一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：S1、单克隆抗体制备；S2、扁桃仁prunin-1蛋白提取分离；S3、酶联免疫检测方法建立及评估；S4、组装定量检测试剂盒。本发明还提供了一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒。本发明的有益效果是：能够定量检测食品中扁桃仁蛋白。
【专利说明】-种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及扁桃仁蛋白的定量检测，尤其设及一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒 及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 扁桃仁，俗称己旦木，是出产自世界各地、广受欢迎的一种坚果，富含有蛋白质、膳 食纤维、维生素E，且不含胆固醇，在中国被广大消费者接受和喜爱。但是由于利益的驱使， 不法食品生产者往往使用杏仁香精等添加剂制造扁桃仁蛋白饮料。造成该种乱象和质疑的 根本原因在于缺少植物蛋白饮料中所含有植物蛋白的定量方法。国家标准GB 16322-2003 《植物蛋白饮料卫生标准》规定植物蛋白饮料中的蛋白质含量应不低于5g/L。由于技术所 限，目前只能依据凯式定氮法对其总蛋白进行定量。凯式定氮是通过测定样品中总氮的含 量推算出蛋白含量。该就导致了不法分子可W =聚氯胺等高氮小分子非法添加物冒充植物 蛋白，或W相对廉价的蛋白渗伪价格较高的扁桃仁蛋白。植物蛋白饮料对其总氮的测定不 能真实反映添加的植物蛋白的含量或者乳蛋白含量。该不仅设及到欺骗消费者，更严重的 是渗伪过程因风味需要常添加过量的或非法的香精香料，极大威胁食品安全。
[0003] 另外，扁桃仁也是一种易于致敏的过敏原。但是由于其和杏仁高度相似，往往和杏 仁混淆，商家在标签上也往往遗漏或错误标示，该就给扁桃仁致敏人群造成极大的食品安 全隐患。但由于DNA在热加工过程中的破坏W及两者亲源性较近，目前的PCR方法尚不能 特异性区分在热加工产品中的扁桃仁和杏仁。
[0004] 因此，综合上两方面所述，市场迫切需要一种能定量检测食品中扁桃仁蛋白的产 品。
【发明内容】
[0005] 为了解决现有技术中的问题，本发明提供了一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒及 其制备方法。
[0006] 本发明提供了一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，包括W下步骤：
[0007] S1、单克隆抗体制备；
[000引 S2、扁桃仁prunin-1蛋白提取分离；
[0009] S3、酶联免疫检测方法建立及评估；
[0010] S4、组装定量检测试剂盒。
[0011] 作为本发明的进一步改进，步骤S1包括；根据NCBI扁桃仁pruin-1的蛋白序列进 行Blast比对，综合特异性，抗原性分析，合成多肤偶联钥孔血藍蛋白作为免疫原，偶联载 体蛋白牛血清白蛋白作为包被原。
[0012] 作为本发明的进一步改进，步骤S1还包括：免疫原通过免疫实验动物，经过细胞 融合，抗体纯化制备抗扁桃仁prunin-1蛋白单克隆抗体。
[0013] 作为本发明的进一步改进，步骤S1还包括：抗体识别位点为扁桃仁prunin-1蛋白 的RQGRQQGRQQ犯EGR氨基酸序列。
[0014] 作为本发明的进一步改进，步骤S2包括；通过液相等电聚焦，蛋白电泳等蛋白纯 化系统制备扁桃仁prunin-1蛋白，W此作为试剂盒内的标准品。
[0015] 作为本发明的进一步改进，步骤S3包括；建立扁桃仁蛋白酶联免疫检测方法并对 其特异性、抗基质干扰能力和重复性进行评估。
[0016] 作为本发明的进一步改进，步骤S3包括；将预包被扁桃仁包被原的酶标板、扁桃 仁prunin-l蛋白标准溶液、辣根过氧化物酶标记扁桃仁prunin-l蛋白单克隆抗体、显色液 和终止液组装为定量检测试剂盒。
[0017] 本发明还提供了一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒，通过如上述中任一项所述的 扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法制备而成。
[0018] 本发明的有益效果是：能够定量检测食品中扁桃仁蛋白，抗扁桃仁特征蛋白抗体 针对的抗原决定簇耐热，可对扁桃仁及其相关产品进行蛋白定量检测，适用范围广，有利于 消费者合法权益的保障；特异性好，灵敏度高，抗基质干扰效果好，检测结果准确性好，重复 性好；样品的前处理简单，检测操作简单，试剂均W工作液的形式提供，可方便地进行大量 样本的筛查。
【专利附图】
【附图说明】
[0019] 图1是抗扁桃仁prunin-l蛋白单克隆抗体的Western-blot图谱；
[0020] 图2是扁桃仁prunin-l蛋白双向电泳蛋白图谱；
[0021] 图3是扁桃仁prunin-l蛋白酶联免疫检测标准曲线。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合【专利附图】
【附图说明】及【具体实施方式】对本发明进一步说明。
[0023] 实施例一目标抗原的制备。
[0024] 根据NCBI扁桃仁pruin-l的蛋白序列进行Blast比对，综合特异性，抗原性分析， 合成多肤（氨基酸序列；RQGRQQGRQQ犯EGR-切S)偶联钥孔血藍蛋白作为免疫原，偶联载体 蛋白牛血清白蛋白作为包被原。偶联方法如下：
[002引 5. 8mg 3-(2-化晚二琉基）丙酸N-哲基班巧酷亚胺醋溶解于1血二甲亚讽中，逐 步滴加至溶解有0. Ig钥孔血藍蛋白或牛血清白蛋白的1血0.01M PH7.4 PBS中，室温反应 12小时。透析过夜除去游离的3-(2-化晚二琉基）丙酸N-哲基班巧酷亚胺醋。将4mg多 肤加入上述活化好的蛋白溶液中。反应12小时后透析过夜，冻干保存。
[0026] 实施例二抗扁桃仁prunin-l蛋白抗体的制备和纯化。
[0027] 用实施例一制备的免疫原分别免疫6周雌性ba化/c鼠，每组3只。首次免疫注射 时，分别100 y g/mL的免疫抗原100 y以与等量弗氏完全佐剂充分乳化，腹腔直接注射。间 隔两周后，取用样的抗原，与100 y L不完全佐剂乳化，同样方法注射。
[002引在细胞融合前Id或当天拉颈处死昆明鼠，浸泡在70%酒精中，体表消毒；用大头 针固定昆明鼠在蜡板上，超净工作台上剪开腹部，用小綴子挑起腹膜，注入5mL RPMI-1640 完全培养液（由GIBIC0 RPMI-1640基础培养液加入15%胎牛血清而得），用手轻轻揉动腹 腔，将其体内液体用无菌吸管移入75mL HAT完全培养液（由74. 25mL RPMI-1640完全培养 液加入0. 75血100 XHAT液而得）中，用吸管混匀，铺24孔板，每孔加0. 5血，置于37°C C02 培养箱中。
[0029] 小鼠眼眶放血，收集血清，拉颈处死，70%酒精浸泡消毒体表，无菌取出脾脏，放入 RPMI-1640基础培养液（购自GIBICO,货号为A10491-01)中，并小屯、剔除筋膜及脂肪，剪 碎，置于100目的不诱钢筛内，无菌研磨，释放出单个脾细胞，吸取含有脾细胞的液体置于 50mL无园罔心官中，罔心。
[0030] 将骨髓瘤细胞和上述制备好的脾细胞W个数5 ;1的比例加入同一 50血的离屯、管 中，加入37°C温浴的RPMI-1640不完全培养液（购自GIBICO,货号为61870-036) 20血，混 合均匀，15(K)r/min离屯、6min，弃去上清，用手指轻击离屯、管底部，使沉淀混匀如糊状；用 移液管取37°C预热的阳G 1血，滴入离屯、管，静置Imin后，于37°C水浴中在2min内滴加 RPMI-1640完全培养液10血，100化/min离屯、6min，弃去上清，加75血HAT培养液，轻轻混 匀，将混匀悬液分装于有饲养细胞的24孔板中，每孔0. 5mU于37°C、5% C02饱和湿度的培 养箱中解育。
[003U 融合后6?9d，用HAT培养液半量换液1次，在12?14d后根据增殖情况改用 RPMI-1640完全培养液；待细胞贴壁至占板孔1/3时，计杂交瘤细胞生长的孔数及细胞总 数，取上清液，间接化ISA选择效价高和间接竞争化ISA选择药物抑制强的阳性杂交瘤细 胞。
[0032] 采用间接ELISA和间接竞争ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，显示阳性并出现 竞争抑制反应的孔为产扁桃仁prunin-1蛋白抗体的孔，并可用于进一步的亚克隆。
[0033] 无菌条件下，洗脱阳性孔内的细胞，用弯头吸管将细胞转移至预先W饲养细胞铺 板的96孔培养板中，每个原始孔克隆成8孔，待细胞贴壁长满1/2?1/3孔底后，取上清液， 间接化ISA检测；取呈阳性强的亚克�。绱朔锤�2?5次，待所克隆的8个孔上清液中抗 体阳性率为100%时，挑取单细胞克�。觳馕粜哉咦浦�24孔细胞培养板或25mL细 胞培养瓶扩大培养，建株并W分装、冻存。提前一周注射0. 5mL降植烧至Ba化/c小鼠腹腔。 取冻存细胞株，复苏后，经大量培养繁殖，收集细胞，用不完全培养基洗漆二次后，再用lOmL 不完全培养基悬浮，计数；将细胞（每只小鼠1111以含3. IX 1〇7个细胞）腹腔注射小鼠腹部， 10?15d后，待小鼠腹部明显膨大时用16号注射器无菌采集腹水；200化/min离屯、lOmin， 去除上层脂肪和下层纤维蛋白及细胞，收集中层，分装-7〇°C冻存备用。
[0034] 取腹水离屯、后的中层部分3mL，加入2倍体积的0. 06mol/L、抑4. 5醋酸钢缓冲 液。将正辛酸逐滴慢慢加入样品中，至终浓度33 y g/血腹水，边加边揽拌，加完后继续揽 拌30min，4°C下1000化/min离屯、30min，去沉淀（白蛋白和其它非IgG蛋白）。取上清 经 0. 45ym 微孔膜过滤，与 1/10 体积 10XPBS 混合（10XPBS 由 80gNaCl、2g KCl、11.5g Na2HP04、2g皿2?04、0. 5845g邸TA用950血蒸馈水溶解后，调抑至7. 4并定容至1000血而 得），用Imol/L化0H溶液调抑值到7. 4。上清冷却到4°C，加硫酸锭至终浓度为0. 277g/ 血。揽拌30min，4°C下100(K)r/min离屯、30min，弃上清。用少量PBS溶液溶解沉淀，用50? 100倍体积的PBS透析过夜，换液3次。得到纯化后的抗扁桃仁prunin-1蛋白抗体，4°C下 贬藏备用。纯化后的抗扁桃仁prunin-1蛋白抗体经Western-Blotting检测，结果如图2 说明使用实施例一所述的多肤偶联抗原，可W特异性识别扁桃仁prunin-1蛋白，抗扁桃仁 prunin-1蛋白单克隆抗体的Western-blot图谱如图1所示。
[0035] 实施例S扁桃仁prunin-l蛋白标准品的制备。
[0036] 将扁桃仁果肉部分粉碎机粉碎后，取样品lOOg，使用8M尿素超声提取化。离屯、取 上清，使用液相等点聚焦仪进行初次分离纯化，截取等电点为5-6的组分。
[0037] 初分离的样品使用垂直电泳仪进行再纯化；将初分离的样品使用4%的浓缩胶和 12%的分离胶进行SDS-PAGE电泳，同时使用预染蛋白标准品作为分子量参照。80v电泳化 后，参照预染蛋白标准品切取分子量为40kd的蛋白凝胶条带。将蛋白凝胶使用研鉢粉碎 后，加入lOmL 7M尿素提取提取过夜。离屯、，取上清液进行透析，冻干。纯化的37kDa，等电 点为5-6的扁桃仁prunin-l蛋白的双向电泳蛋白图谱如图2所示。
[003引实施例四扁桃仁蛋白酶联免疫检测试剂盒的构建。
[0039] 预包被酶标板：
[0040] 将0. ImL Img/L的包被原（见实施例一）加入高吸附酶标板，包被过夜，采用封闭 液封闭2h，封闭液的配方为（1%牛血清白蛋白，1%牛酪蛋白，0.5%大豆蛋白粉，0.05%吐 温-80,溶于0. 01M抑7. 4PBS)，封闭后洗版真空干燥。
[0041] 抗扁桃仁prunin-l蛋白酶标抗体；
[0042] 称取5mg辣根过氧化物酶溶解于1ml蒸馈水中，加入0. 2ml新配的0. 1M化1〇4溶 液，室温下避光揽拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对ImM PH4. 4的醋酸钢缓冲液透 析，4°C过夜。加20 y 1 0. 2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，抑升高到9. 0?9. 5,然后立即加入lOmg 抗扁桃仁prunin-l蛋白单克隆抗体在1ml 0. 01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻揽拌2小 时。加0. 1ml新配的4mg/ml化肌4液，混匀，再置4°C 2小时。将上述液装入透析袋中，对 0. 15M pH7. 4PBS透析，4°C过夜，用含有1%的牛血清白蛋白、0. 05%吐温-80和15mM的叠 氮化钢分的0. 01M抑7. 4PBS稀释10000倍，分装14mL至每个试剂盒。
[004引底物显色液；由显色剂A和显色剂B等体积混匀而得；称取23mg四甲基联苯胺， 力口 1血DMS0溶解，然后加0. 1M P册.5己酸-醋酸钢缓冲液66血，得到显色剂A ;取双蒸水 100血，加过氧化脈10 y g，得到显色剂B。将显色液A和显色液B按体积比1:1混合，分装 14mL至每个试剂盒。
[0044] 终止液：为2M硫酸溶液，分装7mL至每个试剂盒。
[0045] 本发明提供的扁桃仁蛋白免疫检测试剂盒包括；扁桃仁prunin-l蛋白标准液7 瓶，浓度分别为 0 y g/mL、l y g/mL、2 y g/mL、4 y g/mL、8 y g/mL、16 y g/mL、32 y g/mL ;抗扁 桃仁prunin-l蛋白酶标抗体；包被了扁桃仁prunin-l蛋白的酶标板，底物显色液，终止液。
[0046] 本发明提供的扁桃仁蛋白免疫检测试剂盒在4°C环境下贬藏，可保质1年W上。
[0047] 实施例五扁桃仁蛋白酶联免疫试剂盒对扁桃仁相关产品进行检测。
[0048] 样品前处理：
[0049] 1、扁桃仁饮料；将扁桃仁饮料均质，称取Ig，加入20血0. 01M pH7. 4的PBS超声 连续提取2min，离屯、，取上清液为样品检测溶液，如果样品检测溶液的检测结果超过线性范 围上限，需再酌情稀释。
[0化0] 2、含有扁桃仁成分的固体食品：将固体样品研磨至粉状，称取0. Ig，加入lOmL 0. 01M pH7. 4的PBS超声连续提取2min，离屯、，取上清液稀释1000倍后，得到样品检测溶 液；
[0化1 ] 扁桃仁蛋白酶联免疫检测试剂盒进行检测：
[0化2] 1、将所需试剂从冷藏环境中取出，在室温下平衡30min W上，各种试剂使用前均 须摇匀；
[0053] 2、加系列浓度的扁桃仁prunin-1蛋白标准液或样品检测溶液50ul到相应的微孔 中，标准液均需做2个平行试验，然后加50 y 1酶标抗体工作液，室温避光反应30分钟； [0化4] 3、小屯、揭开盖板膜，弃去微孔中液体，并将微孔中剩余残液在吸水纸上拍干，往微 孔中注满洗漆液，轻轻振荡，放置2分钟，弃去微孔中液体，并在吸水纸上拍干，重复洗漆4 次或机洗5次；
[0化5] 5、加100 y 1底物显色液到相应的微孔中，并在室温下避光反应15分钟；
[0056] 6、加50 y 1终止液到相应的微孔中，使用酶标仪于450皿波长下测定OD值。
[0057] 根据扁桃仁prunin-1蛋白标准液的实验数据建立标准曲线，结果如图3所示。标 准曲线的回归方程R 2〉0. 99,说明OD值与扁桃仁prunin-1蛋白浓度具有很好的线性关系。 根据标准曲线的线性回归方程，计算出样品中的扁桃仁prunin-1蛋白含量，将此含量乘W 系数4. 7,得到扁桃仁全蛋白含量，扁桃仁prunin-1蛋白酶联免疫检测标准曲线如图3所 /J、- 〇
[0化引实施例六扁桃仁蛋白酶联免疫检测试剂盒的特异性。
[0059] 使用扁桃仁蛋白酶联免疫检测试剂盒对食品其他常见蛋白进行检测，结果如表2 所示。从表1可知，扁桃仁蛋白酶联免疫检测试剂盒与食品中其他蛋白成分无交叉反应，特 异性好，检测结果不会受影响。
[0060] 表1扁桃仁蛋白酶联免疫试剂盒与食品中其他蛋白成分的交叉反应
[0061]
【权利要求】
1. 一种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 51、 单克隆抗体制备； 52、 扁桃仁prunin-1蛋白提取分离； 53、 酶联免疫检测方法建立及评估； 54、 组装定量检测试剂盒。
2. 根据权利要求1所述的扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步 骤S1包括：根据NCBI扁桃仁pruin-1的蛋白序列进行Blast比对，综合特异性，抗原性分 析，合成多肽偶联钥孔血蓝蛋白作为免疫原，偶联载体蛋白牛血清白蛋白作为包被原。
3. 根据权利要求2所述的扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步 骤S1还包括：免疫原通过免疫实验动物，经过细胞融合，抗体纯化制备抗扁桃仁prunin-l 蛋白单克隆抗体。
4. 根据权利要求3所述的扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步 骤S1还包括：抗体识别位点为扁桃仁prunin-l蛋白的RQGRQQGRQQQEEGR氨基酸序列。
5. 根据权利要求1所述的扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步 骤S2包括：通过液相等电聚焦，蛋白电泳等蛋白纯化系统制备扁桃仁prunin-l蛋白，以此 作为试剂盒内的标准品。
6. 根据权利要求1所述的扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步 骤S3包括：建立扁桃仁蛋白酶联免疫检测方法并对其特异性、抗基质干扰能力和重复性 进行评估。
7. 根据权利要求1所述的扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法，其特征在于，步 骤S3包括：将预包被扁桃仁包被原的酶标板、扁桃仁prunin-l蛋白标准溶液、辣根过氧化 物酶标记扁桃仁prunin-l蛋白单克隆抗体、显色液和终止液组装为定量检测试剂盒。
8. -种扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒，其特征在于：通过如权利要求1至7中任一项 所述的扁桃仁蛋白的定量检测试剂盒的制备方法制备而成。
【文档编号】G01N33/68GK104502607SQ201410804923
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月19日 优先权日:2014年12月19日
【发明者】赖心田, 张世伟, 黄静敏, 刘小青, 杨国武, 王士峰, 冯荣虎, 唐栋, 陈极锋 申请人:深圳市计量质量检测研究院
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