一种同时测定血液及组织中三种抗结核药物含量的方法-山东亚星游戏官网机床有限公司

专利名称：一种同时测定血液及组织中三种抗结核药物含量的方法
一种同时测定血液及组织中三种抗结核药物含量的方法所属领域本发明是属于一种同时测定中三种抗结核药物(异烟胼，利福平，吡嗪酰胺)含量的方法，具体地说是一种涉及高压液相色谱法同时测定血液及组织中三种抗结核药物含量的方法。
背景技术：
异烟胼(Isoniazid)，利福平(Rifampicin)，吡嗪酰胺(Pyrazinamide)仍是当今广泛使用的一线抗结核药物，异烟胼具有神经毒性，利福平具有肝毒性因此对抗结核药物进行浓度监测具有十分重要的临床意义。这三种药物的理化性质截然相反，异烟胼和吡嗪酰胺为强极性物质，且水溶性大，而利福平为弱极性物质，脂溶性大，因此要在一个色谱条件下将三种药物完全分离开有一定的困难。已有的监测方法主要采用磷酸盐缓冲液作为流动相，采用不同的色谱柱(C8柱和C18柱)在不同的色谱条件下分别检测这三种药物的含量，或将其中的部分药物预先进行衍生化再进样监测。此类方法工艺较为繁琐复杂，对实验室条件要求较高，需要多次重复检测，出检测报告的时间也较长，对样本量的要求亦较大，增加了临床检测的难度。

发明内容
本发明的目的就是提供一种操作简便，精确度高，检测速度快，稳定可靠，能够同时测定三种抗结核药物含量的方法。发明的检测方法包括如下步骤(1)样品处理血液样本采用(4000转/分钟)离心15分钟后取血浆，组织样本加入生理盐水采用均质器捣碎后(4000转/分钟)离心，加入提取液进行提取。(2)色谱条件流动相为0. 02mol/L,庚烷磺酸钠溶液(稀磷酸调pH至3. 0)-乙腈-甲醇，流动相使用前过滤后超声15分钟，脱气。(3)样品分析采用日本岛津公司高效液相色谱仪(LC2010C)，AT-130柱温控箱，Lc-solution型色谱工作站。色谱柱为分析柱shim-pack HRC-C84. 6謹，5 μ m)，保护柱EclipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱温 25C°。(4)建立标准曲线将空白血浆加入标准品溶液后稀释成含INH、RPF、PZA分别为0. 1,0. 2,0. 4、1、2、4、8、16 μ g/ml的标准血浆，以三种药物的峰面积为X轴、三种药物的浓度为Y轴作线性分析。得三种药物的回归方程Y^hw= 2370. 46X+1282. 66
Ynwgtis= 86447. 8X+5195. 94Yfl鮮=3007. 2X+3714. 58将样本进样后的色谱图药物峰面积带入到以上公式中，即可计算出药物浓度。本发明的优点为1.广泛适用性本色谱法不仅可以用于血液，还可以用于人体其他体液和组织等生物制剂样本内三种抗结核药物含量的检测，乳唾液，尿液，脑脊液，精液等。只要能够在液体状态能够中分离出来的组织均可以进行检测，可为临床血药浓度的检测，药代动力学的研究，用药方案的调整等提供可靠的检测手段。因此广泛适用性是本色谱检测方法具有深远的前景。2.样本处理的简便性本色谱方法对样本的处理及其简单，无需进行预先的衍生化。血液制剂直接离心后取血清用提取液进行提�。橹静捎脛蛑势鞯匪楹罄胄模∩锨逡河锰崛∫航刑崛�。方法简单，处理时间短，便利易行。3.检测过程快速本色谱方法采用梯度洗脱的方法对样本进行检测，能够一次进样同时检测样本中三种药物的浓度，耗时短，保留时间小于三十分钟，即一次进样三十分钟内就可得出检测结果。同时因为一次进样即可检测出三种药物含量，相比多次进样分别检测三种药物对检测样本的消耗也大大降低。4.检测结果精确而稳定本色谱方法精密度稳定(吡嗪酰胺8.4%，异烟胼10. 1%，利福平9.5% .)，回收率高(吡嗪酰胺83. 7%，异烟胼86. 2%，利福平88. 1% .)实施例11. 1检测样品是血液1. 2色谱条件色谱柱为分析柱shim-pack HRC-C8 (250mmX 4. 6mm, 5 μ m)，保护柱 EclipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱温25C° ；流动相为0. 02mol/L，庚烷磺酸钠溶液(稀磷酸调pH至 3.0)-乙腈-甲醇(78 5 17)6min, (20 5 75) 16min，(78 5 17)27min.流速为0. 8ml/min，测试波长吡嗪酰胺268nm，异烟胼264nm，利福平2Mnm.保留时间分别吡嗪酰胺:5. 62min，异烟胼:10. Olmin，利福平24. 89min.1. 3色谱分析结果色谱分离情况良好，三种药物与血液中内源性杂志互不干扰。图1为空白血浆进样后的谱图，图2为空白血浆添加三种药物后进样的色谱图，图3为血液样本进样后的色谱图，图5-7为空白血浆添加不同浓度的三种药物后，其浓度和峰面积的线性关系。1. 4计算药物含量根据图5-7作线性分析后得，按照药物峰面积和浓度关系得出三药的回归方程Y 异烟肼=2370. 4X+1282. 66Ynwgtis= 86447. 8X+5195. 94Yfl鮮=3007. 2X+3714. 58将图3血液样本进样后的色谱图的药物峰面积，异烟胼6426. 56m2，利福平16976. 33m2，吡嗪酰胺2060924. 62m2带入到上述方程当中，即可计算出三种药物的含量，异烟胼2. 17 μ g/ml，利福平4. 41 μ g/ml，吡嗪酰胺23. 78 μ g/ml。
2. 1检测样品是骨骼2. 2色谱条件色谱柱为分析柱shim-pack HRC-C8 (250mmX4. 6mm, 5 μ m)，保护柱 Ecl ipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱温25C° ；流动相为0. 02mol/L，庚烷磺酸钠溶液(稀磷酸调pH至 3.0)-乙腈-甲醇(78 5 17)6min, (20 5 75) 16min，(78 5 17)27min.流速为0. 8ml/min，测试波长吡嗪酰胺268nm，异烟胼264nm，利福平2Mnm.保留时间分别吡嗪酰胺:5. 62min，异烟胼:10. Olmin，利福平24. 89min.2. 3色谱分析结果色谱分离情况良好，三种药物与血液中内源性杂志互不干扰。图1为空白血浆进样后的谱图，图2为空白血浆添加三种药物后进样的色谱图，图4为骨骼样本进样后的色谱图，图5-7为空白血浆添加不同浓度的三种药物后，其浓度和峰面积的线性关系。1.4计算药物含量根据图5-7作线性分析后得，按照药物峰面积和浓度关系得出三药的回归方程Y 异烟肼=2370. 4X+1282. 66Ynwgtis= 86447. 8X+5195. 94Yfl鮮=3007. 2X+3714. 58将图3血液样本进样后的色谱图的药物峰面积，异烟胼3321.沈!112，利福平12473. 36m2，吡嗪酰胺559326. 34m2带入到上述方程当中，即可计算出三种药物的含量，异烟胼0. 86 μ g/ml，利福平2. 42 μ g/ml，吡嗪酰胺6. 41 μ g/ml

图1是空白血浆进样后的谱2是空白血浆添加三种药物后进样的色谱3是血液样本进样后的色谱4是骨骼样本进样后的色谱5是异烟胼药物浓度与峰面积线性关系6是吡嗪酰胺药物浓度与峰面积线性关系7是利福平药物浓度与峰面积线性关系图。
权利要求
1.一种高压液相色谱法同时测定血液及组织中三种抗结核(异烟胼，利福平，吡嗪酰胺)药物含量的方法，其特征在于包括如下步骤(1)样品处理血液样本采用(4000转/分钟)离心15分钟后取血浆，组织样本加入生理盐水采用均质器捣碎后(4000转/分钟)离心，加入提取液进行提取。(2)色谱条件流动相为0. 02mol/L,庚烷磺酸钠溶液(稀磷酸调pH至3. 0)-乙腈-甲醇，流动相使用前过滤后超声15分钟，脱气。(3)样品分析采用日本岛津公司高效液相色谱仪(LC2010C)，AT-130柱温控箱，Lc-solution型色谱工作站。色谱柱为分析柱shim-pack HRC-C8 Q50mmX4. 6mm，5 μ m)，保护柱EclipseXDB-C18(125mmX4. 6mm)，柱温 25°C。(4)建立标准曲线将空白血浆加入标准品溶液后稀释成含INH、RPF、PZA分别为0. 1,0. 2,0. 4、1、2、4、8、16 μ g/ml的标准血浆，以三种药物的峰面积为X轴、三种药物的浓度为Y轴作线性分析。得三种药物的回归方程Y异烟肼=2370. 4X+1282. 66Y 酸胺=86447. 8X+5195. 94Y 利福平=3007. 2X+3714. 58将样本进样后的色谱图药物峰面积带入到以上公式中，即可计算出药物浓度。
2.根据权利要求1所述高压液相色谱法同时测定血液及组织中三种抗结核药物含量的方法，其特征在于提取液采用(二氯甲烷异丙醇=1 1)配置，进行提取。
3.根据权利要求1所述高压液相色谱法同时测定血液及组织中三种抗结核药物含量的方法，其特征在于流动相的比例为(78 5 17)6min, (20 5 75) 16min,(78 5 17)27min，采用梯度洗脱的方法，流速为0.8ml/min。
4.根据权利要求1所述高压液相色谱法同时测定血液及组织中三种抗结核药物含量的方法，其特征在于测试波长PZA :268nm, INH :264nm，RFP :254nm0流速为1. 5毫升/分钟，进样体积为20微升进行色谱分析。
全文摘要
本专利提供了一种同时测定血液及组织中三种抗结核(异烟肼，利福平，吡嗪酰胺)药物含量的方法，该方法具有操作简便，精确度高，检测速度快，稳定可靠的特点。采用日本岛津公司高效液相色谱仪(LC2010C)，AT-130柱温控箱，Lc-solution型色谱工作站。色谱柱为分析柱采用C8柱，保护住采用C18柱，流动相采用庚烷磺酸钠溶液进项配制。
文档编号G01N30/02GK102384949SQ20111022821
公开日2012年3月21日申请日期2011年8月2日优先权日2011年8月2日
发明者刘鹏申请人:刘鹏, 江建明, 蒋晖

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