专利名称：一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的荧光定量PCR技术，特别涉及一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒。
背景技术：
急性髓细胞性白血病(Acute myeloid leukemia, AML)是一种临床分子异质性恶性克隆性疾�。羌毙园籽≈凶畛＜睦嘈停渲瘟菩Ч睿坪笸耆航饴饰�60%-70%，中位生存期约为2年。在美国每年有超过11，900新病例发生，AML的患者大多是中老年人，患者的平均年龄为65岁，其中儿童病例少于10%。大约一半的成年AML患者缺乏染色体畸变，虽然这些患者有一个较长的预后期，但是只有40%能长期存活下来。分子 技术能准确区别患者危险程度，从而提高治疗效果。最新研究发现AML患者中存在BAALC(Brain And Acute Leukemia, Cytoplasmic ;脑和急性髓系白血病,胞质)基因的异常高表达，经进一步研究，得知显示其表达的水平与预后存在关系。BAALC基因是一种早期造血细胞祖细胞的标志，在某些急性白血病患者中异常表达，该基因定位于染色体8q22. 3，其DNA序列和表达在哺乳动物中高度保守，主要表达在神经外胚层来源的组织及造血前体细胞中，成熟的骨髓和外周血单个核细胞不表达，编码的蛋白不与任何已知的蛋白或功能域同源，其功能尚不清楚。在造血干细胞中，BAALC基因的表达仅限于祖细胞。急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)及慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leukemia, CML)急变期患者有BAALC基因的表达，而CML慢性期及慢性淋巴细胞白血病(chronic lymphocytic leukemia, CLL)则检测不到。国外研究显示BAALC基因mRNA高表达是正�：诵虯ML (NC, AML)患者预后不良标志。目前可用于BAALC基因定量表达的方法有探针杂交法、基因芯片法、质谱法、免疫组化法和基因测序法等。探针杂交法假阳性率较高；基因芯片法成本高、制备方法繁琐；质谱法难以在普通医疗机构开展；基因测序法虽敏感性和特异性高，但价格比较昂贵，而且操作较繁琐，耗时较长。虽然免疫组化法的特异性和敏感性都比较高，但实时荧光定量PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应)与免疫组化法相比具有更强的特异性、更高的灵敏度而且检测快速、降低了污染，但目前尚未有实时荧光定量PCR方法检测急性髓细胞性白血病中BAALC基因的相关报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒。所述技术方案如下一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括BAALC基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中BAALC基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；
BAALC基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所示；BAALC基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示；ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所示；ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:5所不；ABL基因Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO: 7所示；内部阳性控制序 列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQID NO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman突光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。具体地，所述BAALC基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO: 11所示。具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有BAALC基因的总RNA样品O具体地，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/L MgCl24yL, IOX逆转录酶缓冲液
2μ L，IOmmoI/L dNTP2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g, AMV 逆转录酶1. 5U 和无RNase去离子水,总体积11 μ L。具体地，所述荧光定量PCR的混合液(以反应体系终浓度表示)为1Χ的PCR预混合液(原液为 2XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、
O.2U/ μ L的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶以及无RNase去离子水。本发明试剂盒的优点和效果如下(I)敏感度高可重复敏感度为O. 01%，即10000个细胞中有一个含BAALC基因就可以被检测出。(2)特异性强使用特异性探针对定量分子进行识别，准确性高。同时，靶序列由弓I物和探针双重控制，特异性好、假阳性低。(3)简便安全操作简单、安全、自动化程度高而且防止污染。扩增和检测可以在同一管内检测，不需要开盖，不易被污染；同时扩增和检测一步完成，不需要后期处理，无需要担心放射性污染。(4)全程监控本发明实施例提供的试剂盒引入了内部阳性控制质量控制体系，对检测过程进行全程质量监控，有效避免假阳性或者假阴性。(5)快速速度快、高通量，可在3-4小时完成。本发明的试剂盒能快速、准确的定量检测BAALC基因mRNA水平，有效杜绝了假阳性和假阴性的发生，用于急性髓细胞性白血病的诊断及预后评价，为急性髓细胞性白血病的诊断、鉴别诊断、制定治疗方案及预后提供了重要的检测手段。
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图；图1B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1. OxlO6-L OxlO3拷贝的内部阳性控制序列标准品的荧光曲线图得到的标准曲线图；图2A是本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1. OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL标准品的荧光曲线图；图2B是由本发明实施例2提供的试剂盒的荧光实时定量PCR反应体系扩增1.OxlO6-L OxlO3拷贝的ABL 标准品荧光曲线图得到的标准曲线图。
具体实施例方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。实施例1.本发明试剂盒的制备1、特异性的引物和荧光探针的设计根据基因序列(ABL基因序列和BAALC基因序列来源于美国国家生物技术信息中心核酸数据库，其中ABL基因ID分别为25，参考序列号为NM_005157. 4 ;BAALC基因ID分别为79870，参考序列号为NC_000008. 10)分别设计对上述各基因序列特异的引物和荧光探针。2、按照下列试剂盒的组成配制试剂盒的各组分本发明试剂盒组成如下①RNA 提取试剂Trizol 试剂(Invitrogen 公司，产品货号15596_026/100ml)，每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂快速提取急性髓系白血病患者骨髓组织RNA。②cDNA 第一链合成试剂盒(RT-PCR)(Fermentas 公司，产品货号K1622):25mmol/LMgCl24 μ L，IOX 逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制剂(RNasin，一种酸性糖蛋白)O. 5 μ L, Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆转录酶1. 5U和无RNase去离子水,总体积IlyL0③引物、探针和标准品包括BAALC基因引物、内部阳性控制序列引物、内参基因ABL引物及与引物对应的Taqman荧光探针，具体如下BAALC基因引物和探针序列上游引物序列为5’ -GCCCTCTGACCCAGAAACAG-3’(序列表中序列I);下游引物序列为5’-GGCATTCTCTTAGCATCTCTTTTAGC-3’(序列表中序列 2)；Taqman 荧光探针FAM5’ -TGGCCTTCAGACCACAGA-3’ TAMRA (序列表中序列 3)。ABL 基因序列为5’ -CAGGGTCTGAGTGAAGCCGCTCGTTGGAACTCCAAGGAAAACCTTCTCGCTGGACCCAGTGAAAATGACCCCAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACACTCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCAGTCAACAGTCTGGAGAAACACTCCTGGTACCATGGGCCTGTGTCCCGCAATGCCGCTGAGTATCTGCTGAGCAGCGGGATCAATGGCAGCTTCTTGGTGCGTGAGAGTGAGAGCAGTCCTGGC-3’(序列表中序列11)。ABL基因引物和探针序列上游引物序列为5，-CCGGGTCTTAGGCTATAATCACA-3，(序列表中序列4)；下游引物序列为5’ -GCCTTGGCCATTTTTGGTT-3’(序列表中序列5)；Taqman 荧光探针FAM5’ -TGGTGTGAAGCCC-3’ TAMRA (序列表中序列 6)。
内部阳性控制序列为5’ -GCCCUCUGACCCAGAAAGACAAUGGCCUUCACAGCACAGAGCGUAAAAGAGAUGCUAAGAGAAUGCCUGCAAAAG-3，(序列表中序列 7)。内部阳性控制序列的引物和探针序列上游引物序列为5’ -GCCCTCTGACCCAGAAAGAC-3’(序列表中序列8)；下游引物序列为5’-GGCATTCTCTTAGCATCTCTTTTACG-3’(序列表中序列 9)；Taqman 荧光探针TET5’ -TGGCCTTCACAGCACAGA-3’ TAMRA (序列表中序列 10)。其中，内部阳性控制序列为人工合成序列，包含一部分已知的BAALC基因序列和一部分人工合成序列；内部阳性控制序列和ABL基因序列分别用作标准品。上述引物序列、控制序列、基因序列、探针序列均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。④阴性对照和阳性对照以去离子水为阴性对照，以含有BAALC基因的总RNA样品为阳性对照，采用上述实施例1中提供的本发明试剂盒组成①RNA提取试剂=Trizol试剂(Invitrogen公司，产品货号15596-026/100ml),按每Iml骨髓组织加入Iml Trizol试剂的比例，快速提取已经确诊的含有BAALC基因的急性髓细胞性白血病患者的骨髓组织RNA，作为阳性对照。⑤BAALC基因荧光定量PCR混合液由荧光定量PCR混合液和检测BAALC基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212, 2XPCR Premix)、
2.5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/μ L的BAALC基因上游引物(序列表中序列I)、O. 25pmol/ μ L的BAALC基因下游引物(序列表中序列2)、0. 3pmol/ μ L的BAALC基因Taqman荧光探针(序列表中序列3)、0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8),0. 25pmol/yL的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0. 3pmol/yL的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。通常取1-2 μ L的模板(包括被测样品RNA反转录合成的cDNA和内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA),其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。⑥ABL内参基因荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测ABL内参基因的引物、探针组成=IX的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号210212，2XPCRPremix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的 Taq 酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/y L的ABL内参基因上游引物(序列表中序列4)、
O.25pmol/ μ L的ABL内参基因下游引物(序列表中序列5)、0· 3pmol/ μ L的ABL基因Taqman荧光探针(序列表中序列6)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，加Λ ABL基因标准品模板2 μ L,其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。⑦内部阳性控制序列荧光定量PCR反应液由荧光定量PCR混合液和检测内部阳性控制序列的引物、探针组成ix的PCR预混合液(Qiagen公司，产品货号=210212,2 XPCR Premix),2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/μ L 的Taq酶和O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶、O. 25pmol/yL的内部阳性控制序列上游引物(序列表中序列8)、0· 25pmol/μ L的内部阳性控制序列下游引物(序列表中序列9)、0· 3pmol/μ L的内部阳性控制序列Taqman荧光探针(序列表中序列10)(以上所有的浓度都是指PCR反应体系的终浓度)。检测时，通常取1-2 μ L的模板(内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA)，其余为无RNase去离子水,反应总体积通常为20 μ L。·3、PCR扩增程序的设定在Iightcycler仪器上先经过50°C 10s, 95°C IOmin,然后再经过95°C 15s，60°C lmin，共40个循环。实施例2.用实施例1制备的试剂盒检测BAALC基因mRNA的表达量以检测30例急性髓细胞性白血病患者骨髓组织标本结果为例。用实施例1提供的本发明的试剂盒检测BAALC基因mRNA表达量的检测流程为首先根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。其次获取临床急性髓细胞性白血病患者骨髓组织样本，快速提取组织RNA，进行逆转录PCR合成cDNA第一链；先配制ABL内参基因和内部阳性控制序列的荧光定量PCR反应液，将内部阳性控制序列标准品和ABL标准品分别稀释至拷贝数/mL为1. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和1. OxlO6，分别制作内部阳性控制序列标准品的标准曲线(如图1A和图1B所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示),然后再配制BAALC基因荧光定量PCR反应液，进行荧光定量PCR检测样品，在荧光定量PCR仪数据分析系统中读出CT值结果。PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，提示检测失败，则需要重新进行检测，如果其Ct值位于33 35之间，需要重复检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，分别计算BAALC基因及ABL基因的Ct值，两者之差即为Λ Ct值。最后，荧光定量PCR结果采用软件分析，并标化计算样本数据。具体步骤如下①急性髓细胞性白血病患者骨髓组织总RNA的抽提按RNA抽提纯化的方法抽提急性髓细胞性白血病患者骨髓组织样品的总RNA。提取的RNA经琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性，通过紫外分光光度计测定260nm与280nm光密度值计算RNA的纯度与浓度，用O. 1%DEPC处理的水调节抽提的各样品RNA至相同浓度。②反转录合成cDNA :取2 μ L上述RNA提取液，在70°C保温lOmin，随后加入实施例I提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24yL, IOX逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV逆转录酶1. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应，合成cDNA第一链。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。取I μ L浓度为2 μ g/ml的内部阳性控制序列RNA (序列表中序列7)，在70°C保温IOmin,随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24y L，IOX 逆转录酶缓冲液 2μ L，10mmol/L dNTPs2 μ L，RNA 酶抑制剂 0. 5 μ L，Oligo (dT) 150· 5 μ g和AMV逆转录酶1. 5U，补加无RNase去离子水至总体积20 μ L，于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后,加热至99°C, 5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。取I μ L浓度为2 μ g/ml的阳性对照RNA，在70°C保温lOmin，随后加入实施例1提供的本发明试剂盒组成②cDNA第一链合成试剂盒，即25mmol/L MgCl24 μ L, 10 X逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTPs2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L, Oligo (dT) 150· 5 μ g 和 AMV 逆转录酶1. 5U,补加无RNase去离子水至总体积20 μ L,于42°C保温15min,进行逆转录反应,合成cDNA。反应结束后，加热至99°C，5min以灭活逆转录酶，加20 μ L无菌水混匀置冰箱_20°C保存。③将内部阳性控制基因序列标准品和ABL标 准品分别稀释至拷贝数/mL为1. OxlO3U. OxlO4U. OxlO5和l.OxlO6，用实施例1提供的内部阳性控制序列和ABL内参基因的荧光定量PCR反应液，分别制作内部阳性控制序列标准品标准曲线(如图1A和图1B所示)和ABL标准品标准曲线(如图2A和图2B所示)。④BAALC基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20yL:含IXPCR预混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的dNTPs 和 O. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 O. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，BAALC 基因上游引物终浓度O. 2mol/L, BAALC基因下游引物终浓度O. 2 μ mol/L, BAALC基因Taqman荧光探针浓度O. 3 μ mol/L,被测样品RNA反转录合成的cDNAl. OyL,同时加入内部阳性控制序列上游引物终浓度为0. 2 μ mol/L、内部阳性控制序列的下游引物终浓度为0. 2mol/L、内部阳性控制序列Taqman荧光探针终浓度为0. 3 μ mol/L和终浓度为0. 2 μ mol/L的内部阳性控制序列RNA反转录合成的cDNA (②中反转录合成的cDNA)，加入超纯至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑤ABL内参基因荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen 公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix) 10. O μ L, 2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，ABL 基因上、下游引物终浓度均为0. 2 μ mol/L, ABL基因的Taqman荧光探针终浓度0. 2 μ mol/L, ABL基因cDNAl. O μ L,加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler突光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s, 60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑥阳性对照、阴性对照荧光定量PCR扩增PCR反应体系为20 μ L :含2XPCR混合液(Qiagen公司，产品货号:210212, 2XPCR Premix)10. O μ L, 2. 5-4. OmM的Mg2+、0. 2-0. 4mM的 dNTPs 和 0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq 酶和 0. 01-0. 05U/ μ L 的 UNG 酶，BAALC 基因上、下游引物终浓度均为0. 2 μ mol/L，BAALC基因的Taqman荧光探针终浓度0. 3 μ mol/L,阳性对照RNA反转录合成的cDNAl. O μ L或者阴性对照去离子水1. O μ L，加入无RNase去离子水补至总体积20 μ L。在Iightcycler荧光定量PCR仪上反应扩增条件为95°C IOmin预变性，然后95°C 15s,60°C Imin扩增40个循环，扩增过程中仪器自动收集荧光信号。⑦数据收集处理和分析PCR扩增结束后，首先分析内部阳性控制序列扩增结果，如果其Ct值小于33，提示整个检测过程有效，如果其Ct值大于35，则需要重新进行检测。当内部阳性控制序列Ct值小于33时，将实时荧光定量PCR所得数据进行计算，得出BAALC基因相对于ABL内参基因的相对表达量后再进行统计分析，以比值大于或等于0. 000l为阳性表达，小于0. 0001为阴性表达(具体参见表I)表I为荧光定量PCR分析BAALC基因在急性髓细胞性白血病中的表达
IBMLC 模板Iabl 模板Ibaalc/abl
急性髓细胞性白血病~ 896490782985658900. 30027
急性髓细胞性白血病~ 43474972815371870. 01544
急性髓细胞性白血病~ 94561142689773100. 03516
急性髓细胞性白血病~ 954363194585400. 00030
急性髓细胞性白血病~ 243333345615730. 00007
急性髓细胞性白血病~ 347462606457340. 00013
急性髓细胞性白血病~ 87343652246698765 0. 35405
急性髓细胞性白血病~ 243675843168765060. 07690
急性髓细胞性白血病~ 18644436324579017 0. 05744
急性髓细胞性白血病~423056822375568420. 17809
急性髓细胞性白血病~ 198157590306671049 0. 64616
急性髓细胞性白血病~ 187936843157875180. 05951
急性髓细胞性白血病~ 42343852564514870. 01651
急性髓细胞性白血病~ 35604653196523510. 01114
急性髓细胞性白血病~ 237092985461900. 00008
急性髓细胞性白血病~ 29779003176501940. 00937
急性髓细胞性白血病~ 856346813164061530. 27065
急性髓细胞性白血病~415690432564879470. 16207
急性髓细胞性白血病~ 137596260229839543 0. 59866
急性髓细胞性白血病~ 163769821286631489 0. 5713权利要求
1.一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，其特征在于，所述检测用引物、荧光探针包括BAALC基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中 BAALC基因上游引物序列如序列表中SEQ ID勵:1所不； BAALC基因下游引物序列如序列表中SEQ ID N0:2所不； BAALC基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 3所示； ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID N0:4所不； ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO: 5所不； ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示； 所述cDNA第一链合成试剂含有MgCl2、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo (dT) 15、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg2+、dNTPs、dUTP、Taq 酶、UNG 酶和无 RNase 去离子水。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中内部阳性控制序列如序列表中SEQ IDN0:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID N0:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ ID N0:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO: 10所示。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的BAALC基因的Taqman荧光探针和ABL基因的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA ;所述内部阳性控制序列的Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中 SEQ ID NO: 11 所示。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有BAALC基因的总RNA样品。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述cDNA第一链合成试剂为25mmol/LMgC 124 μ L, IOX 逆转录酶缓冲液 2 μ L，IOmmoI/L dNTP 2 μ L, RNA 酶抑制剂 O. 5 μ L,Oligo (dT) 150. 5 μ g, AMV逆转录酶1. 5U和无RNase去离子水,总体积11 μ L。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光定量PCR的混合液为1X的PCR 预混合液、2. 5-4. OmM 的 Mg2+、0. 2-0. 4mM 的 dNTPs、0. 3-0. 6mM 的 dUTP、0. 2U/ μ L 的 Taq酶、O. 01-0. 05U/ μ L的UNG酶和无RNase去离子水。
全文摘要
本发明公开了一种检测BAALC基因mRNA表达量的试剂盒，属于生物技术领域。所述试剂盒包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括BAALC基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针。BAALC基因是一种早期造血细胞祖细胞的标志，在急性髓系白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)及慢性粒细胞白血病(CML)急变期患者中异常表达。本发明实施例采用敏感性及特异性均较高的荧光定量PCR检测BAALC基因mRNA水平，其检测结果的特异性和敏感度均显著提高。本发明提供的试剂盒为临床评估急性淋巴细胞性白血病的诊断、预后以及复发周期提供了一种全新的快速简便的基因诊断技术。
文档编号G01N21/64GK103014154SQ20121048654
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月26日 优先权日2012年9月29日
发明者李艳, 童永清 申请人:李艳, 童永清
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