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专利名称：血清或血浆样品稀释液及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及酶联免疫吸附测定(ELISA)中，血清或血浆样品的处理、稀释、上样，特别应用于夹心ELISA检测人血清(血浆)中脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)的含量。
背景技术：
目前，大部分ELISA系统中的包被、酶标抗体是用重组表达蛋白作为抗原，免疫动物产生的。若重组蛋白大量表达，形成包涵体沉淀，须使用变性剂将其完全变性溶解后再免疫动物。而变性蛋白与天然蛋白的构象有一定差别，其免疫动物产生的抗体可能很难与天然蛋白结合，从而影响ELISA建立。
Acrp30是脂肪细胞特异性分泌的血浆蛋白，1995年，Scherer等首先报道了Acrp30的存在及其cDNA序列。人Acrp30基因位于3q27，其编码蛋白含有247个氨基酸，单体分子由4个结构域组成，从N端到C端依次为信号肽序列、非同源序列、胶原样结构域、球状结构域，C端球状区(110～247氨基酸)占主要部分。Acrp30翻译后可发生糖基化，是一种糖蛋白，其球状区三聚体结构与肿瘤坏死因子(TNF)家族具有极强的同源性。Acrp30在血浆中有两种形态，即低分子量同源三聚体(LMW)和高分子量复合体(HMW)。Acrp30寡聚体通过39位半胱氨酸(Cys-39)上的二硫键连接，Cys-39突变造成胶原区蛋白剪切形成三聚体。最近Tsao等的研究表明循环血液中大部分Acrp30(＞80％)是以HMW形式存在，少部分为六聚体(＜10％)和三聚体(＜10％)。
Acrp30的生理学功能包括调节糖、脂代谢，提高胰岛素敏感性，抗动脉粥样硬化等。新近的研究表明Acrp30有抗炎保肝的效果，有可能成为一种新的肝病治疗药物。目前，人血清(血浆)中脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)的含量测定，使用的ELISA试剂(Linco Research，Inc.等)仅供实验室研究使用，且检测周期长，操作较复杂；国内尚无成套试剂。
在用鼠抗人Acrp30单抗作包被，兔抗人Acrp30多抗作酶标，用于免疫动物的重组蛋白Acrp30是以包涵体形式表达，在免疫前用8M尿素使其变性溶解的实验设计中，采用现有ELISA试剂中的样品稀释液配方，均不能检测到人血中的Acrp30，因而有必要寻找一种适合的样品稀释液。

发明内容
本发明的目的在于提供一种用于酶联免疫吸附测定中的针对血清或血浆样品的稀释液。
本发明提供的样品稀释液，用于酶联免疫吸附测定中，它包括一种还原剂及缓冲组分。
其中，所述还原剂为二硫苏糖醇，代号DTT，DTT的浓度在5mM到500mM，优选为20mM到100mM，最好为25mM。
其中，所述缓冲组分为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、和NaCl的组合。其中pH8.0的Tris缓冲液浓度在50mM到200mM，pH8.0的EDTA浓度在1mM到5mM，NaCl的浓度在100mM到400mM。
本发明样品稀释液配方最好为25mM DTT、100mM pH8.0的Tris缓冲液、2mMpH8.0的EDTA、和200mM NaCl。
本发明的另一目的在于提供一种夹心法ELISA检测人血清或血浆脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)含量的方法。
本发明提供的一种夹心法ELISA检测人血清或血浆脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)含量的方法，是使用前面所述的任一种血清或血浆样品稀释液来稀释待测样品。
该方法具体步骤包括步骤一.包被酶联板每孔加100微升用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液1∶2000稀释的鼠抗人Acrp30单克隆抗体，室温孵育过夜；然后弃去液体，用pH7.4的0.01M PBST洗板2次，拍干板子；每孔加150微升用1.5％牛血清白蛋白、4％饱和硫酸铵、5％蔗糖、5％EDTA、0.01M PBS和0.2‰柳硫汞组成的封闭液，室温孵育1小时；然后弃去液体，拍干板子；步骤二.检测步骤用未加DTT的样品稀释液作为标准品稀释液，对标准品作1∶50稀释后，再作倍比稀释至1∶1600；在离心管里加100微升样品稀释液，再加25微升人血清或血浆浆标本，该标本为经5000g离心1分钟后取的上清液；每孔加100微升稀释好的标准品、人血标本，37℃震摇孵育40分钟；弃去液体，用pH7.4的0.01MPBST洗板5次，拍干板子；每孔加100微升用酶标稀释液1∶300稀释的酶标抗体，37℃震摇孵育30分钟，其中该酶标稀释液由20％小牛血清、15％甘油、4％聚乙二醇6000、0.75％饱和硫酸铵、0.01M PBS和0.1％吐温-20组成，该酶标抗体为用过碘酸钠法标记上辣根过氧化物酶的兔抗人Acrp30多克隆抗体；弃去液体，用0.01M PBST(pH7.4)洗板5次，拍干板子；然后每孔加A、B显色液各一滴，37℃震摇孵育15分钟，其中A显色液为十二水磷酸氢二钠18.41g/L、柠檬酸7.65g/L和30％双氧水0.24ml/L组成，B显色液为四甲基联苯胺0.4g/L、二甲基甲酰胺40ml/L、EDTA0.525g/L和柠檬酸4.2g/L组成；然后每孔加50微升1M硫酸终止液，OD450nm检测；步骤三.根据标准曲线，得到检测样品中人血Acrp30含量。
依照上述技术方案，本发明因提出含还原剂的样品稀释液，使得待检样品稀释前后无须煮沸处理，操作简便，并通过改变反应条件，缩短了反应时间，实现了对人血清(血浆)Acrp30蛋白快速定量检测。


图1为本发明中菌产Acrp30标准品的稀释示意图；图2为本发明中ELISA检测菌产Acrp30的标准曲线图。
具体实施例方式
本发明涉及酶联免疫吸附测定(ELISA)中，血清或血浆样品的处理、稀释、上样。
在本发明涉及的研究中，用鼠抗人Acrp30单抗作包被，兔抗人Acrp30多抗作酶标，用于免疫动物的重组蛋白Acrp30是以包涵体形式表达，在免疫前用8M尿素使其变性溶解。该实验设计中，需要检测人血中的Acrp30含量，发现其中样品稀释液会影响Acrp30的检测。
为此，经艰苦摸索与实验，本发明提出了一种血清或血浆样品稀释液。
本发明提出的稀释液的主要特点是含有还原剂，实验结果显示，还原剂为二硫苏糖醇(DTT)为最好，使用浓度在20mM到100mM时效果较好，最佳浓度约为25mM。
本发明样品稀释液中还包括缓冲液成分，为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、和NaCl的组合。其中，Tris缓冲液(pH8.0)的浓度大约在50mM到200mM，最佳浓度约为100mM；EDTA(pH8.0)的浓度大约在1mM到5mM，最佳浓度约为2mM；NaCl的浓度大约在100mM到400mM，最佳浓度约为200mM。
实施例一本发明血清(血浆)样品稀释液的配制本发明最优选的血清(血浆)样品稀释液，为25mM DTT、100mM Tris缓冲液(pH8.0)、2mM EDTA(pH8.0)、200mM NaCl组成，参见表1。
表1样品稀释液成份

表1中所列组分，分别按下面方式配制待用Tris称24.22g，加蒸馏水至100ml，配制浓度为2M；HCl取11.6N的HCl 172.4ml，加蒸馏水至1000ml，配制浓度为2M；Tris缓冲液(pH8.0)2M Tris 50ml加2M HCl 29.2ml，加蒸馏水至100ml；配制浓度为1M；EDTA(pH8.0)在80ml蒸馏水中加186.1g二水乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2H2O)在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调溶液pH至8.0(约需20gNaOH颗粒)然后定容至1L，分装后高压灭菌备用，配制浓度为0.5M；NaCl称5.844g，加蒸馏水至100ml，配制浓度为1M；DTT称1.545g，加蒸馏水至10ml，置-20℃存放，配制浓度为1M。
上述各组分，用表2所列步骤进行配制，形成100ml本发明样品稀释液表2样品稀释液的配制方法

实施例二至四用与实施例一相同的方法，分别配制表3所列各组成及含量的样品稀释液。
表3实施例二至四样品稀释液各成份浓度 实施例五ELISA定量检测一、标准品的稀释操作参见图1，具体步骤为1.将配制好的标准品稀释液加到六个离心管中，第一管加500μl，其它管加250μl；2.向第一管内加入已知浓度(1.4mg/ml)的菌产Acrp30，至终浓度为28μg/ml。
3.作倍比稀释，使第二至六管中Acrp30的浓度为14μg/ml、7μg/ml、3.5μg/ml、1.75μg/ml、0.875μg/ml。
二、标准样品的ELISA检测1.每孔加100μl步骤一配制的Acrp30标准品，加膜，置37℃震摇40分钟。
2.弃去液体，用0.01M pH7.4 PBST洗板五次，拍干。
3.每孔加100μl酶结合物，加膜，置37℃震摇30分钟。
4.弃去液体，用0.01M pH7.4 PBST洗板五次，拍干。
5.每孔加显色液A、B各50μl，加膜，置37℃震摇10分钟。其中A显色液为十二水磷酸氢二钠18.41g/L、柠檬酸7.65g/L和30％双氧水0.24ml/L组成，B显色液为四甲基联苯胺0.4g/L、二甲基甲酰胺40ml/L、EDTA0.525g/L和柠檬酸4.2g/L组成；6.每孔加50μl 1M H2SO4终止反应，OD450nm检测。
7.将检测结果绘制成标准曲线，参见图2。
三、ELISA检测样品中Acrp30的含量1.将1体积血清加入到4体积样品稀释液中混合，取100μl样品置于孔中，加膜，置37℃震摇40分钟。
2.～6.同步骤二中的步骤1～6。
7.对照标准曲线，得到测试样品的Acrp30含量。
实验一不同稀释液ELISA检测Acrp30对照实验对标准样品和待检样品，用不同的稀释液进行稀释，然后按照实施例五步骤二的方法ELISA检测Acrp30的含量，结果如表4所示。其中，对照样为LincoResearch，Inc.的稀释液，本样为本发明实施例一配制的稀释液。
表4不同稀释液ELISA检测Acrp30对照实验

从该实验可以看出，使用本发明稀释液，可以比较准确检出Acrp30的含量，而用对照样稀释液，则无法检出Acrp30。
实验二检测精确度实验一)标准品稀释及血清样品的处理标准品稀释同实施例五；样品处理将1体积血清加入到3体积样品稀释液中混合。
二)ELISA检测1.板内精确度一份样品重复加十二个孔。
2.板间精确度一份样品分十二次检测。
3.操作同实施例一三)结果见表5。从表5数据可以看出检测板内CV为5％、板间CV为8％，精确度良好。
表5ELISA检测精确度

实验三ELISA检测准确性实验一)标准品稀释及血清样品的处理1.标准品稀释同实施例五。
2.在一份血清中加入高、中、低三种已知浓度的标准品，样品稀释同实验二。
二)ELISA检测操作同实施例五。
三)结果见表6。从表6数据可以看出检测的准确性在88-108％，准确性良好。
表6.ELISA检测准确性

试验四ELISA检测的线性关系实验一)标准品稀释及血清样品的处理1.标准品稀释同实施例五。
2.样品稀释同实验二。将稀释好的血清用样液作2倍、4倍、8倍稀释。
二)ELISA检测操作同实施例五。
三)结果见表7。从表7数据可以看出检测线性关系在80-102％，线性关系良好。
表7ELISA检测的线性关系

权利要求
1.一种血清或血浆样品稀释液，用于酶联免疫吸附测定中，其特征在于，它包括一种还原剂及缓冲组分。
2.根据权利要求1所述的血清或血浆样品稀释液，其特征在于，所述还原剂为二硫苏糖醇，代号DTT。
3.根据权利要求2所述的血清或血浆样品稀释液，其特征在于，所述稀释液中DTT的浓度在5mM到500mM。
4.根据权利要求3所述的血清或血浆样品稀释液，其特征在于，所述稀释液中DTT的浓度优选为20mM到100mM。
5.根据权利要求3所述的血清或血浆样品稀释液，其特征在于，所述稀释液中DTT的浓度最好为25mM。
6.根据权利要求1所述的血清或血浆样品稀释液，所述缓冲组分为三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)缓冲液、乙二胺四乙酸(EDTA)、和NaCl的组合。
7.根据权利要求6所述的血清或血浆样品稀释液，其特征在于，所述稀释液中pH8.0的Tris缓冲液浓度在50mM到200mM，pH8.0的EDTA浓度在1mM到5mM，NaCl的浓度在100mM到400mM。
8.根据权利要求1所述的血清或血浆样品稀释液，其特征在于，包含25mMDTT、100mM pH8.0的Tris缓冲液、2mM pH8.0的EDTA、和200mM NaCl。
9.一种夹心法ELISA检测人血清或血浆脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)含量的方法，其特征在于，使用权利要求1至8任一所述血清或血浆样品稀释液来稀释待测样品。
10.根据权利要求9所述的夹心法ELISA检测人血清或血浆脂肪细胞补体相关蛋白30(Acrp30)含量的方法，其特征在于，具体步骤包括步骤一.包被酶联板每孔加100微升用0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液1∶2000稀释的鼠抗人Acrp30单克隆抗体，室温孵育过夜；然后弃去液体，用pH7.4的0.01M PBST洗板2次，拍干板子；每孔加150微升用1.5％牛血清白蛋白、4％饱和硫酸铵、5％蔗糖、5％EDTA、0.01M PBS和0.2‰柳硫汞组成的封闭液，室温孵育1小时；然后弃去液体，拍干板子；步骤二.检测步骤用未加DTT的样品稀释液作为标准品稀释液，对标准品作1∶50稀释后，再作倍比稀释至1∶1600；在离心管里加100微升样品稀释液，再加25微升人血清或血浆浆标本，该标本为经5000g离心1分钟后取的上清液；每孔加100微升稀释好的标准品、人血标本，37℃震摇孵育40分钟；弃去液体，用pH7.4的0.01M PBST洗板5次，拍干板子；每孔加100微升用酶标稀释液1∶300稀释的酶标抗体，37℃震摇孵育30分钟，其中该酶标稀释液由20％小牛血清、15％甘油、4％聚乙二醇6000、0.75％饱和硫酸铵、0.01M PBS和0.1％吐温-20组成，该酶标抗体为用过碘酸钠法标记上辣根过氧化物酶的兔抗人Acrp30多克隆抗体；弃去液体，用0.01M PBST(pH7.4)洗板5次，拍干板子；然后每孔加A、B显色液各一滴，37℃震摇孵育15分钟，其中A显色液为十二水磷酸氢二钠18.41g/L、柠檬酸7.65g/L和30％双氧水0.24ml/L组成，B显色液为四甲基联苯胺0.4g/L、二甲基甲酰胺40ml/L、EDTA0.525g/L和柠檬酸4.2g/L组成；然后每孔加50微升1M硫酸终止液，OD450nm检测；步骤三.根据标准曲线，得到检测样品中人血Acrp30含量。
全文摘要
本发明公开一种血清或血浆样品稀释液，用在夹心ELISA检测人脂肪细胞补体相关蛋白(Acrp30)中稀释血清(血浆)样品，它包括一种还原剂及缓冲组分，具体可以由25mM DTT、100mM pH8.0的Tris缓冲液、2mM pH8.0的EDTA、和200mM NaCl组成。使用本发明稀释液可以使样品处理、稀释、上样一次完成，并且使得待检样品稀释前后无须煮沸处理，操作简便，并通过改变反应条件，缩短了反应时间，实现了对人血清(血浆)Acrp30蛋白快速定量检测。
文档编号G01N33/544GK1715920SQ20041006222
公开日2006年1月4日 申请日期2004年6月30日 优先权日2004年6月30日
发明者陈竞新, 王全立, 詹林盛, 王会中, 付秋霞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院野战输血研究所