专利名称：利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法及其专用表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术产品应用领域中蛋白干涉的方法，特别是涉及一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法及其专用表达载体。
背景技术：
蛋白质是机体生命活动的重要体现者，其缺失或过量表达都将导致严重的缺陷病症，通过直接手段研究蛋白质的功能将为其相关疾病的治疗提供重要手段。目前常用于研究蛋白质功能的模式生物主要有秀丽线虫，小鼠和真核生物细胞等。其中，秀丽线虫因其细胞数量明确、遗传背景清楚、基因组小及易于操作等优点已广泛应用于遗传学、发育生物学、神经生物学和分子生物学等多个研究领域(Greer et al. Members of the H3K4 trimethylation complex regulate lifespan in a germline-dependent manner in C. elegans. Nature. 2010 Jul 15,466(7304) :383-7)。基于秀丽线虫平台规模化筛选其体内功能性蛋白的作用已成为目前研究的热点。传统基因水平上的显微注射和RNA干涉虽能到达研究秀丽线虫体内功能蛋白的作用，但由于其存在操作繁琐、成本高、周期长及破坏性大等缺点，更甚至于会出现功能蛋白不表达的现象，使秀丽线虫体内重要功能蛋白的研究及相应表型的筛选受到了极大限制(Rieckher et al. Transgenesis in Caenorhabditis elegans. Methods Mol Biol.2009,561 :21-39 ；Shyu et al. Visualization of protein interactions in living Caenorhabditis elegans using bimolecular fluorescence complementation analysis. Nat Protoc. 2008,3(4) :588-96.)。通常情况下，很多蛋白质是通过与其相互作用的蛋白质发生作用即所谓的蛋白质——蛋白质相互作用 (protein-protein interaction，PPI)从而实现其特定功能。基于此，向秀丽线虫体内引入一种能够与秀丽线虫体内已有的蛋白质发生相互作用导致原有蛋白调控网络异常从而形成功能干涉，或者直接向秀丽线虫体内引入两种或两种以上可在秀丽线虫体内通过蛋白质相互作用导致原有蛋白调控网络异常从而形成功能干涉的蛋白质，有可能对于揭示蛋白质之间的相互作用以及确定重要蛋白的功能具有重要意义。这一思路尚未见诸于已有文献。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的专用表达载体。本发明所提供的专用表达载体，是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。所述蛋白转导肽可为TAT、Antp, VP22、Poly(Arg)和/或Poly (Lys)等，优选为 TAT。用于构建所述原核表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体，
4如 pET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT_T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等，优选为 pET28。本发明的第二个目的是提供一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法。本发明所提供的利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法，是将待鉴定的具有相互作用的靶蛋白各自编码基因插入前述专用表达载体中，将得到的原核表达载体转化入大肠杆菌并诱导表达，得到的重组大肠杆菌喂饲正常株系秀丽线虫，根据秀丽线虫生物及生化指标检测结果评估相互作用蛋白发生干涉的能力和强度。具体可包括以下步骤1)确定至少一对具有相互作用的功能蛋白(包括诱饵蛋白和猎物蛋白)为靶蛋白并分别克隆其编码基因；2)将靶蛋白编码基因分别插入上述专用表达载体中，得到含有蛋白转导肽编码区和靶蛋白编码基因相融合的原核表达载体；3)将步骤2)构建的原核表达载体分别转化入大肠杆菌原核表达系统；4)原核表达载体的诱导表达及蛋白表达水平检测；5)将体外表达各靶蛋白的重组大肠杆菌单独或混合喂饲正常株系秀丽线虫；6)秀丽线虫生物及生化指标检测并评估靶蛋白之间发生干涉的能力和强度。所述步骤1)中靶蛋白可以是单个的功能蛋白，也可以是两个或多个具有相互作用的功能蛋白。该蛋白可以是秀丽线虫自身蛋白，也可以是其他物种中具有潜在相互作用的蛋白。在上述利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法中，所述步骤3)中大肠杆菌原核表达系统的宿主菌可为BL21、DH5 α、HBlOl、JM109、0Ρ50或耐
辐射奇球菌等。上述重组表达载体和重组菌均可按照常规方法构建。所述步骤4)中可采用化学试剂诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达， 其中，化学试剂诱导表达条件可为采用500mL摇瓶发酵(150mL/瓶)；诱导剂IPTG诱导表达(终浓度ImM)；诱导表达的OD6tltl = 0. 6-1. 0 ；诱导表达时间6_8小时。所述步骤4)中还可采用温度诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达，其中，温度诱导表达条件可为采用500mL摇瓶30°C发酵(150mL/瓶)；诱导表达的0D_ = 0. 4-0. 6 ；诱导表达温度42°C -44°C ；诱导表达时间6_8小时。此外，所述步骤4)中的蛋白表达水平检测可采用SDS-PAGE和/或免疫印迹法。所述步骤5)中喂饲秀丽线虫的大肠杆菌是步骤4)中鉴定表达靶蛋白的菌株且预先涂布到NGM平皿或LB平皿中；其喂饲方式可以为单独喂饲或按一定比例如1 5、1 2、 1 1、2 1、5 1的方式混合喂饲。所述步骤6)中秀丽线虫生物及生化指标检测，生物指标具体包括形态结构变化和细胞水平变化等，如是否出现体型变小或肥胖、是否出现空泡现象、是否出现运动行为失调等；生化指标具体包括靶蛋白或其调控因子表达水平检测，如蛋白质，DNA和RNA等。其表达水平检测可以为免疫印迹，凝胶迁移实验和聚合酶链式反应等。本发明结合蛋白转导域家族的研究，以及利用秀丽线虫的主要食物来源大肠杆菌为中介，提供了一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法及其专用表达载体。本发明所述蛋白干涉(protein interfere)是指通过给秀丽线虫喂饲能够表达可与秀丽线虫体内的靶蛋白相互作用的功能蛋白的微生物如大肠杆菌，从而可导致在秀丽线虫体内出现该功能蛋白被通过相互作用而发生干涉作用后产生表型异常的技术， 同时还包括直接将两种或两种以上可表达能够相互作用的功能蛋白的微生物如大肠杆菌直接喂饲秀丽线虫，通过在秀丽线虫体内发生两种蛋白之间的相互作用可导致秀丽线虫出现特定表型的技术，即基于秀丽线虫的“双杂交”反应(C. elegans two-hybridization, C2H)。本发明不仅能够克服常规基于模式生物秀丽线虫研究功能蛋白方法的缺陷，而且可以通过微生物如大肠杆菌直接转导体外高效表达的功能蛋白，避免了功能性基因不表达的现象，进而节约了特异功能蛋白筛查及大规模研究的成本等。同时，迄今为止未见利用蛋白转导肽的跨膜转导作用并依赖大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的研究报道。本发明提供的利用大肠杆菌原核表达系统从蛋白质角度干涉秀丽线虫体内功能蛋白的方法，具有十分广泛的应用前景，有望成为重组蛋白类药物筛选的重要技术手段，同时也将有可能成为蛋白质功能研究的重要技术之一。本发明利用秀丽线虫平台及原核表达体系首次提出了蛋白干涉的作用，为基于蛋白功能的研究及载体筛选提供重要的技术平台，具有重要的原创性和新颖性。下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1 原核表达载体pET28b-Tat_EGFP和pET28b_EGFP的构建示意图。图 2 =SDS-PAGE 和 Western blot 检测 Tat-EGFP 和 EGFP 蛋白的表达。图3 荧光显微镜观察表达EGFP的菌体细胞的荧光信号。图4 荧光显微镜观察TAT-EGFP和EGFP蛋白荧光信号在秀丽线虫体内分布变化。
图5 原核表达载体pEI^8-Tat-Hif_l和pEI^8_Hif-l构建的菌液PCR鉴定结果。图6 原核表达载体pET28-Tat-VHL_l和pET28-VHL_l构建的菌液PCR鉴定结果。图7 =SDS-PAGE检测Tat-Hif-I和Hif-I蛋白的表达变化，图中箭头所示为靶蛋白 Tat-Hif-I和Hif-I所在位置。图8 =SDS-PAGE检测Tat-VHL-I和VHL-I蛋白的表达变化，图中箭头所示为靶蛋白 Tat-VHL-I和VHL-I所在位置。
具体实施例方式实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。实施例1、利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的专用表达载体的构建可采用任何已知的方法构建利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的专用表达载体，该专用表达载体是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体，所述蛋白转导肽为TAT、Antp、VP22、Poly(Arg)和/或Poly(Lys)等，用于构建所述原核表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体，如PET28、pBV220、pET30、pCRT7/CT-T0P0、pET101/D-T0P0 或 pQE30 等。本实施例以 pET28b 为出发载体构建含有TAT的重组表达载体为例，介绍了一种构建秀丽线虫体内功能蛋白干涉的专用表达载体的方法，含有其它蛋白转导肽的重组表达载体也可参照此方法构建，具体构建方法为首先通过化学合成的方法合成含有酶切位点为NcoI (上游)和NdeI (下游)的双链TAT肽段(GenBank :ADK70247. 1)的核心编码序列片段，然后采用限制性内切酶NcoI和 NdeI双酶切该TAT核心片段和空载体pET28b (美国Novagen公司)，分别回收目的片段后， 经T4 DNA连接酶连接经酶切的TAT DNA片段和空载体片段，再将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞BL21 (DE3)中，筛选重组子，按照常规方法提取重组子的质粒DNA并进行NcoI 和NdeI双酶切鉴定，最后送英骏公司直接测序，确证含有TAT核心片段的原核表达载体构建成功，将该重组载体命名为pET28b-TAT。实施例2、利用大肠杆菌原核表达系统实现绿色荧光蛋白在正常株系秀丽线虫体内跨膜转导 1)原核表达载体pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的构建及诱导表达首先以质粒pEGFP-Nl (购自Clontech公司)为模板并利用引物对(斜体部分分别为 BamHI 和 XhoI 酶切位点pU_5，_CGC GGATCCk TGGTGAGCAAGGGCGAG-3，(序列表中序列 1) ；pD_5，-CCG 67Cfi46CTTGTACAGCTCGTCCAT-3，(序列表中序列 2)进行 PCR 扩增获得增强型绿色荧光蛋白(EGFP，GenBank号ADQ73885. l)cDNA编码序列(717bp)，然后采用限制性内切酶BamHIAhoI双酶切目的基因EGFP和质粒载体ρΕΤ2^3和ρΕΤ2^3-ΤΑΤ ；酶切产物回收后采用Τ4 DNA连接酶于16°C连接过夜；次日，将转化产物全部转化入大肠杆菌BL21(DE3) 并采用限制性内切酶酶切和直接测序鉴定。酶切和测序鉴定结果表明获得了携带有蛋白转导肽TAT核心肽段的绿色荧光蛋白的原核表达载体pET28b-TAT-EGFP和仅携带有绿色荧光蛋白的原核表达载体pET28b-EGFP，构建方法示意图如图1所示。2)随后，将转化有质粒载体pET28b-TAT-EGFP和pET28b_EGFP的宿主菌 BL2KDE3)涂布到含有卡那霉素(终浓度100yg/ml)的LB固体培养基，37°C恒温箱孵育 10-12小时待长出克隆。次日，挑取阳性克隆接种到5ml含有卡那霉素(终浓度ΙΟΟμ g/ml) 的LB液体培养基中，37°C、220rpm摇菌过夜使菌体完全复苏；然后按照1 100的比例将菌液接种到150ml新配置的含有卡那霉素(终浓度100 μ g/ml)的LB液体培养基中，37°C、 220rpm摇菌约4_5小时，待0D_为0. 6-1. O时加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl β -D-l-Thiogalactopyranoside, IPTG)，终浓度 ImM)，迅速置于 30°C、220rpm 摇床诱导表达6小时，并于第2小时，第4小时和第6小时收集菌体细胞，部分菌体细胞待荧光显微镜观察，其余菌体细胞超声破碎后直接制备上清蛋白样品待SDS-PAGE和Western blot检测。SDS-PAGE和Wfestern blot检测方法为A、将上述超声破碎后直接制备的上清蛋白样品采用15% SDS-PAGE分离，然后采用考马斯亮蓝R-250染色并脱色，最后采用凝胶成像仪采集图像；B、随后，将上述制备的上清蛋白样品经15% SDS-PAGE分离后按照说明书所述方法转印到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭30分钟；其次采用EGFP(TBST 1 3000 稀释)和GAPDH(TBST 1 500稀释)单克隆抗体室温共孵育1. 5小时，TBST室温洗膜三次(10分钟/次)；然后采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000 稀释)室温孵育30分钟，TBST室温洗膜三次(10分钟/次)；最后采用ECL化学发光检测试剂盒显影并扫描，以pET28b和pET28b-TAT为空载体对照。结果如图2所示(图中箭头所示分别为内标蛋白GAPDH，TAT-EGFP和EGFP蛋白条带所在位置)，表明通过体外诱导表达及SDS-PAGE和免疫印迹检测发现实现了绿色荧光蛋白的高效可溶性表达。3)诱导表达菌体的荧光显微镜观察将上述诱导表达的菌体细胞采用10 μ 1接种环均勻地涂布到干净的载玻片上，待其自然风干后采用荧光显微镜观察菌体细胞荧光信号，分别采集诱导表达不同时间点菌体细胞的荧光图像及微分干涉图像，最后通过图像合并技术观察TAT-EGFP和EGFP在大肠杆菌细胞中的表达情况，以pET28b和pET28b-TAT为空载体对照。诱导表达菌体荧光显微镜观察结果如图3所示(荧光显微镜观察不同诱导时间菌体细胞荧光信号图中表示针对诱导表达不同时间的菌体细胞进行荧光信号的检测0h(A) ,2h(B)、4h(C) ,6h(D))，随着诱导表达时间的增加，菌体细胞中表达的绿色荧光蛋白在增加。4)正常株系秀丽线虫的喂饲及荧光显微镜观察将诱导表达TAT-EGFP和EGFP融合蛋白的大肠杆菌BL21 (DE3)菌体细胞涂布到 LB平皿中，待其室温稍干后置于20°C生化培养箱培养72小时待大量克隆长出，挑取正常株系秀丽线虫20只于20°C生化培养箱培养并采用荧光显微镜观察TAT-EGFP和EGFP荧光信号在秀丽线虫体内分布，并于喂饲第48小时采集荧光图像和微分干涉图像，最后通过图像合并技术观察TAT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀丽线虫体内的分布情况，以pET28b和 pET28b-TAT为空载体对照。荧光显微镜观察TAT-EGFP和EGFP蛋白荧光信号在秀丽线虫体内分布变化如图4所示(图中箭头所示为TAT-EGFP和EGFP融合蛋白在秀丽线虫体内的分布位置)，通过直接喂饲秀丽线虫表达靶蛋白的大肠杆菌细胞48小时后，TAT-EGFP荧光信号明显分布于秀丽线虫肠壁细胞，而EGFP荧光信号则分布在秀丽线虫肠腔，空载体对照组未见任何荧光信号，说明TAT蛋白转导肽能够高效介导外源蛋白在秀丽线虫体内跨膜转导。同时，通过比较空载体对照组与实验组秀丽线虫微分干涉图像未见其出现明显的细胞形态变化，由此说明TAT蛋白转导肽具有相对安全的跨膜转导作用，能够介导外源蛋白跨膜转导进入秀丽线虫肠壁细胞，为后续基于秀丽线虫平台及原核表达体系研究秀丽线虫体内功能蛋白的干涉提供了技术支持。实施例3、利用大肠杆菌原核表达系统实现正常株系秀丽线虫体内相互作用蛋白 Hif-I和VHL-I的干涉1.方法1)秀丽线虫体内部分蛋白相互作用关系分析生物体相互作用蛋白可以基于生物信息学手段深入挖掘获得或根据现有生物学数据库自行构建获得。本发明针对秀丽线虫体内部分功能蛋白对其相互作用关系进行了分析，通过分析发现在线虫体内存在相互作用且已通过实验验证的蛋白有Hif-1/VHL-l和 gpd-2/gpd-3，故本发明后续选取Hif-I和VHL-I作为具有相互作用的靶蛋白进行蛋白干涉的研究。2)原核表达载体 pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I 和 pEI^8-Tat-VHL-l/VHL_l 的构建及诱导表达参照实施例2的载体构建方法构建携带秀丽线虫Hif-I和VHL-I的cDNA编码序列及Tat转导肽序列的原核表达载体，以不含转导肽的原核表达载体为对照。首先针对正常株系秀丽线虫提取总RNA并反转录，然后以反转录产物为模板并结合以下引物对(斜体部分分别为酶切位点)pU_BamHI-Hif-I :5，-CGC GGATCCk TGGAAGACAATCGGAAAAGAAACA-3‘(序列表中序列3)pD_XhoI-Hif-I 5' -CCG CTCGAGk GAGAGCATTGGAAATGGGGAAT-3‘(序列表中序列
4)pU_BamHI-VHL-I :5，-CGC GGATCCK TGTCAGACGGTTCGATGGATGA-3‘(序列表中序列
5)pD_XhoI-VHL-I :5，-CCG CTCGAG\ TGCTGAGGTCTCTGGGGTCC-3‘(序列表中序列 6) 进行PCR扩增以获得Hif-I和VHL-I的cDNA编码序列，然后将目的基因和载体酶切后构建原核表达载体pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I和pET28-Tat-VHL-l/VHL_l，最后将上述载体酶切及直接测序确证，其中pEI^8-Tat-Hif-l由序列表序列7表示，pEI^8_Hif-l由序列表序列 8表示，pET28-Tat-VHL-l由序列表序列9表示，pET28_VHL_l由序列表序列10表示，菌液 PCR鉴定结果如图5和图6所示，随后，将上述构建正确的原核表达载体pEI^8-Tat-Hif-l/Hif-I和 pET28-Tat-VHL-l/VHL-l分别转化入宿主菌BL21(DE3)并涂布到含有卡那霉素(终浓度 100yg/ml)的LB固体培养基，37°C恒温箱孵育10-12小时待长出克隆。次日，挑取阳性克隆接种到5ml含有卡那霉素(终浓度ΙΟΟμ g/ml)的LB液体培养基中，37°C、220rpm摇菌过夜使菌体完全复苏；然后按照1 100的比例将菌液接种到150ml新配置的含有卡那霉素(终浓度ΙΟΟμ g/ml)的LB液体培养基中，37°C、220rpm摇菌约4_5小时，待0D_为 0. 6-1. 0时加入诱导剂异丙基-β -D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β -D-I-Thiogalactopyra noside, IPTG)，终浓度ImM)，迅速置于30°C、220rpm摇床诱导表达6小时，并于第2小时， 第4小时和第6小时收集菌体细胞并超声破碎后直接制备总蛋白，上清蛋白和沉淀蛋白样品待SDS-PAGE和Western blot检测。SDS-PAGE和Western blot检测方法为Α、将上述超声破碎后直接制备的蛋白样品采用15% SDS-PAGE分离，然后采用考马斯亮蓝R-250染色并脱色，最后采用凝胶成像仪采集图像；B、将上述制备的上清蛋白样品经15% SDS-PAGE 分离后按照说明书所述方法转印到PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭30分钟；其次采用 6XHis(TBST 1 3000稀释)单克隆抗体室温共孵育1.5小时，TBST室温洗膜三次(10分钟/次)；然后采用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG 二抗(TBST 1 5000稀释)室温孵育30分钟，TBST室温洗膜三次(10分钟/次)；最后采用ECL化学发光检测试剂盒显影并扫描，以pET28b和pET28b-TAT为空载体对照。SDS-PAGE检测结果如图7 (图中箭头所示为靶蛋白Tat-Hif-I和Hif-I所在位置)和图8(图中箭头所示为靶蛋白Tat-VHL-I和 VHL-I所在位置)所示，显示体外可溶性表达制备了 Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-I/VHL-I 蛋白，特别是Tat-Hif-I和Tat-VHL-Ι，为后续基于二者进行蛋白干涉功能的研究奠定了重要·石出。3)正常株系秀丽线虫的喂饲及其生物和生化指标检测a)单独喂饲正常株系秀丽线虫表达Tat-Hif-I和Hif-I融合蛋白的菌体细胞将诱导表达Tat-Hif-I和Hif-I融合蛋白的大肠杆菌BL21 (DE3)菌体细胞涂布到 LB或NGM平皿中，待其室温稍干后置于20°C生化培养箱培养72小时待大量克隆长出，挑取正常株系秀丽线虫20只于20°C生化培养箱培养48小时。然后挑取秀丽线虫至不同浓度的亚硫酸钠溶液(lg/L、2g/L和5g/L)进行低氧应激测试并统计其死亡率，进而评估其抗低氧能力。通过系统检测及统计分析发现，与对照组pET28b-Tat和pET28b相比，喂饲表达 Tat-Hif-I大肠杆菌的线虫表现出明显的抗低氧作用，主要表现在咽部肌肉和神经元的肿胀程度降低、运动性增强，而喂饲表达Hif-I大肠杆菌的线虫只有微弱的抗低氧作用，表现出对低氧损伤敏感的表型。b)单独喂饲正常株系秀丽线虫表达Tat-VHL-I和VHL-I融合蛋白的菌体细胞将诱导表达Tat-VHL-I和VHL-I融合蛋白的大肠杆菌BL21 (DE3)菌体细胞涂布到LB或NGM平皿中，待其室温稍干后置于20°C生化培养箱培养72小时待大量克隆长出， 挑取正常株系秀丽线虫20只于20°C生化培养箱培养48小时。然后挑取秀丽线虫至不同浓度的亚硫酸钠溶液(lg/L、2g/L和5g/L)低氧应激测试并统计其死亡率，进而评估其低低氧能力。通过系统检测及统计分析发现，与对照组pET28b-Tat和pET28b相比，喂饲表达Tat-VHL-I蛋白的大肠杆菌的线虫表现出明显的对缺氧敏感，死亡率较高，而喂饲表达 VHL-I蛋白的大肠杆菌的线虫表现为对缺氧不敏感，死亡率没有明显变化，同时，对照组亦无明显变化。c)混合喂饲正常株系秀丽线虫表达Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-1/VHL-1融合蛋白的菌体细胞将诱导表达Tat-Hif-I/Hif-I和Tat-VHL-1/VHL-1融合蛋白的大肠杆菌 BL21(DE3)菌体细胞按照1 1比例混勻后涂布到LB或NGM平皿中，待其室温稍干后置于 20°C生化培养箱培养72小时待大量克隆长出，挑取正常株系秀丽线虫20只于20°C生化培养箱培养48小时。然后挑取秀丽线虫至不同浓度的亚硫酸钠溶液(lg/L、2g/L和5g/L)进行低氧应激损伤并统计其死亡率，进而评估其抗缺氧能力。通过系统检测及统计分析发现， 与对照组pET28b-Tat和pET28b相比，混合喂饲表达Tat-Hif-I和Tat-VHL-I蛋白的大肠杆菌的线虫未见明显的变化，说明高表达的Tat-Hif-I与高表达的Tat-VHL-I通过相互作用即蛋白干涉而抵消其功能；混合喂饲表达Tat-Hif-I和VHL-I蛋白的大肠杆菌的线虫出现抗缺氧活性，说明高表达的Tat-Hif-I仍可发挥其功能；混合喂饲表达Tat-VHL-I和Hif-I 蛋白的大肠杆菌的线虫表现为对缺氧敏感，说明高表达的Tat-VHL-I仍可发挥其功能；而混合喂饲表达Hif-I和VHL-I蛋白的大肠杆菌的线虫未见明显的变化，说明均为低表达的 Hif-I和VHL-I未形成有效的蛋白相互作用从而未发挥蛋白干涉作用。上述结果说明在大肠杆菌中通过蛋白转导肽促进高表达的Tat-Hif-I和 Tat-VHL-I可在秀丽线虫体内发生功能性相互作用即蛋白质干涉现象，从而可反过来说明本发明的技术可用于在秀丽线虫中通过十分便捷的喂饲方法研究蛋白质相互作用，为蛋白质——蛋白质相互作用(PPI)的研究提供了一种新技术。
权利要求
1.一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的专用表达载体， 是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。
2.根据权利要求1所述的专用表达载体，其特征在于所述蛋白转导肽为TAT、Antp, VP22、Poly (Arg)和 / 或 Poly (Lys)，优选为 TAT。
3.根据权利要求1所述的专用表达载体，其特征在于用于构建所述原核表达载体的出发载体可为任意一种外源基因的原核表达载体，如PET28、pBV220、pET30、pCRT7/ CT-TOPO, pETlOl/D-TOPO 或 pQE30，优选为 pET280
4.一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法，是将待鉴定的具有相互作用的靶蛋白各自编码基因插入权利要求1-3任一所述专用表达载体中，将得到的原核表达载体转化入大肠杆菌并诱导表达，得到的重组大肠杆菌喂饲正常株系秀丽线虫，根据秀丽线虫生物及生化指标检测结果评估相互作用蛋白发生干涉的能力和强度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于包括以下步骤1)确定可能具有相互作用的靶蛋白并分别克隆其编码基因；2)将靶蛋白编码基因分别插入所述专用表达载体中，得到含有蛋白转导肽编码区和靶蛋白编码基因相融合的原核表达载体；3)将步骤2)构建的原核表达载体转化入大肠杆菌原核表达系统；4)原核表达载体的诱导表达及蛋白表达水平检测鉴定；5)将步骤幻得到并经步骤4)鉴定的体外表达靶蛋白的重组大肠杆菌单独或混合喂饲正常株系秀丽线虫；6)检测秀丽线虫生物及生化指标并评估靶蛋白之间发生干涉的能力和强度。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于所述靶蛋白可以是单个的功能蛋白， 也可以是两个或多个具有相互作用的功能蛋白；该蛋白可以是秀丽线虫自身蛋白，也可以是其他物种中具有潜在相互作用的蛋白。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于所述步骤3)中大肠杆菌原核表达系统的宿主菌为BL21、DH5a、HBlOl、JM109、0P50或耐辐射奇球菌。
8.根据权利要求4或5或6或7所述的方法，其特征在于所述诱导表达为采用化学试剂诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达，其中，化学试剂诱导表达条件为诱导剂IPTG诱导表达(终浓度ImM)；诱导表达的OD6tltl = 0. 6-1. O ；诱导表达时间6_8小时；或所述诱导表达为采用温度诱导外源基因在大肠杆菌原核表达系统中表达，其中，温度诱导表达条件可为诱导表达的0D_ = 0. 4-0. 6 ；诱导表达温度42°C -44°C;诱导表达时间 6-8小时。所述步骤4)中的蛋白表达水平检测可采用SDS-PAGE和/或免疫印迹法。
9.根据权利要求4至8任一所述的方法，其特征在于所述步骤5)中喂饲秀丽线虫的大肠杆菌需预先涂布到NGM平皿或LB平皿中；混合喂饲的比例为1 5、1 2、1 1、 2 1 或5 1。
10.根据权利要求4至9任一所述的方法，其特征在于所述步骤6)中秀丽线虫的生物及生化指标检测，生物指标具体包括形态结构变化和细胞水平变化等，如产卵率变化、成虫率变化、是否出现体型变小或肥胖、是否在咽部出现空泡现象、是否出现运动行为失调等； 表观指标可通过体视显微镜观察判定；生化指标具体包括靶蛋白或其调控因子表达水平检测，如蛋白质，DNA和RNA等，其表达水平检测可以为免疫印迹、凝胶迁移实验和聚合酶链式反应等；而蛋白质干涉前后秀丽线虫的行为变化可以通过定量行为学等技术手段进行检测；根据秀丽线虫在蛋白干涉前后的表型差异可分析获得相互作用蛋白发生干涉的能力和强度。
全文摘要
本发明公开了一种利用大肠杆菌原核表达系统实现秀丽线虫体内功能蛋白干涉的方法及其专用表达载体。该载体是含有一个或多个相同或不同蛋白转导肽的原核表达载体。该方法是将待鉴定的具有相互作用的靶蛋白各自编码基因插入权利要求1-3任一所述专用表达载体中，将得到的原核表达载体转化入大肠杆菌并诱导表达，得到的重组大肠杆菌喂饲正常株系秀丽线虫，根据秀丽线虫生物及生化指标检测结果评估相互作用蛋白发生干涉的能力和强度。本发明具有十分广泛的应用前景，有望成为重组蛋白类药物筛选的重要技术手段，同时也是进行蛋白质功能研究的重要技术之一。
文档编号G01N33/68GK102311969SQ201110270320
公开日2012年1月11日 申请日期2011年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者叶巧, 吴永红, 张成岗, 张晓 , 李伟光, 石锦平, 高艳 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所
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