亚星游戏官网-www.yaxin868.com

专利名称：一种基因工程单链抗体检测河豚毒素的试剂盒及方法
技术领域：
本发明涉及一种利用基因工程单链抗体检测海洋毒素的检测试剂盒，更具体地涉及了利用基因工程单链抗体检测河豚毒素(tetrodotoxin，TTX)的试剂盒，进一步涉及使用该试剂盒检测TTX的方法。
背景技术：
河豚毒素(TTX)河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种重要的海洋活性物质，因其最初分离自河豚鱼体内而得名，又称圆飩素(Spheroidine)、蝾螈毒素( Tarichatoxin )、东方豚毒素(Fugapoison)等。河豚毒素是一种非蛋白的强神经毒，其毒性较氰化钠大1000倍，属生物碱，局部麻痹作用比可卡因还强16万倍。0.5mg河豚毒素即可致人中毒死亡，Ig的河豚毒素足以杀死3000人。由于河豚毒素广泛分布于各种海洋动物、植物、微生物体内，其在自然状态下难以降解，部分降解的产物也具有一定的毒性。河豚不仅本身有毒，还可通过食物链富集，河豚毒素的这种存在状态严重地污染了海洋水域和各类海产品，对环境和食品安全存在巨大的威胁。常用的检测方法有HPLC法、表面等离子体共振、气相色谱法和单克隆抗体检测法等技术，但是这些方法或多或少存在以下问题操作过程复杂、花费大、耗时、可变性高、灵敏度低、并受待检样品量的限制、不能对特定毒素提供确定性的证据等。因此缺乏简单有效的检测方法。

发明内容
本发明的目的在于提供一种简单、有效地利用基因工程单链抗体检测河豚毒素的试剂盒及方法，使得河豚毒素的检测过程简便易行，省时、省力、省钱，
本发明的技术方案如下
本发明的利用基因工程单链抗体检测海洋毒素的试剂盒，其试剂包括
(1)样品提取液:pH7.2 的 0. 02 mol/L 的 PBS ；
(2)标准试剂=BSA-TTX毒素；
(3)酶标抗原试剂为含BSA-TTX-HRP偶联蛋白的ρΗ7· 2的0. 02 mol/L的PBS溶液， 保存于体积比50%的甘油内，-20°C保存，效价为5000 ；使用时用PBS溶液稀释；
(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0.05%的吐温-20，20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；
(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% (体积比)H2O2 ；
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。使用上述利用基因工程单链抗体检测海洋毒素的试剂盒检测TTX毒素的方法，依次包括以下步骤(1)样品处理在Ig样品中加入細1样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取、离心，上清液即为含样品的提取液；
含样品的提取液取与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成A试剂；
标准试剂取系列浓度分别与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成系列浓度的B试剂；所述酶标抗原试剂使用时先用PBS溶液稀释；
(2)试剂平衡将试剂盒平衡至室温；
(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板上，标记1号孔为阴性孔，2— 6号孔为T-2毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗TTX毒素单链抗体；
(4)洗涤每孔内加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤一次；
(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干；每孔加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线， 根据标准曲线得到样品中TTX的浓度，根据计算公式TTX含量(yg/g) =C*V / m，其中 C-TTX的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m_样品质量，g ；计算样品中TTX的含量。所述抗TTX毒素单链抗体的制备方法如下使用Trizol试剂盒从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，反转录成cDNA，经PCR扩增cDNA的重链可变区Vh基因和轻链可变区\基因， PCR扩增程序为 94°C 5 min ；94°C 45s, 55°C 45s, 72°C 45s，33循环；72°C延伸 10 min;然后的琼脂糖凝胶电泳，验证PCR扩增产物；由于PCR产物均只有一条带，回收Vh和八的 PCR 产物。通过一段连接肽(Linker，Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly %10将Vh和八连接成单链抗体(scFv)，形成单链抗体，然后将其克隆到载体 (pCANTAB 5E)上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对TTX毒素具高亲和力的抗 TTX毒素单链抗体。所述抗TTX毒素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。本发明提供了一种基因工程单链抗体，其结构如图1所示。该单链抗体(scFv)是用基因工程方法将345 bp的抗体重链可变区(Vh)和325 bp的轻链可变区通过一段连接肽(Linker)连接而成的重组蛋白；如图2所示抗TTX毒素单链抗体(scFv)的大小为 750 bp ；该单链抗体(scFv)保持了亲本抗体的抗原亲和活性和特异性的最小功能性抗体片段，可在细菌中大规模经济生产，使得用于免疫检测的抗体生产简便和经济，大大减少了诊断试剂的费用。本发明试剂盒的最小检出量为50μ g/Kg。本发明的显著优点
本发明的试剂盒中采用的抗TTX毒素单链抗体可以在大肠杆菌中高效表达，并可大规模生产，制备过程简便易行，省时省力省钱。利用本发明的试剂盒检测TTX毒素，在1. 5-2 h 时间内即可确定样品是否受TTX毒素污染，以及所含TTX毒素的量，使用方便快捷，成本低廉
/TlK。


图1是本发明的单链抗体结构示意图； 图2是本发明的单链抗体基因scFv扩增的电泳图； 图3是本发明的单链抗体竞争ELISA检测曲线图。
具体实施例方式以下为本发明的具体实例，进一步描述本发明，但是本发明不仅限于此。实施例1
按以下配方制作利用基因工程单链抗体检测河豚毒素的试剂盒
(1)样品提取液:pH7.2 的 0. 02 mol/L 的 PBS ；
(2)BSA- TTX 毒素标准试剂分别为含 0. 1，0. 2,0.4,0.8,1.6 μ g/mL 的 BSA- TTX
毒素样品；
(3)酶标抗原试剂为含BSA-TTX-HRP偶联蛋白的ρΗ7· 2的0. 02 mol/L的PBS溶液， 保存于体积比50%的甘油内，-20°C保存，效价为5000 ；使用时用PBS溶液稀释；
(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0.05%吐温-20，20mmol/L Tris — HCl， 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；
(5)BSA试剂含5% BSA的TNT溶液；
(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% H2O2 ；
(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。根据上述试剂盒按以下程序检测TTX毒素
(1)样品处理在1g河豚样品(或鲍鱼、带鱼、扇贝、小黄鱼等鱼肉样品)中加入細1样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取10 min，5000rpm，离心10 min，上清液即为含样品的提取液；
含样品的提取液取100 μ 1与100 μ 1酶标抗原试剂混和均勻，即成A试剂；
系列浓度的BSA- TTX毒素标准试剂0. 1，0. 2,0.4,0.8,1.6 yg/mL各100 μ L 分别与100 μ L酶标抗原试剂混和均勻，即成系列浓度的B试剂；所述酶标抗原试剂使用时用PBS溶液稀释(5毫升PBS溶液中加1 μ L酶标抗原试剂)；
(2)试剂平衡将试剂盒自-20°C冰箱取出，放置15min以上，平衡至室温；
(3)小孔编号根据需要取出酶标条放置在反应板支架上。1号孔为阴性孔，2 6号孔为BSA- TTX毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗TTX单链抗体；所述抗TTX单链抗体制备步骤为从免疫小鼠的脾脏中提取总RNA，经反转录成cDNA， 经PCR扩增抗体重链可变区Vh基因和轻链可变区\基因，通过一段连接肽(Linker)把Vh 和\连接成单链抗体(scFv)，然后克隆到载体上构建噬菌体抗体文库，再通过生物淘选以获得对TTX具高亲和力的单链抗体。(4)洗涤每孔加入250 μ L洗涤液，洗液不得溢出，放置^iiin后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板一次；
(5)加样1号孔加上50 PL BSA试剂，2 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L,样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；
(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；
(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干。每孔加入250PL洗涤液，洗液不得溢出， 放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗板4次；
(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15
min ；
(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50μ L，然后用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线。通过抗TTX单链抗体上的E-tag将抗TTX单链抗体与固定于酶标条上的抗E_tag 抗体结合，形成固相抗体；加入待测样品和酶标抗原试剂，样品中的抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，待测样品中抗原含量越高，则与固相抗体结合的越多，使得酶标抗原与固相抗体结合的机会就越少，甚至没有机会结合，这样加入底物后就不显色或显色很浅，显色深者为阴性。如表1所示，随着所加入的标准浓度BSA- TTX毒素的浓度的逐步升高，相对应的吸光值OD值逐步减少。根据此数据绘制的BSA- TTX毒素标准浓度曲线如图3所示，0D450 nm处吸光值与待测样品的浓度呈反比关系，因此根据待测样品的0D450 nm处吸光值就可判断样品中含有的TTX的浓度。根据计算公式样品中TTX含量(μ g/g) = C*V / m，其中C_样品中TTX的浓度， μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；计算样品中TTX的含量。当吸光值为 0. 993 时，TTX 含量0. 2*4 /1 = 0. 8 μ g/g。
表1本发明的单链抗体的竞争ELISA检测的吸光值
注浓度为Ong/mL时，为酶标抗原试剂和等体积的PBS，其他样品孔除了酶标抗原试剂外，还分别加入等体积的BSA- TTX毒素标准试剂(浓度分别为0. 1，0. 2,0. 4，0. 8，1. 6 μ g/mL)。
权利要求
1.一种基因工程单链抗体检测河豚毒素的试剂盒，其特征在于其试剂包括(1)样品提取液:pH7.2 的 0. 02 mol/L 的 PBS ；(2)标准试剂=BSA-TTX毒素；(3)酶标抗原试剂为含BSA-TTX-HRP偶联蛋白的ρΗ7· 2的0. 02 mol/L的PBS溶液， 保存于体积比50%的甘油内，-20°C保存，效价为5000 ；使用时用PBS溶液稀释；(4)洗涤液TNT溶液；配方组份体积比为0.05%的吐温-20，20 mmol/L Tris-HCl, 150 mmol/L NaCl，pH 7. 4 ；(5)BSA试剂含5% (重量比)BSA的TNT溶液；(6)显色底物10ml 显色液；配方组份250 μ L 20 mg/mL DAB,40 μ L 40 mg/mL NiCl，9. 75 ml 的 1. 0 mol/L Tris-HCl (pH 6. 8)，_20°C保存；使用时加 7 μ L 30% (体积比)H2O2 ；(7)终止液去离子水中含0.1 mol / L亚硫酸钠，2 mol / L硫酸。
2.一种使用基因工程单链抗体检测河豚毒素的试剂盒的方法，其特征在于依次包括以下步骤(1)样品处理在Ig样品中加入样品提取液，液氮或机械研磨粉碎，超声萃取、离心，上清液即为含样品的提取液；含样品的提取液取与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成A试剂；标准试剂取系列浓度分别与酶标抗原试剂等体积混和均勻，即成系列浓度的B试剂；所述酶标抗原试剂使用时先用PBS溶液稀释；(2)试剂平衡将试剂盒平衡至室温；(3)小孔编号取出酶标条放置在反应板上，标记1号孔为阴性孔，2— 6号孔为T-2毒素标准对照孔，其余孔为样品孔；酶标条每孔内已经有固相化抗TTX毒素单链抗体；(4)洗涤每孔内加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出孔外，放置aiiin后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤一次；(5)加样1号孔加上50PL BSA试剂，2 — 6号孔分别加入系列浓度的B试剂50 μ L, 样品孔加入相应的A试剂50 μ L，轻轻震荡，使各孔混勻；(6)反应将反应板放入37°C恒温箱中孵育30 min ；(7)洗涤取出反应板，去掉反应液，拍干；每孔加入200 300μ L洗涤液，洗涤液不得溢出，放置2 min后，去掉洗涤液，在吸水纸上拍干，重复洗涤4次；(8)显色每孔加入显色底物100μ L，摇勻，将反应板放入37 °C恒温箱中存放15min ；(9)终止与仪器测定每孔分别加入终止液50yL，然后用酶标仪在450 nm处测定各孔的吸光值A，以B试剂的系列浓度为横坐标，以其相应的吸光值A为纵坐标绘制标准曲线， 根据标准曲线得到样品中TTX的浓度，根据计算公式TTX含量(μ g/g) =C*V / m，其中 C-TTX的浓度，μ g/mL ；V-样品提取液的体积，mL ；m-样品质量，g ；计算样品中TTX的含量。
3.根据权利要求2所述使用基因工程单链抗体检测海洋毒素的试剂盒的方法，其特征在于步骤(3)所述抗TTX毒素单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示。
全文摘要
本发明提供了一种基因工程单链抗体检测河豚毒素的试剂盒及方法，本发明的试剂盒中，其试剂包括其试剂包括样品提取液、标准试剂、酶标抗原试剂、洗涤液、BSA试剂、显色底物、终止液。通过样品处理、试剂平衡、洗涤、加样、洗涤、显色、终止，计算样品中河豚毒素的含量。本发明的试剂盒中采用的抗河豚毒素单链抗体可以在大肠杆菌中高效表达，并可大规模生产，制备过程简便易行，省时省力省钱。利用本发明的试剂盒检测河豚毒素，在1.5-2h内即可确定样品是否受河豚毒素污染，以及计算所含河豚毒素的量，使用方便快捷，成本低廉。
文档编号G01N33/53GK102175847SQ201110027079
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月26日 优先权日2011年1月26日
发明者庄振宏, 杨燕凌, 林玲, 汪世华, 王磊, 袁军, 高媛媛 申请人:福建农林大学