专利名称：检测ChIFN-γ的双单克隆抗体夹心ELISA方法
技术领域：
本发明属于免疫学检测方法领域，具体涉及检测家禽细胞因子的双单克隆抗 体夹心ELISA方法。
背景技术：
Y-干扰素(IFN-Y，又称作免疫干扰素或II型干扰素)是细胞免疫应答的重 要媒介，在机体免疫应答调节方面具有重要功能，尤其对诱导及维持Thl细胞 免疫应答具有重要作用。Thl应答对抵抗胞内病原的感染非常重要，而IFN-y分 泌性T淋巴细胞的出现是Thl应答的标志。生物样品中IFN-Y的水平及IFN-y 分泌细胞的出现通常作为评价Thl免疫应答发生的标志。
目前检测细胞因子的方法很多，主要有生物活性测定法、免疫学检测法，利 用核酸标记技术检测细胞因子等。但在复杂的生物样品中，对既定的细胞因子的 功能分析很多情况下并不能反映其实际的功能。如，在保护细胞抵抗病毒感染的 作用方面，I、 IIIFN均具有这种功能，尽管这两类IFN的结构并不是非常密切 相关的，且由不同的细胞所分泌，但如果仅从功能上进行分析，并不能准确反映 特定细胞因子的实际情况。而且，对特定的细胞因子而言，其活性半衰期很短， 导致对其功能的分析不再能进行，尽管在样品收集时，这些细胞因子是存在的，
在蛋白质水平上仍能分析，但由于其活性的半衰期很短，导致功能上的分析不再 能进行。Northern blot， RNase protection及PCR等基因分析方法均高度敏感，且 与目的基因完全匹配，但其只能停留在基因转录水平上的分析，很多信息是难以 捕获的。
因此，急需一种能够定性和定量检测生物样品中IFN-Y的检测方法。尤其是 针对胞内菌、寄生虫、病毒及其它病原引起的胞内感染，快速有效的细胞因子检 测工具及检测方法对这类疾病的检测和诊断非常有益。目前，由于缺乏有效的检 测工具及检测方法，对疾病条件下免疫状态的分析及评价很困难，为了改善这种 现状，人们进行了许多努力，如生产重组细胞因子，研制特异性抗细胞因子mAb 改进检测方法。随着单克隆抗体技术的发展，检测细胞因子的酶联免疫吸附捕获方法 (ELISA)得到了大力的发展。在其他的物种中，ELISA得到了很大的发展，并 且被证明是一种非常稳定、可信、简单、易行的细胞因子检测方法，可用于检测 经活化释放的细胞因子，因而，人们认为该方法是评价细胞免疫应答(CMI)的 很好的指示方法。而且，这种检测方法是多用途的，不但可以用于检测丝裂原或 许多病原再次刺激诱导的CMI，而且可用于检测免疫后激发的CMI。
鸡在大量的家禽胞内感染疾病方面是一个重要的动物模型，到目前为止，选 择鸡作为家禽疾病的动物模型受到了许多限制，主要是因为缺乏适当的检测工具
和检测系统。1995年Digby等成功克隆、表达出ChIFN-Y基因，对ChIFN-Y的研究 蓬勃开展，其功能研究工作也在进行当中。2000年，CheolH.等利用天然的或重 组的ChIFN-Y研制出抗ChIFN-Y mAb，并建立了直接ELISA方法检测艾美尔球虫 感染鸡的血清ChIFN-Y水平；随后，B. Lambrecht等利用基因枪免疫法制备出抗 CMFN-YmAb，并运用纯化的抗ChIFN-Y多抗作为捕获抗体，生物素标记的mAb 作为检测抗体，建立了检测CMFN-Y的双抗体夹心ELISA方法。本发明采用原核 表达的重组ChIFN-Y为免疫抗原及检测抗原，制备出抗ChIFN-YmAbs，运用纯化 的抗ChIFN-YmAb作为捕获抗体，生物素标记的mAb作为检测抗体，建立检测生 物样品中ChIFN-Y的双单抗夹心ELISA方法，该方法避免了运用多抗作为捕获抗 体，保证了包被抗体的稳定性和均一性，因为不同批次制备出的多抗可能存在很 大的差异，较难标准化，而mAb细胞株的优越性在于可以无限量地生产出具有均 一特性的mAb。
ChIFN-Y抗原捕获ELISA可以在蛋白质水平上对ChIFN-Y进行评价，较生 物学方法更为简便、实用、灵敏，便于操作和大面积使用。该方法的建立为检测 鸡CMI提供灵敏的检测工具。而且，该方法将有利于研究ChIFN-Y在家禽的不 同的免疫应答机制中的作用。
发明内容
本发明的目的在于建立一种简捷、实用、灵敏、高效的检测ChIFN-Y双单克 隆抗体夹心ELISA方法。
本发明的技术方案是检观iJChIFN-Y的双单克隆抗体夹心ELISA方法，是 采用抗ChIFN-Y特异性mAb试剂，建立检湖iJChIFN-Y特异性双mAb夹心ELISA方法。该方法以mAb3E5作为捕获抗原，以生物素标记的mAb3E3作为检测抗体， 建立检领UChIFN-Y的双mAb夹心ELISA方法。该方法可以灵敏地检测到微量的 ChIFN-Y。
上述方法具体的步骤是
① 将捕捉抗体固定在固相支持物上，其中捕捉抗体为纯化的ChIFN-Y单克隆 抗体3E5;
② 将生物样品与固相化的捕捉抗体保温，使ChIFN-Y与捕捉抗体结合；
③ 使结合到固相化捕捉抗体上的ChlFN-Y与生物素标记的抗ChlFN-Y单克隆 抗体3E3接触，来检测CMFN-Y。
所说的生物样品可分离自鸡血清、鸡血浆或细胞培养上清。
上述方法中，mAb 3E5的包被浓度为85 u g/ml， mAb 3E3的工作浓度为0.67 U g/ml。该方法可以灵敏的检测到125-500 pg/ml的CWFN-y。
应用本发明方法进行天然ChIFN-Y的检测无菌制备鸡脾脏淋巴细胞，用伴 刀豆蛋白(ConA， Sigma公司)刺激鸡脾脏淋巴细胞，取培养48小时的细胞培 养上清，获得天然ChIFN-Y，用建立的双单抗夹心ELISA方法测定天然的 ChIFN-Y,非常显著地检测到天然ChIFN- Y 。
上述夹心ELISA方法中抗体的包被缓冲液为pH 7.2的PBS，检测抗体稀释 液为含0.05% Tween 20及1% BSA的PBST， avidin-HRP的稀释液为PBST(0.05% Tween-20、 1% BSA及10%小牛血清)，TMB显色，2MH2S04终止反应。
本发明所建立的ChIFN-Y特异性捕获ELISA可以敏感的检测到经Con A刺 激的细胞培养上清中存在的天然ChIFN-Y。所建立的ELISA方法为评价Thl细 胞免疫应答提供了很好的检测工具。
图1是鸡干扰素-Y双单抗夹心ELISA方法的敏感性实验(His-ChIFN-Y的浓度为1 000ng/ml，系列倍比稀释进行)单抗3E5作为捕获抗体，生物素标记的单抗3E3 作为检测抗体，可以检测到125-500 pg/ml重组鸡，干扰素(His-ChIFN-Y)
图2双单抗夹心ELISA的特异性实验双单抗夹心ELISA检测系列倍比稀释的重组 鸡Y-干扰素(His-ChIFN-Y， 20ng/ml)及天然鸡？干扰素(Con A刺激鸡脾脏淋巴细胞所产 生)鸡？干扰素双单克隆抗体夹心ELISA的特异性实验(His-ChIFN-Y 20 ng/ml，系列倍比稀释进行；Con A刺激72 h的鸡脾脏淋巴细胞培养上清，倍比稀释进 行，X轴以Log2为单位)
图3双单抗夹心ELISA检测不同数量鸡脾脏淋巴细胞(lxloe个细胞/ml、 2.5xl(^个细 胞/ml、 5xl(^个细胞/ml)经ConA (12ug/ml)刺激，不同培养时间段(24小时、48小时、 72小时、96小时)细胞上清中鸡Y-干扰素。鸡Y干扰素双单抗夹心ELISA检测不同数量鸡 脾脏淋巴细胞(lxl()S个细胞/ml、 2.5xl()S个细胞/ml、 5><106个细胞/1 1)培养上清中鸡y-干 扰素(ConA: 12ng/ml)
具体实施例方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明， 一般具有本领域普通技术人员 通常理解的含义。
下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这 些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方 法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标 明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
本发明中抗CMFN-Y特异性单克隆抗体3E3、 3E5、 IGIO、 2C3分别是由杂 交瘤细胞株3E3、 3E5、 1G10、 2C3分泌，其中杂交瘤细胞株3E3、 3E5、 1G10、 2C3 (抗鸡Y-干扰素单克隆抗体的研制及鉴定，扬州大学杂志(农业与生命科学 版)，2007， 28(4): 6-9.)由扬州大学的人兽共患病学重点实验室构建保存，自 申请日起20年内向公众提供。
实施例1:本发明检测ChIFN-Y的双单克隆抗体夹心ELISA方法的确立 1.纯化和标记抗CMFN-Y特异性单克隆抗体3E3、3E5、 1G10、2C3(mAbs)， 采用Proein G纯化mAb，用生物素标记mAb，具体操作按照标准方法进行。2. ChlFN々抗原捕获ELISA的初步确立以原核表达的rChlFN-^y作为捕
获抗原(抗鸡Y-干扰素单克隆抗体的研制及初步鉴定，细胞与分子免疫学杂志， 2006， 22(4): 510-512)，将上述标记的3E3、 3E5、 1G10、 2C3mAbs与市售的 mAbs(如Abs: Serotec: Rabbit anti chicken interferon gamma (polyclonal antibody, AHP945Z)之间进行配对实验，棋盘法找出建立ChIFN-Y抗原捕获ELISA的最 佳抗体(包被mAbs为3E5，检测抗体为生物素标记的mAb 3E3)及其最适浓度， 固定avidin-HRP (BD公司)的工作浓度为1: 2500 (参照说明书)，同时设立阴 性对照(1%BSA)、空白对照，建立捕获ELISA方法；
3. ChIFN-Y抗原捕获ELISA灵敏度的测定根据"2"建立的条件进行 mAb 3E5的包被浓度为85 u g/ml， bio-m3E3的工作浓度为0. 67ix g/ml， avidin-HRP工作浓度为1: 2500，将rChIFN-Y倍比稀释，同时设立阴性对照(1%
BSA)，该方法可检测到125-500pg/ml的rCMFN-Y (图1)。
实施例2:应用本发明方法检测天然ChIFN- y
天然ChIFN-Y的制备无菌摘取4周龄SPF鸡脾脏，研磨后200目铜网过 滤；收集滤液，4'C离心，1000 rpm， 5 min;淋巴细胞分离液(Sigma公司)分 离淋巴细胞，21°C， 2000 rpm， 30 min，离心；收集中间云雾状层，即为淋巴细 胞，将收集的细胞离心用PBS洗涤2遍，再用完全RPMI 1640 (10%胎牛血清， 100U/ml青霉素，100U/ml链霉素)洗涤1遍，最后用完全RPMI 1640将细胞悬 �。髡赴ǘ戎�1Xl(^个/ml、 5Xl()S个/ml、 2Xl()S个/ml;取96孔细胞培 养板，加入100ul细胞，然后再加入含刺激剂Con A (Sigma公司)的培养基100 Ul，使得ConA的终浓度为12yg/ml，同时设立阴性对照(完全RPMI 1640); 置4rC， 5%(302细胞培养箱培养，收集培养72h的细胞培养上清，获得天然的 ChIFN卞
夹心ELISA方法检测天然ChIFN- y :
将mAb 3E5用包被缓冲液(0.01 M PBS pH 7.2)稀释成85 u g/ml，包被ELISA 板，100 ul/孔，4°C， 24 h; PBS-T(0.5o/oTween隱20)洗涤3次，5min/次;用含 2。/。BSA的PBS-T封闭，200 ul/孔，37°C.， 2 h;同上洗涤，加入待检测样品， 100 "l/孔，37°C.， 2h;同上洗涤；加入工作浓度的bio-3E3 (0.67 u g/ml)， 37°C.， lh;同上洗涤后加入avidin-HRP (1: 2500，稀释液为含1%BSA、 10% 优级小牛血清的PBS-T， 100 lU/孔，37°C， 30min;同上洗涤7次，加入TMB，100ul/孔，37°C.， 15min， 2MH2S04终止，酶标仪读取OD450 nm值。同时设阳 性对照、阴性对照及空白对照。
运用该夹心ELISA方法可以非常显著地检测到天然ChIFN- y (图2、 3)。 本方法中使用的ELISA板为辐照板(厦门云鹏科技发展有限公司)；包被缓 冲液为PBS， pH7.2;稀释rChIFN-Y及检测抗体的稀释缓冲液为含0.05% Tween-20、 1% BSA的PBST， avidin-HRP的稀释液为0.05% Tween-20、 1% BSA、 及10%优级小牛血清(兰州民海生物工程公司)的PBST， TMB (eBioscience 公司)显色，2MH2S04终止反应。
综上，本发明所建立的ChIFN-Y特异性捕获ELISA可以敏感的检测到经Con A刺激的细胞培养上清中存在的天然ChIFN-Y。所建立的ELISA方法为评价Thl 细胞免疫应答提供了很好的检测工具。
权利要求
1、一种用于检测生物样品中ChIFN-γ的双单克隆抗体夹心ELISA方法，其包括以下步骤①将捕捉抗体固定在固相支持物上，其中捕捉抗体为纯化的ChIFN-γ单克隆抗体3E5；②将生物样品与固相化的捕捉抗体保温，使ChIFN-γ与捕捉抗体结合；③使结合到固相化捕捉抗体上的ChIFN-γ与生物素标记的抗ChIFN-γ单克隆抗体3E3接触，来检测ChIFN-γ。
2、 如权利要求l的方法，其中生物样品分离自鸡血清、鸡血浆或细胞培养 上清。
3、 权利要求1的方法，其中步骤①的保温温度为4°C，保温时间为24小时； 步骤②的保温温度为37'C，保温时间为2小时；步骤③的保温温度为37。C，保 温时间为1小时
4、 权利要求1-3之一的方法，其中捕捉抗体是固相化单克隆抗体。
5、 权利要求4的方法，固相化的捕捉抗体的量为85 ^tg/ml。
全文摘要
本发明公开了一种检测鸡γ-干扰素(IFN-γ)的双单克隆抗体夹心ELISA方法。采用抗ChIFN-γ特异性单克隆抗体(mAbs)建立检测ChIFN-γ特异性双单克隆抗体夹心ELISA方法。该方法以mAb3E5作为捕获抗体，以生物素标记的mAb 3E3作为检测抗体，建立检测ChIFN-γ的双单抗夹心ELISA方法，可以灵敏的检测到微量的ChIFN-γ(125-500pg/ml)。该方法便捷、实用、灵敏、多效，可以用于检测生物样品中的ChIFN-γ及重组的ChIFN-γ，为检测和评价家禽的细胞免疫应答提供了灵敏的检测工具，将有利于研究ChIFN-γ在家禽不同的免疫应答机制中的作用，有效弥补了现有ChIFN-γ检测方法的不足。
文档编号G01N33/543GK101441220SQ200810235438
公开日2009年5月27日 申请日期2008年11月25日 优先权日2008年11月25日
发明者林 孙, 华 戴, 潘志明, 焦新安, 郑佳玉, 祥 陈, 陈俊华 申请人:扬州大学
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