专利名称：刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法
技术领域：
本发明涉及一种刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，属于海洋生物技术领域。
背景技术：
由于刺参市场需求量的逐年增加，传统的捕捞业已不能满足人们的需求，刺参养殖业应运而生，养殖面积和产量的迅速增加，为沿海地区创造了十分可观的社会效益和经济效益。但近年来刺参病害不断发生，自2003年冬季起，山东和辽宁沿海的养殖刺参先后出现了烂皮、肿嘴的大面积流行病、引发了 30%以上的大量死亡。免疫学研究，是了解机体免疫反应特征、从而为疾病防治奠定基础和提供方法的科学。然而，由于刺参大量养殖是近几年的事，而病害的发生也非常急骤，所以免疫防御研究严重滞后。棘皮动物的体腔细胞具有多种生理功能，包括自我和非自我识别、吞噬、细胞毒素反应、细胞聚合、包囊、凝血以及产生抗菌活性物质等。细胞吞噬作用是棘皮动物免疫防御的主要效应方式，对体内没有产生抗体机构的棘皮动物的免疫防御具有更为重要的意义， 这一指标被广泛的用于衡量机体的健康状况及在环境胁迫或病原胁迫下的免疫防御能力。 目前有多种测定细胞吞噬的方法，如传统的显微镜检计数法、光密度法及流式细胞仪荧光检测法等。其中，镜检法通过显微镜的观察分析，适用于细胞的形态学观察及单个细胞吞噬功能的定性研究，但由于该技术存在主观性强和重复性差等缺点，其应用在一定程度上受到了限制。流式细胞仪技术(Flow-cytometry，FCM)可利用不同的荧光标记对细胞的吞噬功能进行研究，具有准确性高、重复性好，而且操作简便快速的特点，目前已成为研究脊椎动物血细胞功能的常规手段，但其在棘皮动物类中尚未得到广泛应用。
发明内容
本发明解决的技术问题是，解决上述现有技术的不足，提供一种快速测定刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，该方法具有准确性高、重复性好，而且操作简便快速的特点。本发明的技术方案是，首先制备刺参体腔液中的吞噬细胞，然后用荧光素异硫氰酸酯(FITC)标记热灭活后的酵母细胞，再将标记后的酵母细胞与刺参吞噬细胞共孵育，最后利用流式细胞仪测定吞噬活性。具体包括以下步骤(1)制备刺参体腔液中的吞噬细胞无菌注射器抽取与抗凝剂等体积的刺参体腔液，放入无菌离心管中，再沿管壁缓慢加入与混合液体积相同的蔗糖缓冲液，在水平离心机 800-1200rpm离心5_10分钟，收集位于体腔液、抗凝液混合物与蔗糖缓冲液之间的吞噬细胞，收集后用等渗缓冲液洗1-2次，加入含10%胎牛血清和双抗的L-15培养基，调整细胞浓度数量级为106cfu/mL。(2)FITC标记酵母细胞将划线分离的酵母细胞单克隆接种于YDP液体培养基，260C 48°C，振荡培养12-16小时后，室温5000-8000rpm离心10-20分钟，收集酵母细胞， 并用PBS洗1-2次，再用PBS重悬定量至1 X 109cfu/mL,放入沸水浴中30-50分钟杀死酵母细胞，然后用PBS冲洗2-3次，离心弃上清，PBS重悬，在37°C避光与FITC共同培养30-40 分钟，浓度为O.OlmgFITC/lO9酵母细胞，其间不时摇勻，室温离心收集标记酵母细胞，PBS洗 2-3次至上清无色，然后悬浮于等渗缓冲液中，定量1 X 108cfu/mL,荧光显微镜观察标记情况，4°C避光贮存。(3)标记后的酵母细胞与刺参吞噬细胞的共孵育加FITC标记的酵母细胞于吞噬细胞培养液中，且标记的酵母细胞与吞噬细胞的比例约为30-50 1，室温，置于水平摇床上慢速摇动30-120分钟，取摇勻液800-1000rpm离心5_10分钟，弃上清，PBS洗一次，70% 乙醇固定10-15分钟，800-1000rpm离心5_10分钟后弃上清，沉淀加入ImL浓度为0. 5 μ g/ mL 的 EB0(4)利用流式细胞仪检测吞噬细胞体外吞噬活性所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCal ibur，设定仪器基本参数，前向角为460，侧向角为399，起始电压0，数据采用Log对数形式，上样后先用Fk-H/Ssc-H圈定巨噬细胞，再采集红色和绿色荧光强度， 并计算实际吞噬率，所得数据用CellQuestPro Software软件分析。本发明所述的抗凝剂用以下方法制得先配置pH7. 6的浓度为0. 068mol/L的 Tris-HCl 缓冲液，然后加入 0. 02mol/L 的 EGTA，0. 34mol/L 的 NaCl, 0. 018mol/L 的 KCl，最后用0. 22 μ m的滤器过滤即可。本发明所述的蔗糖缓冲液用以下方法制得先配置pH7. 6的浓度为0. OOlmol/L的 Tris-HCl 缓冲液，然后加入 0. 8mol/L 的蔗糖，0. 34mol/L 的 NaCl，0. 001mol/L 的 EGTA，最后用0. 22 μ m的滤器过滤即可。本发明中，所述的等渗缓冲液用以下方法制得先配置pH7. 6的浓度为0. Olmol/ L 的 Tris-HCl 缓冲液，然后加入 0. 01mol/L 的 EGTA, 0. 34mol/L 的 NaCl，最后用 0. 22 μ m 的滤器过滤即可。本发明中，所述的双抗内含100IU/ml的青霉素及100 μ g/ml的链素。本发明中，所述的YDP液体培养基由1 %的酵母浸出汁，2 %蛋白胨，2 %的D-葡萄糖混合，然后灭菌制得。本发明的有益效果是，准确性高、重复性好，而且操作简便快速，为探讨刺参体腔细胞吞噬功能提供了方法依据。
图1为标记的酵母细胞图；图2为正常的刺参体腔吞噬细胞的吞噬结果图；图3为患病时的刺参体腔吞噬细胞结果图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明，但本发明并不局限于以下所述的实施例。配置ρΗ7· 6的浓度为0. 068mol/L的Tris-HCl缓冲液，然后加入0. 02mol/L的EGTA，0. 34mol/L的NaCl, 0. 018mol/L的KC1，最后用0. 22 μ m的滤器过滤制得抗凝剂。配置pH7. 6的浓度为0. 001mol/L的Tris-HCl缓冲液，然后加入0. 8mol/L的蔗糖， 0. 34mol/L的NaCl，0. 001mol/L的EGTA，最后用0. 22 μ m的滤器过滤制得蔗糖缓冲液。配置pH7. 6的浓度为0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液，然后加入0. 01mol/L的EGTA， 0. 34mol/L的NaCl，最后用0. 22 μ m的滤器过滤制得等渗缓冲液。无菌注射器分别抽取与抗凝剂等体积的正�：突疾〈滩翁迩灰焊�2. 5ml，放入无菌离心管中，再沿管壁缓慢加入5. Oml的蔗糖缓冲液，水平离心机IOOOrpm离心5分钟， 收集位于体腔液抗凝液混合物与蔗糖缓冲液之间的吞噬细胞，收集后用等渗缓冲液洗1-2 次，加入含10%胎牛血清和双抗的L-15培养基，调整细胞浓度为106cfu/mL，所述的双抗内含100IU/ml的青霉素及100μ g/ml的链素。划线分离的酵母细胞单个克隆接种于100ml的YDP液体培养基，温度26°C，振荡速度120转/min，培养12小时后，IOOOOg室温离心10分钟，收集酵母细胞，并用PBS 洗1-2次，再用PBS重悬定量至lX109Cfu/mL，放入沸水浴中30分钟致死酵母细胞，然后用PBS冲洗2-3次，离心弃上清，PBS重悬，在37°C避光与FITC共同培养30分钟，浓度为 0. OlmgFITC/lO9酵母细胞，其间不时摇勻。室温离心收集标记酵母细胞，PBS洗2_3次至上清无色，然后悬浮于等渗缓冲液中，定量1 X 108cfU/mL，荧光显微镜观察标记情况，4°C避光贮存。标记后的酵母细胞与刺参吞噬细胞的共孵育加FITC标记的酵母细胞于吞噬细胞培养液中，标记的酵母细胞与吞噬细胞的比例约为50 1，室温，置于水平摇床上慢速摇动60分钟，取摇勻液IOOOrpm离心5分钟，弃上清，PBS洗一次，70%乙醇固定10分钟， IOOOrpm离心5分钟后弃上清，沉淀加入ImL浓度为0. 5 μ g/mL的EB。流式细胞仪检测吞噬细胞体外吞噬活性所用流式细胞仪为BD公司生产的，型号为FACSCalibur，设定仪器基本参数，前向角(FSC，反映细胞的体积大小)为460，侧向角(SSC，反映细胞的颗粒含量)为399，起始电压0，数据采用Log对数形式。上样后先用 FSc-H/Ssc-H圈定巨噬细胞，再采集红色和绿色荧光强度，并计算实际吞噬率，所得数据用 CellQuest Pro Software 软件分析。计算结果如下所示
权利要求
1.刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，其特征在于，首先制备刺参体腔液中的吞噬细胞，然后用荧光素异硫氰酸酯FITC标记热灭活后的酵母细胞，再将标记后的酵母细胞与刺参吞噬细胞共孵育，最后利用流式细胞仪测定吞噬活性。
2.根据权利要求1所述的刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，其特征在于， 具体包括以下步骤(1)制备刺参体腔液中的吞噬细胞无菌注射器抽取与抗凝剂等体积的刺参体腔液， 放入无菌离心管中，再沿管壁缓慢加入与混合液体积相同的蔗糖缓冲液，在水平离心机 800-1200rpm离心5_10分钟，收集位于体腔液、抗凝液混合物与蔗糖缓冲液之间的吞噬细胞，收集后用等渗缓冲液洗1-2次，加入含10%胎牛血清和1 %双抗的L-15培养基，调整细胞浓度数量级为IO6CfuAiL ；(2)FITC标记酵母细胞将划线分离的酵母细胞单克隆接种于YDP液体培养基，26°C或 280C，振荡培养12-16小时后，室温5000-8000rpm离心10-20分钟，收集酵母细胞，并用PBS 洗1-2次，再用PBS重悬定量至1 X 109cfu/mL,放入沸水浴中30-50分钟杀死酵母细胞，然后用PBS冲洗2-3次，离心弃上清，PBS重悬，在37°C避光与FITC共同培养30-40分钟，浓度为0. OlmgFITC/lO9酵母细胞，其间不时摇勻，室温离心收集标记酵母细胞，PBS洗2_3次至上清无色，然后悬浮于等渗缓冲液中，定量1 X 108cfu/mL,荧光显微镜观察标记情况，40C 避光贮存；(3)标记后的酵母细胞与刺参吞噬细胞的共孵育加FITC标记的酵母细胞于吞噬细胞培养液中，且标记的酵母细胞与吞噬细胞的比例为30-50 1，室温，置于水平摇床上慢速摇动30-120分钟，取摇勻液800-1000rpm离心5_10分钟，弃上清，PBS洗一次，70%乙醇固定10-15分钟，800-1000rpm离心5-10分钟后弃上清，沉淀加入ImL浓度为0. 5 μ g/mL的 EB ；(4)利用流式细胞仪检测吞噬细胞体外吞噬活性所用流式细胞仪为BD公司生产的， 型号为FACSCalibur，设定仪器基本参数，前向角为460，侧向角为399，起始电压0，数据采用Log对数形式，上样后先用FSc-H/Ssc-H圈定巨噬细胞，再采集红色和绿色荧光强度，并计算实际吞噬率，所得数据用CellQuest Pro Software软件分析。
3 根据权利要求2所述的刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，其特征在于， 所述的抗凝剂用以下方法制得先配置PH7. 6的浓度为0. 068mol/L的Tris-HCl缓冲液，然后加入 0. 02mol/L 的 EGTA，0. 34mol/L 的 NaCl，0. 018mol/L 的 KCl，最后用 0. 22 μ m 的滤器过滤即可。
4.根据权利要求2所述的刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，其特征在于， 所述的蔗糖缓冲液用以下方法制得先配置PH7. 6的浓度为0. OOlmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后加入 0. 8mol/L 的蔗糖，0. 34mol/L 的 NaCl, 0. 001mol/L 的 EGTA,最后用 0. 22 μ m 的滤器过滤即可。
5.根据权利要求2所述的刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，其特征在于， 所述的等渗缓冲液用以下方法制得先配置PH7. 6的浓度为0. 01mol/L的Tris-HCl缓冲液，然后加入0. 01mol/L的EGTA，0. 34mol/L的NaCl，最后用0. 22 μ m的滤器过滤即可。
6.根据权利要求2所述的刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，其特征在于， 所述的双抗内含100IU/ml的青霉素及100μ g/ml的链素。
7.根据权利要求2所述的刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，其特征在于， 所述的YDP液体培养基由1 %的酵母浸出汁，2%蛋白胨，2%的D-葡萄糖混合，然后灭菌制得。
全文摘要
本发明公开了一种刺参体腔细胞吞噬活性的流式细胞检测方法，属于海洋生物技术领域，首先分离、制备刺参体腔液中的吞噬细胞，然后用荧光素异硫氰酸酯FITC标记热灭活后的酵母细胞，再将标记后的酵母细胞与刺参吞噬细胞共孵育，最后利用流式细胞仪测定吞噬活性。本发明准确性高、重复性好，而且操作简便快速，为探讨刺参体腔细胞吞噬功能提供了方法依据。
文档编号G01N15/14GK102279147SQ20111006228
公开日2011年12月14日 申请日期2011年3月8日 优先权日2011年3月8日
发明者刘洪展, 孙修勤, 屈佩, 郑风荣 申请人:山东大学威海分校
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