抗体。(见Ishitani等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.853947，1992；Kirszenbaum等，Acad.Sci.U.S.A.914209，1994；Fujii等，J.Immunol.1535516，1994；McMaster等，J.Immunol.1605922，1998；Blastchitze等，Early Pregnancy 567I 2001。)1、HLA-G蛋白的纯化●立即收集三个月内的流产病人手术后的胚胎组织，-80℃冻存备用。
●纯化HLA-G蛋白时，将冰冻组织在冰上解冻并切成小块。用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)悬浮组织，于4℃用Brinkmann Polytron匀浆器进行组织匀浆。
●匀浆液经39,000g，4℃离心10分钟，得到沉淀，用上述的离心和悬浮方式洗涤沉淀3至4次。
●用10倍沉淀物体积的裂解缓冲液重新悬浮沉淀，放入振摇器缓慢混合4℃过夜。
●39,000g，4℃离心30分钟并收集上清。
●采用两个连续的抗体亲和柱对上清液中的HLA-G蛋白进行纯化将纯化的4H84(抗-HLA-G)和BMM1(抗-β2微球蛋白)单克隆抗体分别直接偶联在活化的载体微球上制备成抗体亲和层析柱，然后将上清液上柱，洗涤和洗脱。纯化的HLA-G的纯度通过电泳和Western blot加以检验。10％PAGE和ECL Western blot的结果见附图1。结果表明，经过连续两次抗体亲和层析，包括可溶性异构体在内的HLA-G蛋白的纯度在90％以上，失活的HLA-G蛋白也可以作为免疫原使用。
2、抗纯化天然的HLA-G单克隆抗体的制备●按标准方法对3周龄雌性BALB/c小鼠(Charles River)用上述纯化的HLA-G蛋白进行腹膜下免疫。(见Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，pp139，1988。)即，将纯化的HLA-G蛋白用生理盐水稀释至500ug/ml，首次，与完全弗氏佐剂以1∶1比例混合，然后腹膜下注射免疫。之后，用不完全弗氏佐剂与纯化的HLA-G蛋白1∶1比例混合液免疫动物，间隔3～4周，连续三次。停止免疫1月，最后用不完全弗氏佐剂与纯化的HLA-G蛋白1∶1比例混合液进行1次腹膜下增强免疫。增强免疫后10天，用抗体吸附ELISA方法检测小鼠血清中与纯化后的天然HLA-G蛋白特异性结合抗体的滴度。当小鼠血清抗HLA-G抗体滴度达到一定高度后，选择滴度较高者，按以下方法继续进行；●处死小鼠，用本领域公知技术将其脾细胞与SP2骨髓瘤细胞株融合杂交。然后用有限稀释法和抗体捕获ELISA方法对杂交瘤细胞株细胞进行筛选克隆。筛选出了一个杂交瘤细胞株。
●制备抗体，可用a、杂交瘤细胞株培养基培养细胞株优化培养基410ml(Gibco)，TANGGO 5ml(Sigma)，ITS(Sigma)0.5ml和FBS(Sigma)75ml。培养7～10天直至所有杂交瘤细胞株细胞死亡。400xg离心10分钟除去细胞残骸，上清夜合并。采用蛋白G亲和柱(Sigma)按商品说明书进行抗体的纯化。纯化的抗体经截流分子量为10,000的滤膜(Millipore)4℃ 3000rpm离心30分钟加以浓缩后-80℃冻存备用。
b、或用杂交瘤细胞株细胞种植到BALB/c小鼠腹腔产生腹水用杂交瘤细胞株细胞种植到BALB/c小鼠腹腔产生腹水的方法则是将培养的HGY杂交瘤细胞株细胞洗涤后注射到BALB/c小鼠腹腔。7-10天后收集腹水，-80℃冻存备用。
实施例2本发明单克隆抗体的特性用以上制备的单克隆抗体进行以下实验，证明1、小鼠抗体分型试剂药盒(Amersh)测定，细胞株产生的单抗亚型为IgG3。
2、其对HLA-G具有高度的特异性抗体捕获ELISA测定表明，本发明的抗体与其他类型的HLA I族抗原不存在交叉反应，(见Gosling和Basso，Immunoassay，Butterworth-Hainemann，London，)证实了本发明的抗体对于HLA-G具有高度的特异性。(见表1)表1 HGY抗体的交叉反应
3、其与现有的抗HLA-G单抗比较具有更高的抗原亲和性用抗体捕获ELISA方法对本发明抗体和4H84的两种抗体的对HLA-G蛋白亲和性进行比较了。(见Gosling和Basso，Immunoassay，Butterworth-Hainemann，London，)结果显示本发明抗体的亲和性高于4H84(图2)。
4、本发明单克隆抗体的抗原结合部位在α1区临近糖基化的区域为了确定本发明单克隆抗体的抗原结合部位，设计了与4H84的竞争性免疫测定，(参见Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY，pp567，1988。)单克隆抗体4H84通过用一段对应于HLA-G分子上α1区的第61～83位氨基酸的合成多肽免疫小鼠制备。图3显示，两种抗体与HLA-G分子的不同抗原决定簇相结合。因为本发明抗体能识别所有的HLA-G的蛋白异构体，包括翻译后的糖蛋白的异构体(见图4和图5)。而所有的HLA-G的蛋白异构体都有α1区，并且HLA-G蛋白还生成翻译后的糖蛋白的糖基化也在α1区的86位天冬氨酸上(见Bouteiller PL & Mallet V(1997)J ReprodFertil27-13.McMaster et al(1998)J.Immunol1605922.)，所以本发明抗体的抗原结合部位应在α1区临近糖基化的区域。
5、本发明单克隆抗体可以与同样组织制备物中的所有HLA-G异构体相结合本发明单克隆抗体和4H84都与JEG-3细胞水解物Western印渍上38kD的一条单一区带结合(图4)，进一步证实本发明抗体与4H84一样，对HLA-G具有特异性。只不过对于胎盘水解产物，4H84仅识别HLA-G的可溶形式和膜结合部位(HLA-G1和HLA-G5)，而本发明的单克隆抗体则与同样组织制备物中的所有HLA-G异构体相结合。
6、使用本发明单克隆抗体可以检测不同类型的癌症图5显示出本发明抗体与部分癌细胞株的免疫印迹(Western blot)图谱。绒毛癌细胞株JEG-3和前列腺癌细胞株LnCap具有一38kD的免疫印迹区带。而与乳腺癌细胞株MDA-MB231、MDA-MB468和卵巢癌细胞株SK-OV-3的提取物反应，本发明抗体产生多条HLA-G异构体的区带。这些数据显示，不同类型的癌症可能表达出不同的HLA-G异构体，对不同类型癌症的各种表达产物，本发明抗体都能够加以检测。
实施例3细胞株和乳腺癌样品中HLA-G的免疫印渍检测导言经典的人白细胞抗原(HLA)I族表达的下调是肿瘤生物学中的常见现象。这种经典的HLAI族表达的改变可能使肿瘤细胞逃避宿主毒性淋巴细胞的免疫监控。因为NK细胞能水解经典的HLA I族缺乏的细胞，上述改变可使人白细胞抗原(HLA)I族表达的下调的肿瘤细胞受到NK细胞的攻击。Garrido等，Immunology Today 1889，1997。已经发现，作为一种非经典的I族抗原，HLA-G的免疫学功能之一就是抑制NK细胞的活性。因此肿瘤细胞如果表达HLA-G，便可使其免遭NK的消灭。为了验证这一假说，我们采用针对HLA-G的特异单克隆抗体(HGY)的免疫印渍方法对5种人癌细胞株和原发性乳腺癌组织进行了调查。
材料和方法人乳腺癌和正常乳腺组织来自外科手术病人。组织样品采集后立即放-80C存放直至测定。人乳腺癌细胞株(MDA-MB-231)、人宫颈上皮癌细胞株(CASK1)、人转移性前列腺癌株(LNCAP，FGC)、人卵巢腺癌株(SK-OV-3)和人胚胎癌株(CATES-1B)购自ATCC(Rockville，Maryland，USA)。根据ATCC说明书用不同的培养基在培养皿中培养细胞。
匀浆后的原发性乳腺癌组织和正常乳腺组织，以及癌细胞株离心沉淀用1ml裂解液裂解。裂解液含0.5％NP40，0.15M NaCl，5mM EDTA，50mM Tris-HCl，pH7.2和1.0mMPMSF。将裂解物与HGY抗体亲和琼脂糖珠混合，4℃过夜进行免疫沉淀处理。之后用免疫沉淀洗涤缓冲液(0.1MPBS，0.05％NP-40和0.02％NaN3)洗涤沉淀5次(见Sigma用抗体偶联活化的琼脂糖珠的说明书，1966)。然后将样品变性，12％SDS-PAGE分离，室温3小时转移至PVDA膜上。用5％牛奶封闭膜，与HGY抗体室温下保温1小时，再与羊抗鼠IgG-HRP复合物(1∶2000)保温1小时。用荧光免疫印渍法进行分析(AmershamArlington，Heights，IL)。部分匀浆后的原发性乳腺癌组织的水解物不经免疫沉淀直接用荧光免疫印渍法进行分析。
结果JEG-3是绒毛癌细胞株，同时表达HLA-G和经典的I族抗原(HLA-A，B和C)分子。LCL-211为淋巴瘤细胞株，只表达Ia族抗原而不表达HLA-G。在该研究中，JEG-3细胞水解物被用作阳性对照，LCL-221水解物则用作阴性对照。(Kovalts等，Science 248220，1990。)在JEG-3中检测到一条相当于HLA-G1(38kDa)的蛋白单带，LCL 211则没有检测到。其它所有细胞株水解物中都检测出分子量对应于HLA-G1和其它异构体的蛋白质，其种类依不同的细胞株而异(图6)。对于乳腺癌组织水解物，一部分先用HGY抗体偶联的亲和珠进行了免疫沉淀处理(图7A)，另一部分则直接用SDS-PAGE分离(图7B)。正常乳腺组织用作阴性对照，妊娠三个月流产的胎盘组织用作阳性对照。直接和间接免疫印渍试验均未在正常乳腺组织和乳腺纤维瘤中检测出HLA-G蛋白，但在不同的乳腺癌症病人中则鉴定出各种HLA-G的蛋白异构体。
讨论采用本发明的抗HLA-G单克隆抗体HGY的以上研究数据显示，癌细胞株和原发性乳腺癌都表达HLA-G蛋白。结果表明，除了JEG-3绒毛癌细胞株和正常胚胎组织外，某些类型的癌症也要表达HLA-G。HLA-G在癌细胞异常表达提示HLA-G可能参与了肿瘤细胞的逃逸机制，尤其是使其逃避NK细胞的水解。完全阐明这一假说有待更为深入的研究。
实施例4乳腺癌和恶性乳腺疾病HLA-G的免疫组化分析采用免疫印渍方法我们已经发现，在原发性乳腺癌组织中有HLA-G的表达。本研究的目的就是采用组织化学的方法检验乳腺肿瘤中的HLA-G蛋白表达并了解表达与组织学结果之间可能存在的关系。
材料和方法人乳腺癌和正常乳腺组织来自外科手术病人。组织样品用4％的多聚甲醛固定，石蜡包埋。对22份恶变的乳腺肿瘤进行了研究。按分化程度将肿瘤分为3组I级(n＝1)，II级(n＝8)和III级(n＝13)。另有正常乳腺组织(n＝3)和乳腺纤维瘤组织(n＝2)。
免疫组化分析时，对石蜡包埋块切片，按标准操作进行直接免疫过氧化物酶染色。(Bullock GR，Petrusz PTechniques in Immunocytochemistry，Academic Press，New Tork，1982。)切片与HGY单抗于4℃保温过夜。此后，内源性过氧化物酶活性和非特异蛋白结合位点分别用1％过氧化氢处理及10％正常山羊血清的PBS溶液封闭30分钟。然后用PBS涮洗切片，与1∶2000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP(Sigma)室温保温1小时。PBS洗片，用二氨基联苯胺(Sigma)使结合抗体显色5分钟。此外，用100ug/ml的纯化的HLA-G蛋白与HGY抗体4℃保温过夜，目的是让HLA-G蛋白预先吸附抗HLA-G单抗，而作为特异性质控对照。特异性质控对照还包括用PBS或正常小鼠IgG(Sigma公司产品)替换抗体。
结果在I级癌组织中HLA-G的免疫反应较弱，相反在II级肿瘤中HLA-G免疫反应性在中等和强反应之间。13例III级样品中有6例表现出中等至强度的HLA-G免疫反应性，其余7例的反应性为无或弱。在正常乳腺组织以及乳腺纤维瘤组织则未检测到HLA-G蛋白。图8为阳性染色示例。
讨论以上结果表明68％的乳腺癌有不同程度的HLA-G蛋白的表达。HLA-G表达与癌细胞分化之间有正相关的趋势。
实施例5癌症常见类型的HLA-G免疫组化测定前已发现，在部分原发性乳腺癌病人中有HLA-G的表达，而且表达与组织学类型间之间存在相关的趋势。本研究的目的是，考察其它类型的癌症是否也有HLA-G的异常表达以及这种表达是否能用于癌症的病理诊断和预后。
材料和方法包括各种常见癌症的1007个石蜡包埋切片。第一抗体为抗-HLA-G单抗HGY，第二抗体为EnvisionTM(购自DAKO)。用取自流产手术的正常胚胎组织的石蜡切片作为阳性对照，各种相应的正常组织用作阴性对照。
结果将染色的切片分为4类无表达(-，无阳性染色的癌细胞)，低表达(+，阳性染色癌细胞＜25％)，中度表达(++，阳性染色癌细胞在25％至50％之间)，强表达(+++，阳性染色癌细胞＞50％)。根据这种分类的结果列在表2中。本研究观察到的所有癌症都有HLA-G蛋白的表达。阳性染色百分比在42～100％之间。而在相应的正常组织则未检测到HLA-G蛋白的表达(图9)。同时，结果还证明HLA-G阳性表达与乳腺癌，肺癌，食道癌，胃癌，直结肠癌，子宫癌，膀胱癌等癌症的细胞转移和侵润有显著相关。分析结果见表3。本研究的其它几种癌症因样本太小未能进行统计学分析。
表2HLA-G在各种常见类型的恶性肿瘤的表达
表3。HLA-G免疫组化的临床检测结果的临床意义
讨论本研究应用本发明的抗-HLA-G单克隆抗体HGY首次发现，HLA-G的异常表达是肿瘤生物学中的一个广泛存在的现象。本研究的结果还强烈提示，用免疫组化方法测定HLA-G可成为常见各类癌症诊断和预后的新肿瘤标志物。又因为HLA-G在癌症的表达参与了肿瘤的免疫逃逸，而HLA-G的表达又受各种免疫分子的调节；如干扰素能增强HLA-G的表达。对HLA-G高表达的癌症病人，用干扰素α-治疗可能会适得其反(参见Wagner SN，Rebmann V，Willers CP，Grosse-Wilde H，Goos M._Expression analysisof classic and non-classic HLA molecules before interferon alfa-2b treatment ofmelanoma.Lancet.2000 Jul 15；356(9225)220-1.以及Ugurel S，Rebmann V，FerroneS，Tilgen W，Grosse-Wilde H，Reinhold U.Soluble human leukocyte antigen--G serumlevel is elevated in melanoma patients and is further increased byinterferon-alpha immunotherapy.Cancer.2001 Jul 15；92(2)369-76.)，因此，测定HLA-G有可能成为指导肿瘤个性化生物治疗的指标。
发明总结本发明与用纯化的天然HLA-G蛋白免疫小鼠制取抗-HLA-G单克隆抗体有关。按本发明方法，HLA-G抗体与HLA-G的选择性结合比与抗原HLA-A2，HLA-B4，HLA-C或混合的白细胞制备液的结合强1000倍以上。不论HLA-G分子的来源如何(胎盘或肿瘤)本发明抗体可以检测HLA-G蛋白的所有异构体。本发明抗体与HLA-G的结合部位不同于其它常用的抗体，如4H84。采用本发明抗体，已在大多数癌症中检测到了HLA-G的异常表达。对常见类型的癌症，采用本发明的免疫组化及其它免疫测定方法.其测定结果具有临床癌症诊断和预后的应用价值。
实施例6癌症诊断试剂盒的制备由以上的研究结果，我们研制了HLA-G免疫组化试剂盒，由于本发明的抗HLA-G单克隆抗体具有高度特异性和灵敏性，并且理化性质稳定，可以按照标准方法方便地制备成为癌症诊断试剂盒。
以下是用本发明抗HLA-G单克隆抗体制备的一种诊断试剂盒的具体组成HGY抗HLA-G抗体 18ulHGY抗HLA-G抗体稀释液 2.5ml兔抗鼠抗体-辣根过氧化酶复合物2.5ml3％过氧化氢 10ml20X磷酸缓冲液50ml5X柠檬酸缓冲液 50ml色原底物溶液(DAB)0.1ml色原底物缓冲液 2.5ml阳性对照片 1张检定原理该试剂盒是应用一种特异性很高的抗HLA-G单克隆抗体(HGY抗HLA-G抗体)结合在肿瘤组织切片上的HLA-G抗原，然后采用兔抗鼠抗体-辣根过氧化酶复合物结合抗HLA-G抗体。辣根过氧化酶催化色原底物(DAB)显色来检测病理组织切片上有无HLA-G的表达。
权利要求
1.一种单克隆抗体，其特征是该单克隆抗体是抗人类白细胞抗原G单克隆抗体，即抗HLA-G单克隆抗体，属IgG3亚型。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征是该单克隆抗体能够与7种HLA-G异构体发生抗原抗体反应。
3.一种杂交瘤细胞株，其特征是该杂交瘤细胞株能够产生属IgG3亚型的抗HLA-G单克隆抗体
4.根据权利要求3所述的杂交瘤细胞株，其特征是该杂交瘤细胞株能够产生可与7种HLA-G异构体发生抗原抗体反应的单克隆抗体。
5.根据权利要求3或4所述的杂交瘤细胞株，其特征是该杂交瘤细胞株是由中国典型培养物保藏中心保藏的保藏编号为CCTCC NO.C200416的杂交瘤细胞株细胞株。
6.一种权利要求3、4、5任意一项所述的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
7.一种恶性肿瘤的免疫检测方法，其特征是该方法使用至少一种权利要求1、2或6所述的单克隆抗体来检测。
8.根据权利要求6所述的免疫检测方法，其特征是该方法使用权利要求1、2或6所述的任意一种单克隆抗体来检测。
9.根据权利要求7或8所述的免疫检测方法，其特征是用该方法诊断恶性肿瘤。
10.根据权利要求7或8所述的免疫检测方法，其特征是用于评价恶性肿瘤发展、转移及预后。
11.根据权利要求7或8所述的免疫检测方法，其特征是用于指导恶性肿瘤的治疗。
12.根据权利要求7-11任意一项所述的免疫检测方法，其特征是该方法使用ELISA技术进行的。
13.根据权利要求7-11任意一项所述的免疫检测方法，其特征是该方法使用免疫印渍技术进行的。
14.一种试剂盒，其特征是含有至少一种如权利要求1、2或6所述的单克隆抗体。
15.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征是含有如权利要求1、2或6所述的任意一种单克隆抗体。
16.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其特征是用于诊断恶性肿瘤。
17.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其特征是用于评价恶性肿瘤发展、转移及预后。
18.根据权利要求14或15所述的试剂盒，其特征是用于指导癌症的治疗。
19.根据权利要求14-18任意一项所述的试剂盒，其特征是所述试剂盒采用ELISA技术。
20.根据权利要求14-18任意一项所述的试剂盒，其特征是所述试剂盒采用免疫印渍技术。
全文摘要
本发明公开了一种单克隆抗体，涉及一种抗人类白细胞抗原G(HLA－G)的单克隆抗体及其分泌该抗体的杂交瘤细胞株，本发明的目的是提供一种新的单克隆抗体，命名为HGY，该单克隆抗体是抗人类白细胞抗原G单克隆抗体，属IgG3亚型，该单克隆抗体能够与7种HLA－G异构体发生抗原抗体反应；还提供一种分泌所述单克隆抗体的杂交瘤细胞株。由于本发明的单克隆抗体对于HLA－G具有高度的特异性，并且与所有HLA－G异构体相结合，因此在癌症的病理检测中具有很高的灵敏性。同时本发明还公开了利用该抗体诊断恶性肿瘤的方法，以及利用该抗体制备免疫组化试剂盒及其应用。
文档编号G01N33/577GK1718588SQ200410040919
公开日2006年1月11日 申请日期2004年10月26日 优先权日2004年10月26日
发明者叶尚勉 申请人:四川新创生物科技有限公司
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