专利名称：大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗体及其制备方法与应用，特别是涉及环境检测领域中的一种大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体及其制备方法与其在检测大肠杆菌中的应用。
背景技术：
大肠杆菌是环境水质监测和食品安全中一种重要的指示微生物。目前，世界各国及国际组织都将大肠菌群数作为重要的环境卫生学指标，并对其在水中的浓度提出了严格的限制。世界卫生组织《饮用水水质标准》(第二版)中规定，所有饮用水中的大肠杆菌或耐热大肠菌在任意100mL水样中不得检出；现行美国饮用水水质标准国家一级饮用水标准规定总大肠杆菌(包括粪型及艾氏大肠菌)为0mg/L；中华人民共和国国家标准《生活饮用水水质卫生规范》中规定总大肠菌群及粪大肠菌群在任意100mL水样中不得检出。
目前，国际上公认的大肠菌群标准检测方法以多管发酵法和滤膜法为主。我国在水和食品卫生检验标准中规定的大肠菌群数的检测方法也是多管发酵法和滤膜法。但是这两种检测方法都存在检测周期长，操作繁琐的缺点，因而难以实现对污染源的快速诊断。近年来，世界各国针对水环境和食品中大肠杆菌的快速检测进行了大量的研究工作，其中基于免疫技术原理的ELISA检测方法呈现出了良好的应用前景。
免疫检测技术是利用抗原和抗体间的特异性反应，通过检测标记在反应物上的示踪物，对抗原或抗体进行定性或定量测定的快速检测技术。根据标记物质的不同，目前用于检测环境污染物的免疫检测方法主要有酶免疫分析技术、荧光免疫测定技术、化学发光免疫分析技术、免疫胶体金标记技术、免疫磁珠技术等。其中，酶免疫分析技术(Enzyme immunoassay，EIA)在环境领域中的应用较为广泛，该类技术中的酶联免疫吸附分析法(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)又是最常用的测定方法。该方法具有操作简单，特异性强，迅速灵敏的优点，在大肠杆菌的快速检测中具有优势。
Vandekerchove等运用多克隆抗体ELISA方法检测了致病性大肠杆菌(EPEC)，在单个检测水平上(individual level)，该法试验得到的敏感度及特异性分别为80.0％和98.4％，而在多个检测水平上(rabbit flock level)的敏感度及特异性则降低为79.2％和85.2％(VANDEKERCHOVE DGF，KERR PG，CALLEBAUT AP，et.al.Development of a capture ELISA for the detection of antibodies toenteropathogenic Escherichia coli(EPEC)in rabbit flocks usingintimin-specific monoclonal antibodies[J].Veterinary Microbiology，2002.12，88(4)351-366.)。Padhye采用单克隆抗体ELISA法检测了大肠杆菌O157H7(PADHYE N V，DOYLE M P.Production and characterization of a monoclonalantibody specific for enterohemorrhagic Escherichia coli of serotypes O157H7and O2611[J].J Clin Microbiol，1991，2999-103)。Park等采用多克隆抗体ELISA试剂盒检测了粪便中的大肠杆菌O157，与传统的麦康凯培养基法相比，该试剂盒的灵敏度及特异性分别为91.2％和99.5％，而传统检测方法的灵敏度及特异性仅为82.4％和100％(PARK C H，VANDEL N M，HIXON D L.Rapid immunoassay fordetection of Escherichia coli O157 directly from stool specimens[J].J ClinMicrobiol，1996，34988-90)。Ramadan等利用ELISA检测方法在2小时内检测到了大肠杆菌O157(10-108CFU/mL)(ABUKNESHA R A，DARWISH F.Coupling of enzymaticand immunoassay steps to detect E.colia new，highly sensitive tandemtechnique for the analysis of low levels of bacteria[J].Talanta，2005.1，65(2)343-348)。我国姚斐等利用间接酶联免疫吸附方法检测了活的非可培养状态的大肠杆菌O157H7，最小检测浓度为105CFU/mL(YAO Fei(姚斐)，SHA Sha(沙莎)，CHEN Gang(陈刚)，et al.Indirect enzyme linked immunosorbent assay fordiagnosis of viable but nonculturable Escherichia coli O157H7[J].Journalof Ocean University of Qingdao(青岛海洋大学学报)，2001，31(2)211-214.)。孙克江等应用酶联免疫吸附法检测了大肠杆菌O157H7，与常规的培养等方法相比，检出率及敏感性均得到大幅提高(SUN Kejiang(孙克江)，GUO Hong(郭宏)，ZHANGDongfa(张东发)，et al.Enzyme linked immunosorbent assay for detectingO157H7[J].Disease Surveillance(疾病监测)，2001，16(9)353-355)。虽然ELISA检测方法操作简单，灵敏度高，但是若用该法检测所有血清型的大肠杆菌则需要广谱抗体(Broad spectrum antibody)，此外，上述试剂盒要想实现商品化仍需对其可靠性做进一步检验，而且目前检测标准尚不统一，因此，商品化受到极大限制。
美国食品与药物管理局已认可使用商品化的出血性大肠肝菌O157H7的免疫检测试剂盒。我国仅中国兽药监察所分别针对大肠埃希氏菌K88、K99和987P抗原开发出了ELISA检测试剂盒，用于控制幼畜大肠杆菌病(China Institute of Veterinary DrugControl(没有具体作者).Research and application of enzyme linkedimmunosorbent assay for detecting E.coli kit.Bulletin of Agricultural Scienceand Technology(农业科技通讯)，1997，8无卷期页码)。由以上诸多文章中可见，目前国内外的研究和应用多针对致病性的大肠杆菌O157H7，还未有针对总大肠杆菌开发的ELISA检测试剂盒，而环境检测标准中所要求检测的均为总大肠杆菌。同时，各研究结果显示，针对于大肠杆菌所开发的各技术的检测限均难以满足环境检测的要求。因此，迫切需要一种环境检测领域中用于检测总大肠杆菌的ELISA试剂盒。
发明内容
本发明的目的是提供一种简便易行的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取以下设计方案一种大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤1)分离出大肠杆菌，具体方法为先将样品接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上在36-38℃下培养12-36小时，再将在牛肉膏蛋白胨固体培养基长出的菌落涂布于品红亚硫酸钠培养基上在36-38℃下培养24-48小时，接着挑取在品红亚硫酸钠培养基上长出的紫红色带金属光泽的单菌落，再次接种于品红亚硫酸钠培养基上在36-38℃下培养24-48小时，然后挑取紫红色带金属光泽的单菌落，接种于添加了质量百分浓度为1.4-1.8％溴甲酚紫的乳糖蛋白胨培养基中在36-38℃下培养12-36小时，待乳糖蛋白胨培养基中的紫色褪去，将菌液接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上，对长出的菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态，将鉴定为大肠杆菌的菌落再接种于伊红美蓝培养基上在36-38℃下培养12-36小时，菌落呈黑紫色的为大肠杆菌；2)将分离的大肠杆菌培养后灭活，再破碎菌体，使抗原位点充分暴露，得到大肠杆菌破碎全菌体抗原；3)将大肠杆菌破碎全菌体抗原免疫动物；4)从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。
自然环境，特别是生活污水中存在多种大肠杆菌，因而在上述制备方法的步骤1)中，首先需要分离出存在于待测样品中的多种大肠杆菌，以使制备的多克隆抗体具有广谱性。
步骤2)中用于培养大肠杆菌的培养基的选择是多种多样的，如牛肉膏蛋白胨培养基、LB培养基等，优选为牛肉膏蛋白胨培养基，培养条件可为在36-38℃下培养15-18小时；对大肠杆菌进行灭活的方法可为先用质量百分浓度为0.85-0.9％的生理盐水制成浓度为108-1010cfu/mL的菌悬液，再加入体积百分浓度为0.3-0.5％的福尔马林液(甲醛溶液)，最后在55-80℃下水浴0.5-1.5小时；破碎菌体的方法也是多种多样的，优选为用功率为150-300W的超声波细胞破碎仪对大肠杆菌进行破壁处理，工作时间为2-4min，工作方式为4-6s，间歇4-6s。
步骤3)中免疫方法的选择是多种多样的，如背部皮下多点注射法、腹腔注射法等，免疫剂量可为0.3-2.0mL/只(浓度为108-1010cfu/mL)，此外，用于制备大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的免疫动物可为兔、鸡、鼠、羊或马等常用的免疫动物。
步骤4)中为获得较好的检测效果，还应每隔7-10天测定免疫动物抗血清的抗体效价，当抗体效价达到最大值时，可从经免疫的动物中分离、纯化抗血清；所述对抗血清进行纯化的方法可为饱和硫酸铵盐析沉淀法和亲和层析等方法。
用上述方法制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体是本发明需要保护的。
本发明的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体可用于大肠杆菌的免疫检测中。
所述大肠杆菌的免疫学检测方法可采用酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫胶体金标记技术、化学发光免疫测定技术或荧光免疫测定技术等。
本领域技术人员知晓，对于固相反应而言，可以将本发明的多克隆抗体固定于固相载体，也可以将待测样品固定于固相载体上。反应通常在室温下进行，检测过程中需要洗涤不与本发明多克隆抗体结合的样品的步骤。
对于液相反应而言，通�？梢韵虼υ谔囟ɑ撼逄逑抵械拇庋分兄苯蛹尤氡痉⒚鞯亩嗫寺】固澹缓笤谑视诳乖固宸⑸嗷プ饔玫奈露认�(如室温)进行反应。
本领域技术人员知晓如何根据多克隆抗体的来源选择相应的第二抗体。所述第二抗体可以是放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自32P、125I、S、2H等；也可以是非放射性同位素标记的，包括但不限于使用选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、生物素、链霉亲和素等标记。本发明所述检测方法中使用的检测试剂取决于检测过程使用的第二抗体的标记物，本领域技术人员知晓如何选择合适的检测试剂。
所述大肠杆菌的ELISA检测法，可包括如下步骤1)用待测样品包被酶联板，洗板；2)封闭经包被的酶联板，洗板；3)加大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体，洗板；4)加酶标二抗，洗板；5)加底物显色；6)终止反应；7)测定OD450值。
上述检测方法中的反应条件及试剂均可按照常规方法进行选择。
步骤4)中的二抗可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记的抗兔抗抗体。
本发明还提供了一种检测大肠杆菌的ELISA试剂盒。
本发明所提供的检测大肠杆菌的ELISA试剂盒，可包括上述大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。
所述试剂盒还可包括所述大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的酶标二抗。
所述酶标二抗可为羊抗兔IgG等。
所述用于标记二抗的酶可为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶等标记酶，优选为辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。
试剂盒中还可包括由显色液A和显色液B组成的显色液，所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液，所述显色液B液为邻苯二胺或3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺溶液。
为方便使用，所述试剂盒还可包括检测用的洗涤液，如PBST等常规的洗涤试剂；封闭液，如1％BSA等；包被液，如0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)等。
本发明提供了一种大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体及其制备方法。在本发明的制备方法中，大肠杆菌分离自自自然环境，特别是生活污水，因而是环境中大肠杆菌的代表性菌群类型，基于此得到的多克隆抗体可特异性识别环境中的总大肠杆菌，具有广谱性；)此外，该制备方法还具有简单，成本低廉的优点。实验证明，用本发明方法制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体具有特异性高，纯度及效价高(大于1∶1×105，原因在于脂多糖(LPS)位于细胞壁的最外层，由脂多糖单体组成，脂多糖单体的成分之一特异性多糖，其多糖链上具有大肠杆菌的菌体抗原成分，因此当大肠杆菌细胞壁破碎时，O抗原得以充分暴露；由于鞭毛是从细胞浆外层的基础颗粒生长出来，穿过胞浆膜和细胞壁向菌体外伸出的细长波状弯曲的丝状物，因此当大肠杆菌细胞壁破碎时，H抗原得以充分暴露；同时，由于菌毛始于胞浆膜或接近胞浆膜的胞浆中，穿过细胞壁向菌体外延伸，因此当大肠杆菌破碎后，大量菌毛抗原得以充分暴露，因此，在免疫过程中破碎全菌体抗原中包含了各种充分暴露的抗原位点，使得免疫效果佳)，可长期保存的优点，将其用于环境及食品检测领域中大肠杆菌的免疫检测中，将具有精确性、灵敏度高等优势，应用前景广阔。
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
图1为大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的SDS-PAGE检测结果图2为大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的效价测定结果具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。所有培养基均用蒸馏水配制，分装包装好后灭菌备用，灭菌条件为在115℃下灭菌20-30min。
实施例1、大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的制备及其效价测定一、制备大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体现用本发明的方法制备大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体，包括以下步骤1、从生活污水中分离出大肠杆菌1)采集水样分别从北京市的4个生活污水处理厂(清河污水处理厂、肖家河污水处理厂、北小河污水处理厂的进水口处和清华大学校内生活污水水样)采集水样，共取水样16点，每厂4点。采样用塑料样品瓶，取水时尽量减少与空气接触时间，用手握住样品瓶底部，将瓶迅速浸入水面下，然后将瓶口转向水流方向，待水样充满至瓶体积2/3时，在水中塞上瓶盖，取出水面。将取回的水样保存于4℃冰箱中，保存时间不应超过6个小时。
2)大肠杆菌的分离和鉴定采用选择性培养方法从步骤1)采集的水样中分离出大肠杆菌，具体方法包括以下步骤A.将水样划线接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基(牛肉膏2.5g，蛋白胨5.0g，NaCl2.5g，琼脂10g，水500mL，pH7.2)上37℃培养24小时(复壮)；B.将在牛肉膏蛋白胨固体培养基长出的菌落涂布于品红亚硫酸钠培养基(蛋白胨10g，酵母浸膏5g，牛肉膏5g，乳糖10g，琼脂20g，磷酸氢二钾3.5g，无水亚硫酸钠5g，5％碱性品红乙醇溶液20mL，水1000mL，pH至7.2-7.4)上在37℃下培养24-48小时进行分离；C.挑取在品红亚硫酸钠培养基上长出的紫红色带金属光泽单菌落，再划线接种于品红亚硫酸钠培养基上在37℃下培养36小时进行分离；D.挑取步骤C分离出的紫红色带金属光泽单菌落，接种于添加了溴甲酚紫的乳糖蛋白胨培养基(蛋白胨5g，牛肉膏1.5g，乳糖2.5g，氯化钠2.5g，0.5mL 1.6％溴甲酚紫乙醇溶液，水500mL，pH7.2)中在37℃下培养约24小时；E.待步骤D中乳糖蛋白胨培养基中的紫色褪去，挑取培养基中的菌液，将其接种在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上；F.对在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基斜面上长出的菌落进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察细菌形态，将鉴定为大肠杆菌的菌落再涂布接种于伊红美蓝培养基(半乳糖5g，胰蛋白胨2.5g，NaCl 2.5g，K2HPO41g，伊红Y 0.2g，美蓝0.05g，琼脂7.5g，水500mL，pH7.2)上，在37℃下培养约24h观察颜色形态，菌落呈黑紫色，有光泽或无光泽的为大肠杆菌，低温保存、备用(一般可以储存约6个月)。
用上述方法获得的大肠杆菌包括了水环境中代表性的大肠杆菌，能够用以表征水环境中的总大肠杆菌。
2、大肠杆菌破碎全菌体抗原的制备将步骤2)分离的大肠杆菌接种于牛肉膏蛋白胨培养基(牛肉膏2.5g，蛋白胨5.0g，NaCl 2.5g，水500mL，pH 7.2)上，在37℃孵育箱中培养17h，然后用质量百分浓度为0.9％的生理盐水制成浓度为1010cfu/mL的所分离的大肠杆菌的菌悬液(用Mc Farland比浊管测定菌数)，再加入体积百分浓度为0.4％的福尔马林液，最后在60℃下水浴1h，得到大肠杆菌全菌体抗原，再将1mL大肠杆菌全菌体抗原用200W超声波细胞破碎仪破碎3min，5s工作，5s间歇，使大肠杆菌细胞壁破碎，抗原位点充分暴露，得到大肠杆菌破碎全菌体抗原。
3、免疫动物将步骤2获得的大肠杆菌破碎全菌体抗原对2只成年雌性新西兰大白兔采用背部6点皮下注射法(靠近淋巴结的腋下、背部、腹股沟各两侧)进行免疫，免疫前1周取家兔耳缘静脉血，分离血清作为阴性对照(Neg)，免疫剂量为1.0mL/次，每次免疫时加注1.0mL福氏佐剂(购自sigma公司)作为免疫佐剂，分别于初次免疫后第7、14、21和28天再加强免疫一次(免疫方案见表1)。
表1 免疫方案
4、大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的获得1)效价测定免疫过程中，定期(初期免疫后每隔7天，待免疫五次后每天检测)从免疫兔子的耳缘静脉采血，采血量为1mL/只，分离血清，用间接ELISA法检测血清中的抗体效价(抗体的效价(titer)(又称滴度)是评价抗体性能的一个重要指标，是常用于表达抗血清中特异性抗体相对含量的一个半定量指标。效价是指在一定条件下，抗血清经过一系列稀释与定量的抗原反应，当阳性抗血清吸光值大于2.1倍阴性血清的对照吸光值时抗血清的稀释倍数。)以考察免疫效果，具体步骤如下a.包被用0.05M pH9.6碳酸氢钠缓冲溶液(Na2CO30.159g，NaHCO30.294g，ddH2O 100mL)将大肠杆菌破碎全菌体抗原包被96孔板，每孔包被量为100μL，37℃温育2h；b.封闭用PBST洗涤液(内含0.05％Tween-20的0.01M pH7.4磷酸盐-NaCl缓冲液(PBS)，配方为NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，Tween-20 0.5mL，用水定容至1L)清洗酶标板3次，每次3min，再每孔添加质量百分浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)封闭液100μL，37℃温育2h；c.加抗体以PBST洗涤液清洗酶标板3次，每次3min，再加入上述分离自免疫兔子的抗血清100μL，37℃温育1h；d.加酶标抗抗体以PBST洗涤液清洗酶标板3次，每次3min，再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗抗体(购自Sigma)100μL，37℃温育1h；e.加底物显色以PBST洗涤液清洗酶标板3次，每次3min，再加3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(3，3’，5，5’-tetramethylbenzidine，TMB)溶液(Na2HPO4142mg，柠檬酸105mg，TMB 2mg，30％H2O27.5μl，蒸馏水5mL)100μL，反应5min；f.终止反应及OD450值测定加H2SO4终止液(H2SO428mL，ddH2O 500mL)终止反应后，取出放入酶标仪中，读取450nm下的吸光度。
2)分离抗血清当免疫兔子抗体的效价达到最高时，用颈动脉放血的方法大量采血(注意大量采血前，先将家兔禁食24h以防血脂过高)，取血后在室温下放置约2h使其凝固，然后用高速离心机11000rpm离心10min，取上清分装，于-20℃冷冻保藏(或于4℃冷藏)。
3)抗血清的纯化A.用饱和硫酸铵盐析沉淀法进行纯化首先用饱和硫酸铵盐析沉淀法对步骤2)分离的抗血清进行初步纯化，具体方法包括以下步骤(1)取抗血清样品20mL，加入等量PBS(NaCl 8.0g，KH2PO40.2g，Na2HPO4·12H2O 2.9g，KCl 0.2g，用水定容至1L，pH5.0)，于冰上用玻璃棒轻轻搅拌，缓慢、逐滴加入4℃预冷的SAS(饱和硫酸铵溶液)40mL，于4℃冰箱中静置12-24h(注加入等体积的SAS后终浓度变为原浓度的50％)；(2)4℃、12000rpm离心10min，弃上清，将沉淀物用12mL PBS溶解，缓慢、逐滴加入4℃预冷的8mL SAS，4℃静置1h；(3)重复步骤(2)离心，用13.4mL PBS溶解沉淀，滴加6.6mL SAS，4℃静置1h；
(4)重复步骤(2)离心，将沉淀用PBS溶解，装入透析袋；(5)于4℃冰箱中，用25倍体积的PBS进行透析，期间每3h换液一次，共换液3次，直至用BaCl2检测透析液无白色沉淀为止。
B.用亲和层析法进行纯化对步骤A中用饱和硫酸铵盐析沉淀法进行初步纯化的抗血清用购自AmershamBiosciences公司的蛋白A亲和层析柱(HiTrap rProtein A FF)做进一步纯化，具体方法包括以下步骤(1)准备收集管，向待收集部分加入120μl 1M Tris·HCl(pH9.0)/mL；(2)用起始缓冲液(HiTrap rProtein A FF层析柱的绑定产品)填充注射器，以至少5倍柱体积的蒸馏水洗涤酒精防腐剂；(3)以5倍柱体积的洗脱缓冲液(HiTrap rProtein A FF层析柱的绑定产品)洗柱使柱再生；(4)用5-10倍柱体积的偶联缓冲液(HiTrap rProtein A FF层析柱的绑定产品)平衡柱子；(5)样品过柱，用注射器将样品注入柱子上端接口；(6)用5-10倍柱体积的偶联缓冲液洗柱(注意避免过度洗涤)；(7)用2-5倍柱体积的洗脱缓冲液洗脱，得到大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。
二、大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的检测1、蛋白质含量测定使用分光光度计在280nm下测定步骤一中用本发明方法制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的蛋白质含量，结果破碎全菌体抗体2.4mg/mL，表明获得了蛋白质含量较高的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。
2、SDS-PAGE电泳检测再对步骤一制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体进行SDS-PAGE电泳检测，具体检测步骤为先后用洗洁精、自来水、蒸馏水、无水乙醇清洗玻板，再用吸水纸擦干；配胶配置10mL 15％的Tris·甘氨酸SDS-PAGE分离胶溶液和4mL 5％的Tris·甘氨酸SDS-PAGE浓缩胶溶液，样品处理液(1g SDS，5mL甘油，0.5mg BPB，2.5mL巯基乙醇，10mL pH6.8的Tris·HCl缓冲液，加水至50mL)；分离胶溶液充分混匀后，平稳地将其从一侧加入4.5mL，然后在液面上注入一层水，以隔绝空气，促使聚合并消除凝胶弯月面的形成，使凝胶表面平坦；于37℃孵箱中放置40min后将水倒掉，用滤纸吸干，注入浓缩胶液至玻板顶端，然后立即小心插入梳子，37℃孵箱中放置30min；拔梳子时先往电泳内槽灌满电泳缓冲液，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形，同时去掉凝胶密封框，30min后即可上样；样品处理时，用2×样品处理液与样品1∶1混合，将其同标准蛋白Marker一起在100℃下煮10min，冷却至室温，离心(去除样品中一些不溶性的物质)；上样时，上样量为10μg/孔；将浓缩胶和分离胶分别在80V和160V下进行电泳；当溴酚蓝前沿到达玻璃板底部时停止电泳；取胶时，撬去玻板，将浓缩胶轻轻刮去，避免把分离胶刮破，将分离胶卸下，左上切角，用纯水冲洗；染色与脱色时，将分离胶经微波加热1-2min后倒掉染色液，再用微波加热脱色3min×2(平皿里放大量海绵)，摇床振荡冷却；凝胶脱色干净后，脱色液经活性炭回收，凝胶泡清水后即可进行扫描，结果如图1所示(泳道psQ为大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体，泳道M为蛋白标准分子量)，可以看出所得大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的重链及轻链清晰，杂蛋白含量少，表明用本发明方法制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体具有较高的纯度。
3、效价测定用与步骤一中相同的间接ELISA法测定用本发明方法制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的效价，除步骤c中的抗体变为大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体外，其余步骤均相同。效价测定结果如图2所示(Neg为阴性对照，psQ为大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体)，用大肠杆菌破碎全菌体抗原免疫新西兰白兔产生了较强的免疫反应，获得的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体对包被的大肠杆菌破碎全菌体抗原具有较高的吸收值，表明抗体能够与抗原具有较强的特异反应性，所获得的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体效价较高，大于1∶1×105。
实施例2、用含有大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的ELISA试剂盒检测大肠杆菌一、含有大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的ELISA试剂盒的制备将实施例1制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体与作为第二抗体的经过辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，显色A液30％H2O21mL，显色B液质量百分浓度为1％的3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺(TMB)液1mL(将TMB溶于二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(或二甲基甲酰胺(Dimethyl formamide，DMF))得到)，洗涤及稀释液PBST 50mL，封闭液1％BSA 10mL，包被液0.05M pH9.6碳酸氢钠50mL，H2SO4终止液10mL共同包装，得到检测大肠杆菌的ELISA试剂盒。
二、大肠杆菌的检测以清华大学校内生活污水为例，用步骤一制备的试剂盒对环境中的大肠杆菌进行测定，具体方法包括以下步骤(1)包被酶联板用0.05M pH9.6碳酸氢钠缓冲溶液将污水水样包被在96孔板中，每孔100μl，37℃放置2小时，然后用10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍；(2)封闭已包被的酶联板用1％的BSA封闭包被的酶联板，100μl/孔，37℃保温30分钟；(3)在酶联板上加实施1制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体(经200倍稀释)100μl/孔，37℃保温1小时，然后用10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍。
(4)加辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，100μl/孔，37℃保温30分钟，然后用10mM PBS-0.05％Tween 20(pH7.4)洗三遍；(5)加辣根过氧化物酶底物溶液(9.8mL pH5.0柠檬酸-磷酸盐缓冲液中加入0.2mL TMB溶液，再加入20μl 30％H2O2，摇匀)，50μl/孔，室温显色5分钟；(6)加2N H2SO450μl/孔终止反应；(7)测定OD450值。
结果OD450值为0.6，对照用已知浓度的大肠杆菌菌液绘制的标准曲线，样品中的大肠杆菌量约为104/mL，表明本发明的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体及含有该抗体的试剂盒可用于大肠杆菌的免疫检测中。
权利要求
1.一种大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的制备方法，包括以下步骤1)分离出大肠杆菌，具体方法为先将样品接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上在36-38℃下培养12-36小时，再将在牛肉膏蛋白胨固体培养基长出的菌落涂布于品红亚硫酸钠培养基上在36-38℃下培养24-48小时，接着挑取在品红亚硫酸钠培养基上长出的紫红色带金属光泽的单菌落，再次接种于品红亚硫酸钠培养基上在36-38℃下培养24-48小时，然后挑取紫红色带金属光泽的单菌落，接种于添加了质量百分浓度为1.4-1.8％溴甲酚紫的乳糖蛋白胨培养基中在36-38℃下培养12-36小时，待乳糖蛋白胨培养基中的紫色褪去，将菌液接种于牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，对长出的菌落进行革兰氏染色，观察细菌形态，将鉴定为大肠杆菌的菌落再接种于伊红美蓝培养基上在36-38℃下培养12-36小时，菌落呈黑紫色的为大肠杆菌；2)将分离的大肠杆菌培养后灭活，再破碎菌体，得到大肠杆菌破碎全菌体抗原；3)将大肠杆菌破碎全菌体抗原免疫动物；4)从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤1)中的大肠杆菌分离自生活污水；步骤2)中用于培养大肠杆菌的培养基为牛肉膏蛋白胨培养基或LB培养基，培养条件为在36-38℃下培养15-18h；用功率为150-300W的超声波细胞破碎仪破碎菌体，工作时间为2-4min，工作方式为4-6s，间歇4-6s。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤2)中对大肠杆菌进行灭活的方法为先用质量百分浓度为0.85-0.9％的生理盐水制成浓度为108-1010cfu/mL的菌悬液，再加入体积百分浓度为0.3-0.5％的福尔马林液，最后在55-80℃下水浴0.5-1.5h，
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤3)中采用皮下多点注射法或腹腔注射法将大肠杆菌破碎全菌体抗原免疫动物，免疫剂量为0.3-2.0mL/只；免疫动物为兔、鸡、鼠、羊或马。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述对抗血清进行纯化的方法为饱和硫酸铵盐析沉淀法和/或亲和层析法。
6.用权利要求1-5任一项所述的方法制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。
7.一种检测大肠杆菌的ELISA试剂盒，包括权利要求6所述的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括所述大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体的酶标二抗，由显色液A和显色液B组成的显色液。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于所述酶标二抗为经过辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶标记的羊抗兔IgG；所述显色液A液为过氧化氢或过氧化脲溶液；所述显色液B液为邻苯二胺或3’，3’，5’，5’-四甲基联苯胺溶液。
10.根据权利要求7或8或9所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括PBST，1％BSA和0.05M pH9.6碳酸盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开了一种大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体及其制备方法与应用，其目的是提供一种大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体及其制备方法与其在检测大肠杆菌中的应用。该制备方法包括以下步骤1)分离大肠杆菌；2)培养后灭活，再破碎菌体，得到大肠杆菌破碎全菌体抗原；3)将大肠杆菌破碎全菌体抗原免疫动物；4)从经免疫的动物中分离、纯化抗血清，得到大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体。用本发明方法制备的大肠杆菌破碎全菌体多克隆抗体具有特异性高，纯度及效价高(大于1∶1×10
文档编号G01N33/535GK1935844SQ200610113828
公开日2007年3月28日 申请日期2006年10月18日 优先权日2006年10月18日
发明者何苗, 王娜, 施汉昌, 蔡强 申请人:清华大学
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