专利名称：乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测小麦球蛋白的高灵敏ELISA试剂及制备方法，可应用于牛奶中小麦蛋白掺伪快速筛查检测，以及蛋白饮品中小麦球蛋白过敏原的快速定性检测。
背景技术：
不同来源的蛋白质的营养价值有别，一般来说，牛奶中蛋白质含有人体生长发育的一切必需的氨基酸，消化率可达98% 100%，为完全蛋白质，因而具有较高的营养价值，植物蛋白白中缺少必需氨基酸，且在人体消化吸收和利用程度也较差，因而营养价值相对较低。根据其不同的溶解性，可将小麦中的蛋白质分为清蛋白(溶于水和稀的缓冲液)、球蛋白(溶于盐溶液)、麦谷蛋白(溶于稀酸和稀碱溶液)和醇溶蛋白(溶于70% 90%乙醇)，后两种蛋白主要影响面粉面筋性能。由于生产来源及加工工艺的因素，市场上动物奶蛋白价格远高于植物蛋白。在利润的驱使下，采用植物蛋白代替动物蛋白、在乳品及含蛋白饮料中掺假的情况时有发生；曾有过牛奶中掺小麦粉的报道，也存在掺小麦蛋白的可能性。这种掺假尽管质量安全�：π越系停档土巳槠酚τ械募壑担哂衅燮颜�、扰乱市场秩序的恶果。为确保产品的真实性，有必要建立快速检测小麦球蛋白的方法。另据报道，国外约有30%的人群对特定食物有过敏反应，我国一项针对15 24岁健康人群的调查显示,在15 24岁年龄段健康人群中，约有6%的人曾患有食物过敏。估计20% 65%的过敏性肠道综合征和消化不良患者的病因与食物过敏有关。小麦被认为是一种主要的食物过敏原，它是FA0(1995)报告的八类常见过敏食物之一。虽然目前全世界缺乏有关小麦过敏的发病率统计数据，但小麦过敏仍然是一个不可忽视的食品安全问题，小麦球蛋白是小麦蛋白成分中的主要过敏原之一。对于食物过敏，目前还没有有效的治疗手段，患者只能通过严格避免过敏源来避免症状的发生。因此，食品中过敏原的检测也就成为食源性过敏控制的主要手段。目前关于乳及蛋白饮品中小麦球蛋白的快速定性方法鲜见报道，针对蛋白成分检测技术主要有SDS-PAGE、PCR、液相色谱和质谱等；上述技术仅适合应用于实验室分析，不适合于普通消费者使用。由于乳及蛋白饮品消费群体广，有必要建立一种简便、快速、经济、高灵敏的定性检测试剂，供广大消费者自行使用。
发明内容
本发明的目的是针对以上背景和技术需求，提供一种酶联免疫吸附试剂(ELISA)以及制备方法，用于乳及蛋白饮品中小麦球蛋白的快速定性检测；所述试剂及方法应具有操作简便、快速、结果直观、高灵敏的特点。为了达到上述目的，本发明人进行了广泛深入的研究，通过提取、纯化麦胚粉中小麦球蛋白，制备小麦球蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体，获得了采用单克隆抗体捕获目标、多克隆抗体检测的双抗夹心法所需的检测试剂，从而完成本发明。本发明提供的技术方案是乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体80_120ng/ml,其余是缓冲液；兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体70_90ng/ml,其余是缓冲液；底物显色剂A液醋酸钠26-28g/l，柠檬酸3-3. 5g/l，30%双氧水O. 5-0. 7ml/l，其余为蒸懼水；底物显色剂B液乙二胺四乙酸二钠O. 3-0. 5g/l，柠檬酸1.8-2. Og/Ι，甘油O. 09-0. 111/1，TMB O. 28-0. 32g/l, DMSO 5_7ml/l，其余为蒸馏水；终止液1. 8-2. 2mol/L硫酸溶液。所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及
含量鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体100ng/ml,其余是缓冲液；兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体80ng/ml,其余是缓冲液；底物显色剂A液醋酸钠27g/l，柠檬酸3. 2g/l，30%双氧水O. 6ml/l，其余为蒸馏水；底物显色剂B液乙二胺四乙酸二钠O. 4g/l，柠檬酸1. 9g/l，甘油O. 11/1，TMBO. 30g/l, DMSO 6ml/l，其余为蒸馏水；终止液2. OmoI/L硫酸溶液。所述缓冲液是磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、CAPSO、TAPS、甘氨酸、硼酸、硼酸盐中的一种或多种。乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂的制备方法，其特征在于其中的鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体的制作方法是I)麦胚粉干热灭酶，正己烷脱脂；用去离子水反复洗涤，充分洗去麦胚粉中水溶的清蛋白，洗涤后的沉淀溶于3% — 10%NaCl溶液，取上清为小麦球蛋白盐溶液粗提物。将粗提小麦蛋白盐溶液对去离子水透析过夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3次，冷冻干燥，即为纯化小麦球蛋白，作为抗原；2)用所制备的抗原免疫小鼠,取其脾脏的B细胞,将B细胞核骨髓瘤细胞融合,筛选针对抗原蛋白表位的单克隆抗体分泌型杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，8-10天后收集腹水，采用Protein G亲和层析柱纯化，获得鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体；其中的兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体的制作方法是I)麦胚粉干热灭酶，正己烷脱脂；用去离子水反复洗涤，充分洗去麦胚粉中水溶的清蛋白，洗涤后的沉淀溶于3% — 10%NaCl溶液，取上清为小麦球蛋白盐溶液粗提物。将粗提小麦蛋白盐溶液对去离子水透析过夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3次，冷冻干燥，即为纯化小麦球蛋白，作为抗原；2)用所制备的抗原免疫新西兰白兔,取兔血清,采用Protein A亲和层析柱纯化,获得兔抗小麦球蛋白多克隆抗体；采用戊二醛将HRP与兔抗小麦球蛋白多克隆抗体偶联，赖氨酸封闭残留的醛基，采用Sephadex G-200凝胶柱层析纯化，获得兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体。所述底物显色剂中的A、B分别液避光保存，使用的时候根据需要量取等量A与B液混匀后使用。
本发明使用时的操作步骤如下I)将鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体与固相载体联结，形成固相抗体；接着洗涤除去未结合的抗体及杂质。2)在固相抗体加上受检标本,保温反应；使标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物；然后洗涤除去其他未结合物质。3 )在步骤2 )所述复合物上添加兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体(酶标抗体)，保温反应；使复合物上的抗原与酶标抗体结合，然后彻底洗涤未结合的酶标抗体；此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。4)加底物显色；若固相上的酶催化底物成为有色产物，即可得知受检标本中带有小麦球蛋白；通过比色，还可测知标本中的抗原量。本发明得到的小麦球蛋白和单克隆抗体SDS-PAGE电泳结果见
图1 ;图中M:蛋白分子Marker ；1:小麦球蛋白；2 :小麦球蛋白单克隆抗体。·从图中可以看出，纯化后的小麦球蛋白主要有六条谱带，其分子量依次为57. 8kDa、41. 8kDa、38. 7kDa、24.1kD a、16. 5kDa 和 14. 3kDa。经粗测，所提取的小麦球蛋白纯度达到95%以上。纯化后的单克隆抗体共有两条谱带，分别为55kDa (重链)和27kDa (轻链)，纯度达98%以上。所制备的试剂对小麦球蛋白检测的灵敏度将纯化抗原的浓度稀释到O. 5 μ g/mL，之后连续作2倍梯度稀释，按确定的ELISA条件进行测定，灵敏度测试结果见图2。由图2可知，检测试剂对小麦球蛋白的检测限均在10ng/mL左右，显示出良好的灵敏度。所制备的试剂对小麦球蛋白检测的的特异性分别用牛奶α -酪蛋白(a-casein)、大麦球蛋白(Barley globulin)、小麦清蛋白(Wheat albumin)、小麦醇溶蛋白(Wheat gliadin)、玉米醇溶蛋白(Zein)和花生球蛋白(Arachin)、小麦粉、乔麦粉、豆浆、玉米汁、鸡蛋面条等样品进行测试，测试结果见表1，所制备的检测试剂可正确识别小麦球蛋白和含该蛋白的样品，与其他样品无交叉情况，显示出良好的特异性。表I小麦球蛋白ELISA方法的特异性和实际样品测试
权利要求
1.乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量 鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体80-120ng/ml，其余是缓冲液；兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体70-90ng/ml，其余是缓冲液；底物显色剂A液醋酸钠26-28g/l，柠檬酸3-3. 5g/l，30%双氧水O. 5-0. 7ml/l，其余为蒸馏水；底物显色剂B液乙二胺四乙酸二钠O. 3-0. 5g/l，柠檬酸1. 8-2. Og/Ι,甘油0.09-0. 111/1，TMB O. 28-0. 32g/l, DMSO 5_7ml/l，其余为蒸馏水；终止液1. 8-2. 2mol/L硫酸溶液。
2.根据权利要求1所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，其特征在于所述检测试剂包括以下分别封装的组分及含量鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体100ng/ml,其余是缓冲液；兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体80ng/ml,其余是缓冲液；底物显色剂A液醋酸钠27g/l，柠檬酸3. 2g/l，30%双氧水O. 6ml/l，其余为蒸馏水； 底物显色剂B液:乙二胺四乙酸二钠0.4g/l，柠檬酸1.9g/l，甘油O. 11/1，TMB O. 30g/1,DMSO 6ml/l，其余为蒸馏水；终止液2. OmoI/L硫酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，其特征在于所述缓冲液是磷酸盐、三羟甲基氨基甲烷、CAPSO、TAPS、甘氨酸、硼酸、硼酸盐中的一种或多种。
4.权利要求1所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂的制作方法，其特征在于所述鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体的制作方法是O麦胚粉干热灭酶，正己烷脱脂；用去离子水反复洗涤，充分洗去麦胚粉中水溶的清蛋白，洗涤后的沉淀溶于3%-10%NaCl溶液，取上清为小麦球蛋白盐溶液粗提物。将粗提小麦蛋白盐溶液对去离子水透析过夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3 次，冷冻干燥，即为纯化小麦球蛋白，作为抗原；2)用所制备的抗原免疫小鼠，取其脾脏的B细胞,将B细胞核骨髓瘤细胞融合,筛选针对抗原蛋白表位的单克隆抗体分泌型杂交瘤细胞株，将杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，8-10 天后收集腹水，采用Protein G亲和层析柱纯化，获得鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体；所述兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体的制作方法是1)麦胚粉干热灭酶，正己烷脱脂；用去离子水反复洗涤，充分洗去麦胚粉中水溶的清蛋白，洗涤后的沉淀溶于3% — 10%NaCl溶液，取上清为小麦球蛋白盐溶液粗提物。将粗提小麦蛋白盐溶液对去离子水透析过夜，有大量沉淀析出，取沉淀，用去离子水反复洗涤沉淀3 次，冷冻干燥，即为纯化小麦球蛋白，作为抗原；2)用所制备的抗原免疫新西兰白兔，取兔血清，采用ProteinA亲和层析柱纯化，获得兔抗小麦球蛋白多克隆抗体；采用戊二醛将HRP与兔抗小麦球蛋白多克隆抗体偶联，赖氨酸封闭残留的醛基，采用Sephadex G-200凝胶柱层析纯化，获得兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体。
5.根据权利要求4所述乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，其特征在于所述底物显色剂中的A、B分别液避光保存，使用的时候根据需要量取等量A与B液混匀后使用.
全文摘要
本发明涉及乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂及制备方法。目的是提供的试剂及方法应具有操作简便、快速、结果直观的特点。技术方案是乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂，包括以下分别封装的组分及含量鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体、缓冲液；兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体、缓冲液；底物显色剂A液；底物显色剂B液；终止液。乳及蛋白饮品中小麦球蛋白快速定性检测试剂的制备方法，其中的鼠抗小麦球蛋白单克隆抗体的制作方法是1)制取抗原；2)用所制备的抗原免疫小鼠，经过处理获得所述抗体；其中的兔抗小麦球蛋白酶联多克隆抗体的制作方法是1)制取抗原；2)用所制备的抗原免疫新西兰白兔，经过处理获得所述抗体。
文档编号G01N33/577GK102998461SQ20121047218
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月19日 优先权日2012年11月19日
发明者肖海龙, 屠海云 申请人:杭州市质量技术监督检测院
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