专利名称：一种微囊藻毒素-lr单抗免疫亲和柱的制备和使用方法
技术领域：
一种微囊藻毒素-LR单抗免疫亲和柱的制备和使用方法，属于免疫亲和层析 及微囊藻毒素检测技术领域。
背景技术：
蓝藻是地球上的最古老生物之一，水体的富营养化有利于蓝藻的繁殖和生 长。水体中的蓝藻短时间内大量繁殖并聚集的生态异常现象称为水华(也称湖 靛)。最近的调查表明，亚太地区54。/。的湖泊富营养化，欧洲、非洲、北美洲和 南美洲的比例分别是53%， 28%， 48%和41%，我国则是60%。近年来我国几大 淡水湖泊都有蓝藻水华的大量爆发。蓝藻水华出现时，水面被厚厚的蓝绿色湖 靛所覆盖，甚至在岸边大量堆积。在藻体大量死亡分解的过程中，不但散发恶 臭，破坏景观；同时大量消耗水中溶解氧，使鱼类窒息死亡；尤其是蓝藻能释 放生物毒素——微囊藻毒素(MC)，这些类次级代谢产物严重�：θ死嗪推渌� 生物的安全。其中微囊藻毒素-LR (MC-LR)
蓝藻水华产生的MC毒性极强，1996年巴西发生透析液受MC污染的事故， 造成50多人死亡。MC还是潜在的致癌因子和肿瘤促进因子。MC引起野生动 物和家畜中毒甚至死亡的事件在liJ:界各地都有报道。目前对蓝藻水华的发生及 MC的危害尚没有有效的控制方法，建立有效的检测方法和制定水体、饮用水和 一些食品的MC限制标准实为可行的预防措施。考虑到饮水安全，WHO和我国 GB 5749-2006生活饮用水卫生标准规定饮用水中MC-LR的限量值为l吗/L。
免疫亲和柱(IAC)是利用免疫亲和层析原理制作的分离分析预装柱。由于 抗体与抗原作用具有高度专一性，因此通过IAC净化能够去除绝大部分杂质。 IAC技术已日渐成熟，在与藻毒素类似的真菌毒素的检测中已广泛应用，其中 黄曲霉毒素的免疫亲和层析已被列入国标中(GB18980-2003和GB18979-2003)。
由于蓝藻样品成份复杂，其中的MC含量低(质量百分比在万分之一左右)， 如果在前处理过程中杂质残留多，在后续定量分析中，能严重影响结果的准确 性。我们通过蓝藻样品的溶剂提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC净化，然后 进液质联用仪进行定量测定，能得到准确的结果。此文建立的方法能应用于水 样、其它藻类及类似的生物样品中MC的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种MC-LR单抗IAC的制备和使用方法，所研制的 IAC是将MC-LR单抗固定于柱中，通过蓝藻样品的溶剂提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC净化，然后进液质联用仪进行定量测定，能得到准确的结果。本 发明建立的方法能应用于水样、其它藻类及类似的生物样品中MC的检测。 本发明的技术方案 一种MC-LR单抗IAC的制备方法
(1) 用水溶性碳二亚胺法制备MC-LR与牛血清白蛋白BSA偶联物，以下 简称MC-LR-BSA，用MC-LR-BSA作为免疫原；用混合酸酐法制备MC-LR与 载体蛋白OVA的偶联物，以下简称MC-LR-OVA，用MC-LR-OVA作为检测抗 原；通过免疫方法获得MC-LR单抗；
(2) 琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化用溴化氰法活化Sepharose 4B，活 化过程如下
(a) 取10 mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30 mL水分两次洗涤后 抽千，加少量的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03洗涤，立即转入100 mL烧杯中， 冰浴下缓慢搅拌；
(b) 在通风橱内称取1 g溴化氰，加水10 mL溶解，然后分批加入Sepharose 4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2 mol/LNaOH，使pH保持在10.5， 待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；
(c) 将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗 成中性，再迅速以150 mL冷的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03抽洗；
(3) MC-LR单抗IAC的制备
MC-LR单抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到亲和吸附剂，填入柱中制 得MC-LR单抗免疫亲和柱，操作步骤如下
(d) 偶联
将上述制备纯化好的MC-LR单抗置于pH 8.3含有0.5 M NaCl的0.1M NaHC03的偶联缓冲液中透析12 h;将上述活化好的Sepharose 4B置于砂芯漏斗 中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR单抗溶液中进行偶联，紫外扫 描监控偶联过程；用5倍以上MC-LR单抗溶液体积的偶联缓冲液洗去未偶联的 MC-LR单抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋 白质的含量计算未偶联上MC-LR单抗的量；
(e) 封闭活性基团
将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭Sepharose 4B中多余的活性基团；
(f) 洗涤
步骤(e)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH 4.0 的含0.5 M NaCl的0.1 M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复 合物体积的PBS洗涤两次；(g) 防腐处理
步骤(f)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有 1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在 4'C密闭保存；
(h) 装柱
将歩骤(f)或(g)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固 相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，即制成MC-LR单抗IAC;
(i) 保存
琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的MC-LR单抗IAC切勿冷冻，保存在4°C 的冰箱内；
(j) IAC的再生
IAC使用后，用4-10个柱床体积pH 8.5含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓 冲液，和用4-10个柱床体积pH 4.5含0.5 M NaCl的0.1 M醋酸钠缓冲液轮流清 洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4'C冰箱内供下次使用。
制备的MC-LR单抗IAC的使用方法
(1) 采集的蓝藻水华经晾晒干燥后，粉碎并过100目筛，干燥藻粉室温干 燥保存；
(2) 蓝藻样品前处理
取O.l g干藻粉加20 mL 80%甲醇水溶液室温下置于超声波细胞破碎仪中 提取30min， 3000 rpm离心10min，收集上层清液，沉淀再重复抽提两次，合 并上清液并过滤，滤液减压浓縮至少于1 mL，加10mL去离子水稀释；SPE柱 先分别用2mL纯甲醇、2mL去离子水预处理；稀释后的滤液过SPE柱富集； 再分别用5 mL去离子水、5 mL 10%的甲醇水溶液冲洗SPE柱后用5 mL纯甲醇 洗脱柱上藻毒素；IAC使用前先用2 mL纯甲醇、2 mL去离子水预处理；洗脱 液用甲醇定容至5mL，取10pL，力卩l mL去离子水后过IAC; IAC用2 mL蒸 馏水洗后用5 mL纯甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，残留物用lmL甲醇溶解后进 LC-MS分析；
(3) 仪器检测条件
流动相A:以体积计，含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液；流动相B:以体积 计，含0.1%甲酸的80%乙腈水溶液；线性梯度洗脱程序0 15min为20。/。
50% B; 15 20min为50% 100%B; 20 30 min为100% 20%B，其余为A; 色谱柱为SunFire C18柱，150 mmx2.1 mm, 5 pm，柱温30°C,流速0.3 mL/min， 进样量10iiL，紫外检测器200-400 nm;
电离方式电喷雾电离源，正离子模式ESI+;离子源温度120°C;脱溶剂
气N2温度300'C，气体流速300L/h;喷雾电压4.5kV，锥孔电压45V;扫描范围m/z300 1200;质谱条件根据实验过程进行优化。
本发明的有益效果由于蓝藻样品成份复杂，其中的MC含量低(质量百
分比在万分之一左右)，如果在前处理过程中杂质残留多，在后续定量分析中，
能严重影响结果的准确性。我们通过蓝藻样品的溶剂提取、固相萃取柱富集、IAC 净化，然后进液质联用仪进行定量测定，能得到MC-LR和MC-RR含量的准确 结果。只用SPE净化，不用IAC净化，杂质会对测定产生严重干扰，而影响测 定结果的准确性。本发明建立的方法能应用于水样、其它藻类及类似的生物样 品中MC的检测。
图1 MC-RR和MC-LR的总离子流色谱图。std为MC-RR和MC-LR的混 合标样，1为SPE富集藻样，2为SPE富集后IAC净化藻样。
图2藻样净化后MC-RR的选择离子(SIR)色谱图(样品与图l相对应)。 图3藻样净化后MC-LR的选择离子(SIR)色谱图(样品与图l相对应)。
具体实施例方式
实施例l: MC-LR单抗的制备 1、完全抗原的合成
(1) MC-LR-BSA免疫原的合成
完全抗原MC-LR-BSA的合成采用水溶性碳二亚胺法，利用l-乙基-3 (3-二甲氨丙基)碳二亚胺(EDC)作为"桥联剂"，使MC-LR的羧基(-COOH)与 EDC反应生成中间产物，再与BSA蛋白分子上的氨基反应，制成完全抗原 MC-LR-BSA偶联物作为免疫原。合成方法如下
0.5 mg MC-LR溶于0.5 mL甲醇，分为0.25 mL的两等份，通氮气，在35。C 下挥发至干。 一份含有0.25 mg MC-LR的残余物溶于1 mL PBS (pH7.4)缓冲 液中，加入5mgEDC，振荡至完全溶解，用0.1M盐酸溶液将pH值调至5， 室温下缓慢搅拌5min。将1.4mgBSA溶于3mLPBS缓冲液中，振荡至完全溶 解，然后逐滴加入上述MC-LR溶液中，在室温下保持lh。然后4。C下过夜。将 混合物于4。C下在0.1 mol/L pH7.4的PBS中透析72 h，每隔6 h换透析液1次。 冷冻干燥后于-2(TC保存。
(2) MC-LR-OVA检测抗原的合成
用混合酸酐法完成MC-LR与载体蛋白OVA的交联，合成MC-LR-OVA完 全抗原作为检测抗原。合成方法如下
一份含有0.25 mg MC-LR的残余物加入0.5 mL 1,4-dioxane (二噁烷)，振 荡使其溶解，再加入7iaL氯甲酸异丁酯和12^iL三丁胺，将此混合物轻微振荡 然后在4'C下保持30min。 0.9 mg OVA溶于3 mL碳酸氢钠缓冲液(pH 9.0)中。 将上述MC-LR溶液逐滴加入到溶解的OVA中，并于4匸轻微搅拌4h，整个过
7程维持pH在9.0。然后，将混合物于fC下在0.1 mol/LpH7.4的PBS中透析72 h，每隔6h换透析液l次。冷冻干燥后于-20。C保存。
2、通过一般的单抗制备过程制备MC-LR单抗
实施例2:琼脂糖凝胶Sepharose 4B的活化
用溴化氰法活化琼脂糖凝胶Sepharose 4B。溴化氰法活化效果好、偶联率高、 对抗体影响小，活化过程如下
(1) 取10 mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30 mL水分两次洗涤后 抽干，加少量的O.l mol/LpH8.3的NaHC03洗涤，立即转入100 mL烧杯中， 冰浴下缓慢搅拌。
(2) 在通风橱内称取1 g溴化氰，加水10 mL溶解，然后分批倒入Sepharose 4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/LNaOH，使pH保持在10.5 左右。待溴化氰完全反应完全，pH基本保持不变，即可停止搅拌。
(3) 将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗 成中性，再迅速以150 mL冷的0.1 mol/L pH 8.3的NaHC03抽洗。
实施例3、 MC-LR单抗IAC的制备
1 、 MC-LR单抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B亲和吸附剂的制备
制备MC-LR单抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B亲和吸附剂的操作步骤如下
(1) 偶联
将上述制备纯化好的MC-LR单抗置于pH 8.3含有0.5 M NaCl的0.1M NaHC03缓冲液的偶联缓冲液中透析12 h。将上述活化好的Sepharose 4B凝胶置 于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR单抗溶液中进行偶 联，紫外扫描监控偶联过程。用5倍体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的抗 MC-LR单抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物。收集全部的洗脱液，通过测定其蛋 白质的含量计算未偶联上MC-LR单抗的量。
(2) 封闭活性基团
将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭琼脂糖凝胶中多余的活性基团。
(3) 洗涤
歩骤(2)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物用5倍偶联复合物体积的pH 4.0 的含0.5 M NaCl的0.1 M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH 8.0的含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次。然后用5倍偶联复 合物体积的PBS洗涤两次。
(4) 防腐处理
步骤(3)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有 1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在
84。C中密闭保存。
2、柱子的填充、保存与再生
(5) 装柱
将步骤(3)或(4)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固 相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，即制成MC-LR单抗IAC。
(6) 保存
琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的MC-LR单抗IAC切勿冷冻，保存在4°C
的冰箱内。
(7) 柱的再生
柱使用后，用4-10个柱床体积pH8.5含0.5 M NaCl的0.1 M Tris-HCl缓冲 液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5 MNaCl的0.1 M醋酸钠缓冲液轮流清洗 IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4X:冰箱内供下次使用。
实施例4:蓝藻样品中MC的检测
1、 蓝藻样品的采集
蓝藻样品是取自太湖的蓝藻水华，取样时间是2007年6月上旬。采集的蓝 藻水华经晾晒干燥后，粉碎并过100目筛，干燥藻粉室温干燥保存。
2、 蓝藻样品前处理
取O.l g干藻粉加20 mL 80%甲醇水溶液室温下置于超声波细胞破碎仪中 提取30min， 3000 rpm离心10min，收集上层清液，沉淀再抽提两次(条件同 前)，合并上清液并过滤。滤液减压浓縮至少于l mL，加10mL去离子水后， 过SPE柱富集毒素(过柱前SPE柱分别用2mL纯甲醇、2 mL去离子水活化处 理)。待样品全部吸附，分别以5 mL去离子水、5 mL 10%的甲醇水溶液冲洗SPE 柱后用5 mL纯甲醇洗脱柱上毒素。洗脱液用甲醇定容至5 mL，取10 加1 mL 去离子水后过IAC (使用前柱子用2mL纯甲醇、2mL去离子水活化)，IAC用 2mL蒸馏水洗后用5 mL纯甲醇洗脱。洗脱液减压蒸干，残留物用lmL甲醇溶 解后进LC-MS分析。
3、 仪器检测条件
流动相A: 20%乙腈水溶液(含0.1%甲酸)，流动相B: 80%乙腈水溶液(含 0.1%甲酸)。线性梯度洗脱程序0 15min: 20°/。 50%B， 15 20min: 50% 100%B， 20 30min: 100% 20%B，其余为A。色谱柱为SunFire C18柱(150 mmx2.1 mm, 5,)，柱温30 °C,流速0.3 mL/min，进样量10 jiL，紫外-检测 器200-400 nm。
电离方式电喷雾电离源，正离子模式(ESI+);离子源温度12(TC;脱溶
剂气(N2)温度30(TC，气体流速300L/h;喷雾电压4.5kV，锥孔电压45V; 扫描范围m/z300 1200。质谱条件根据实验过程进行优化。4、 SPE柱富集与IAC净化效果比较
图1 3分别为MC-RR和MC-LR标样及SPE和IAC净化藻样的总离子流 色谱图、SPE和IAC净化藻样中MC-RR和MC-LR的SIR色谱图。从图1中可 以看出，在总离子流色谱图上，MC-RR和MC-LR能得到较好的分离。藻样提 取液只经过SPE柱富集(样品l)，会保留大量杂质，其中对MC-LR的干扰较 大。经过IAC进一歩净化(样品2)，能除去绝大部分杂质。
在选择离子(SIR)模式下，MC-RR能得到较好的分离(图2)。藻样提取 液只经过SPE柱富集(样品1)，虽然仍保留有杂质，但对MC-RR的干扰不大。 经过IAC进一步净化(样品2)，在SIR模式下色谱图上基本不显示杂质。定量 结果也表明，样品1和2的结果基本一致，说明MC-RR的测定只用SPE柱富 集就能得到准确的结果。
但从图3中可以看出，SIR模式下，只经过SPE柱富集(样品l)，杂质对 MC-LR的干扰严重，经过IAC进一步净化(样品2)，基本上能除去杂质。定量 结果也显示，样品1和2的结果偏离很大，并且样品l的重复性较差，说明杂 质能显著影响MC-LR的测定结果。
5、 实际藻样的检测
采用建立的方法，对2007年6月上旬收集的太湖不同地区的蓝藻干粉样品 进行检测。结果显示，在所有样品中均检出MC-RR和MC-LR两种藻毒素，干 重含量分别在0.212 0.331mg/g， 0.076 0.098 mg/g。
权利要求
1、一种微囊藻毒素-LR单抗免疫亲和柱的制备方法，其特征是(1)用水溶性碳二亚胺法制备微囊藻毒素-LR与牛血清白蛋白BSA偶联物，以下简称MC-LR-BSA，微囊藻毒素-LR简称MC-LR，用MC-LR-BSA作为免疫原，用混合酸酐法制备MC-LR与载体蛋白OVA的偶联物，以下简称MC-LR-OVA，用MC-LR-OVA作为检测抗原，通过免疫方法获得MC-LR单抗；(2)琼脂糖凝胶Sepharose4B的活化用溴化氰法活化琼脂糖凝胶Sepharose4B，活化过程如下(a)取10mL Sepharose 4B放在布氏漏斗中抽干，用30mL水分两次洗涤后抽干，加少量的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3洗涤，立即转入100mL烧杯中，冰浴下缓慢搅拌；(b)在通风橱内称取1g溴化氰，加水10mL溶解，然后分批加入Sepharose4B中，边加边搅拌，同时测pH值，通过滴加2mol/L NaOH，使pH保持在10.5，待溴化氰反应完全，pH保持不变，停止搅拌；(c)将活化的Sepharose 4B加入小冰块，迅速倒入布氏漏斗中，以冰水抽洗成中性，再迅速以150mL冷的0.1mol/L pH8.3的NaHCO3抽洗；(3)MC-LR单抗免疫亲和柱的制备将MC-LR单抗与琼脂糖凝胶Sepharose 4B偶联得到的亲和吸附剂，填充入柱中得到MC-LR单抗免疫亲和柱，简称IAC，操作步骤如下(d)偶联将上述制备纯化好的MC-LR单抗置于pH8.3含有0.5M NaCl的0.1MNaHCO3的偶联缓冲液中透析12h；将上述活化好的Sepharose4B置于砂芯漏斗中用偶联缓冲液快速抽洗，然后迅速倒入MC-LR单抗溶液中进行偶联，紫外扫描监控偶联过程；用5倍MC-LR单抗溶液体积以上的偶联缓冲液洗去未偶联的MC-LR单抗，得到琼脂糖-抗体偶联复合物；收集全部的洗脱液，通过测定其蛋白质的含量计算未偶联上MC-LR单抗的量；(e)封闭活性基团将琼脂糖-抗体偶联复合物转入5倍体积pH8.0的含0.5M NaCl的0.1MTris-HCl缓冲液中，保持2h，以封闭Sepharose4B中多余的活性基团；(f)洗涤步骤(e)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物依次用5倍偶联复合物体积的pH4.0的含0.5M NaCl的0.1M醋酸缓冲液和5倍偶联复合物体积的pH8.0的含0.5MNaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液洗涤，此洗涤过程重复三次；然后用5倍偶联复合物体积的PBS洗涤两次；(g)防腐处理步骤(f)制备好的琼脂糖-抗体偶联复合物如需放置一段时间，应使用含有1/10000叠氮钠的PBS缓冲液浸泡，然后沥去多余的溶液后放入包装袋或瓶中在4℃密闭保存；(h)装柱将步骤(f)或(g)得到的琼脂糖-抗体偶联复合物填充入2mL或5mL固相萃取空柱管中，在负压下用PBS将凝胶压紧，即制成MC-LR单抗IAC；(i)保存琼脂糖-抗体偶联复合物或填充好的MC-LR单抗IAC切勿冷冻，保存在4℃的冰箱内；(j)IAC的再生IAC使用后，用4-10个柱床体积pH8.5含0.5M NaCl的0.1M Tris-HCl缓冲液，和用4-10个柱床体积pH4.5含0.5MNaCl的0.1M醋酸钠缓冲液轮流清洗IAC两次，再用PBS缓冲液充分平衡IAC后保存在4℃冰箱内供下次使用。
2、权利要求1所述方法制备的MC-LR单抗IAC的使用方法，其特征是(1) 采集的蓝藻水华经晾晒干燥后，粉碎并过100目筛，干燥藻粉室温干 燥保存；(2) 蓝藻样品前处理取O.l g千藻粉加20 mL 80%甲醇水溶液室温下置于超声波细胞破碎仪中 提取30min， 3000 rpm离心10 min，收集上层清液，沉淀再重复抽提两次，合 并上清液并过滤，滤液减压浓縮至少于1 mL，加10mL去离子水稀释；SPE柱 先分别用2mL纯甲醇、2mL去离子水预处理；稀释后的滤液过SPE柱富集； 再分别用5 mL去离子水、5 mL 10%的甲醇水溶液冲洗SPE柱后用5 mL纯甲醇 洗脱柱上藻毒素；IAC使用前先用2 mL纯甲醇、2 mL去离子水预处理；洗脱 液用甲醇定容至5mL，取10pL，力tU mL去离子水后过IAC; IAC用2 mL蒸 馏水洗后用5 mL纯甲醇洗脱，洗脱液减压蒸干，残留物用lmL甲醇溶解后进 LC-MS分析。
全文摘要
一种微囊藻毒素-LR(MC-LR)单抗免疫亲和柱(IAC)的制备和使用方法，属于免疫亲和层析及微囊藻毒素(MC)检测技术领域。本发明所研制的IAC是将MC-LR单抗固定于柱中，通过蓝藻样品的溶剂提取、固相萃取(SPE)柱富集、IAC净化，然后进液质联用仪进行定量测定，能得到MC-LR和MC-RR含量的准确结果。只用SPE净化，不用IAC净化，杂质会对测定产生严重干扰，而影响测定结果的准确性。本发明建立的方法能应用于水样、其它藻类及类似的生物样品中MC的检测。
文档编号G01N30/00GK101446576SQ20081024251
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月29日 优先权日2008年12月29日
发明者坚 汤, 肖付刚, 蔡建荣, 赵春城, 赵晓联 申请人:江苏省苏微微生物研究有限公司
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