专利名称：Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒及在鼻咽癌筛查中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒及其应用，具体地说,是ー种Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒及在鼻咽癌筛查中的应用。
背景技术：
鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种在我国南方和东南亚地区常见的恶性肿瘤，其进展性发展，稍晚常发生转移和扩散。目前鼻咽癌主要依靠放射性治疗，中晚期肿瘤病人的预后仍然很差，I期患者放疗后5年生存率可达90%，IV期患者5年生存率 仅30%，因此早期发现是提高治愈率的关键。对鼻咽癌高危人群进行血清学筛查是发现早期鼻咽癌的重要途径。Epstein-Barr病毒(EBV)是鼻咽癌(NPC)发病最重要的环境危险因素。虽然EBV流行遍布全世界，但是NPC只在华南及东南亚高发。这主要是因为EBV —些重要癌基因(如EBNAU LMPl等)发生了突变，且突变的病毒株获得了优势扩増。作为NPC筛查的标本常为血液和鼻分泌物，现有最常用技术方法为采用ELISA法检测EBV的VCA、EBNA及EA等抗原。这些现有技术的缺陷主要有两点I) ELISA法只能检测病毒含量，但不知EBV在体内的变异情况，因为不是所有EBV病毒株在体内都致癌，所以这种方法不能真实反应受检者患癌风险；2)方法是采用ELISA法检测EBV的抗原，方法不够灵敏，且检测易受多种因素的干扰。中国专利文献CN101597646A公开了ー种鼻咽癌相关基因EBNAl的早期检测试剂盒及其检测方法和应用，提供了一种鼻咽癌相关基因EBNAl的早期检测试剂盒，包括鼻咽癌相关基因EBNAl扩增用基因特异性引物、dNTP、用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液，还提供了鼻咽癌相关基因EBNAl的早期检测方法及其应用。中国专利文献CN101956014A公开了ー种用于鼻咽癌早期诊断的外周血7个基因标志物的检测试剂盒，该试剂盒包含外周血总RNA提取试剂、RT-PCR反应液、实时荧光定量RT-PCR反应液和SVM鼻咽癌诊断模型，实时荧光定量RT-PCR反应液包含引物，引物序列是7个基因标志物及内參基因GAPDH的SYBR Green荧光定量RT-PCR检测引物。所述I个基因标志物为HERC5、DLG7、PRARG、PLK1、KIF15、KLHL25和MYST4。但是关于Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的多重荧光定量PCR检测试剂盒及其在鼻咽癌筛查中的应用目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供ー种Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒。本发明的再一的目的是，提供ー种Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒的应用。为实现上述目的，本发明采取的技术方案是=Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒含有以下试剂
a、扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对；和
b、Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针，所述的基因突变为EBNA-I基因编码区的 P-thr、V-val 和 V_leu，EBNA-I 基因启动子 Cp、Fp 和 ZpJP LMPl 基因 Xhol-loss、30bp Deletion 和 Ser366Thr ；
C、不同浓度的Epstein-Barr病毒基因突变标准品系列；
d、用于荧光定量PCR反应的PCR反应液(包含ROX荧光、dNTP、DNA聚合酶及其缓冲液)。所述的扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对为
a、EBNA-I基因编码区SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11 ；b、EBNA-I基因启动子SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；
c、LMPl基因 XhoI-Ioss :SEQ ID NO. 20 和 SEQ ID NO. 21，和 LMPl 基因 30bp Deletion和 Ser366Thr SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24。所述的Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针具有下列核苷酸序列
a、针对P-thr特异性探针SEQID NO. 12，针对V_val特异性探针SEQ ID NO. 13，和针对V-Ieu特异性探针SEQ ID NO. 14 ；
b、针对Cp特异性探针SEQID NO. 17，针对Fp特异性探针SEQ ID NO. 18，针对Zp特异性探针 SEQ ID NO. 19 ；
C、针对XhoI-Ioss特异性探针SEQ ID NO. 22，针对30bp Deletion特异性探针SEQ IDNO. 25，针对 Ser366Thr 特异性探针 SEQ ID NO. 26。为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是所述的试剂盒在制备检测鼻咽癌疾病药物中的应用。本发明优点在干
1、本发明的试剂盒能够达到在人群中高通量筛查NPC的目的，不仅可检测EBV中癌基因的关键突变类型，还可准确检测这些关键基因突变的数量，达到准确预测高危人群鼻咽癌发病风险的目的；
2、采用本试剂盒掌握高危人群体内的主要致癌突变，今后可采用后续核酸干扰的方法对高危个体进行预防，将鼻咽癌的人群筛查和人群干预结合起来；
3、本发明具有高灵敏度，操作快速，成本较低的优点，具有广阔的市�。眯б娣浅？晒�。
附图I是EBNAl P-thr突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图2是EBNAl V-val突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图3是EBNA-I V-Ieu突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图4是EBNA-I基因Cp启动子突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图5是EBNA-I基因Fp启动子突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图6是EBNA-I基因Zp启动子突变基因型荧光定量PCR扩增图。附图7是LMPl XhoI-Ioss突变基因型荧光定量PCR扩增图。
具体实施例方式下面结合附图对本发明提供的具体实施方式
作详细说明。实施例I
I.检测的癌基因及突变类型
EBV导致NPC发生与EBV的一些潜伏期抗原有关，如latent membrane protein (LMP)和EBV associated nuclear antigen-1 (EBNA-1)。大量研究在NPC患者中重点分析这些病毒基因的突变，如中山大学附属肿瘤医院调查了四会市17个城镇312680人，共发现NPC患者60人；并在国内外首次进行了华南地区EBV全序列測定的工作，发现EBNA基因变异与鼻咽癌相关。该项目组发现在鼻咽癌组织中只存在缬氨酸型(V-val)EBNA1 (检出率98. 1%)，而在外周血淋巴细胞和唾液除可检测到EBNAl V-valタト,还能检测到丙氨酸型(P_ala)和 苏氨酸型(P-thr)EBNAl。并且发现在外周血淋巴细胞和唾液中，几乎所有V-val突变病毒株均与P-ala病毒株混合感染。因而本发明从检出效率的角度出发，在外周血和唾液能检测到的两种基因型P-ala及P-thr中，重点检测P_thr。为使本发明今后能扩展到预测EBV相关的其他肿瘤发病风险，本发明还检测亮氨酸型(V-Ieu) EBNAl。曾木圣等报道华南NPC患者V-Ieu突变基因型检出率为96. 2%，而Karen等在巴西和美国EBV相关淋巴瘤患者中进行EBNAl基因测序，发现在Hodgkin病中V-Ieu突变率也很高，分别为巴西(76. 5%，13/17)，美国(33. 3%，4/12)。因此本发明重点检测EBNA-I基因编码区P-thr、V-val及V-Ieu共3种基因型。研究还发现，EBNAl基因不仅编码区的突变与NPC发现相关，而且启动子的突变也与肿瘤密切相关。有研究认为，EBV启动子的BamHI F (Fp)多态性与EBNAl基因转录，进而导致 NPC 发生有关(详见 J. Virol. 1992; 66:706 - 714)。fcooks 等检测了 C15、C17、C18及C19等多种NPC细胞系，均发现Fp型启动子是NPC中EBNAl基因转录的关键因子(J.Virol. 1992; 67: 3182-3190)。但是，EBNAl基因在淋巴瘤等肿瘤中的激活机制与NPC并不相同(J. Virol. 1992; 66:706 - 714)，还可能存在Cp、Zp等启动子等EBNAl基因激活机制。为使本发明能在EBV相关其他肿瘤中得到拓展，本发明将总共检测Fp、Cp及Zp三种启动子。对于LMPl基因，Xhol-loss、30bp Deletion两种基因型是最常检测的基因突变。如针对30bp Deletion，台湾学者报道癌肿组织中频率为100%(48/48 ;详见Int. J. Cancer1996，62: 673 - 677)，香港为 92%(34/37 ;详见 Int. J. Cancer 1996，66:711 - 712)。曾木圣等报道华南NPC患者癌肿组织，测序法检测到两种基因突变频率为90. 3%(XhoI-loss)和84. 0%(30bp Deletion)(详见 JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 2005, p. 15323 - 15330)。而Hui Shien See等采用PCR酶切法分析马来西亚NPC患者LMPl基因突变，发现在癌肿组织两种基因突变频率为87. 2%和55. 9% ;即使采用灵敏度不高的PCR酶切法，也在外周血中两种基因突变频率也达到 36. 7%和 24. 1%(详见World J Surg Oncol. 2008 Feb 15;6:18.)。因而本发明重点检测LMPl基因Xhol-loss、30bp Deletion两种突变。但是不同人群LMPl基因突变还存在不同特点，如Hui Shien See从上述NPC癌肿组织抽出两例进行测序，均发现了 LMPl基因第366位密码子发现突变Ser366Thr (详见World J Surg Oncol. 2008 Feb 15;6:18.);但这种突变似乎在华南人群并不常见，因为曾木圣等的测序结果未发现该突变(详见JOURNAL OF VIROLOGY, Dec. 2005, p. 15323 -15330)。本发明同时还检测Ser366Thr这种突变，以利今后对比华南和东南亚人群NPC发病的不同。总的说来，本发明3个竞争性荧光定量PCR，每个竞争性荧光定量PCR均检测3个基因突变。因为荧光定量PCR仪可以检测4色荧光，有一色荧光(ROX)要成为定量PCR反应的内參，使定量反应准确(參见美国应用生物系统(Applied Biosystems, ABI)公司的定量PCR反应说明)。这样每个竞争性荧光定量PCR反应检测3种基因突变效率最高，也可以充分利用荧光定量PCR仪的4色荧光。采用3个多重荧光定量PCR检测9种基因突变
①第一个反应检测=EBNA-I基因编码区P-thr、V-val及V-Ieu共3种基因型；
②第二个反应检测=EBNA-I基因启动子Cp、Fp及Zp共3种基因型；③第三个反应检测LMP1基因Xhol-loss、30bpDeletion及Ser366Thr共3种基因型。2.标准品的构建
基本病毒株为B95. 8，购自美国ATCC (作为EBNA-I P_ala及LMPl基因野生型的标准品)；其他各种突变基因型均由B95. 8病毒株采用定点诱变技术(美国Stratagene试剂盒QuikChange site-directed mutagenesis kit)犾得。3.针对各种突变基因型所采用的突变引物对如下
①EBNA-IP-thr :5’_CCG ACT TGT GAT GAA ACT GGA CTC AGG GCC_3’(SEQ ID NO. I)及其反义链；
②EBNA-I V-val: 5’ - GTT AGT GAG GAA AAT GGA CTC ATT GCC ATT-3’ (SEQ IDNO. 2)及其反义链；
③EBNA-IV-Ieu: 5’_CCG ACT TGT GAG GAT AAT AGA CTC ATT GCC_3’(SEQ ID NO. 3)及其反义链；
④Cp启动子
5’-CTTCGGTGTCCTTGTCTCTATGCCATCTGATCTAAAATTTGCAGCAGAA-3’ (SEQ ID NO. 4)及其反义链；
⑤Fp启动子
5’ -AGTGGTCCCCTCCGGATCCCCCTCCTCTCTATCCACCGCCGCCCCGGAACAGGACC-3’ (SEQ IDNO. 5)及其反义链；
⑥Zp启动子
5’-CAAAGATAGCAAAGGTGGCCGGCAAGGTGCAATGTTTAGGAGTTACCTGT-3’ (SEQ ID NO. 6)及其反义链；
⑦LMPl 基因 XhoI-Ioss
5’-CACGGCCCCCTCTCCCCCCCCCTCCCTCTTCCATA-3’ (SEQ ID NO. 7)及其反义链；
⑧LMPl基因 30bp Deletion :5’_TCG ATG ACA GAC GGT GGC GGT GAT CCA CM CTT-3’(SEQ ID NO. 8)及其反义链；
⑨LMPl 基因 Ser366Thr :5’-ACG CTG CTT TTG GGT ACT TCT GGT TCC GGT GGA-3’(SEQ ID NO. 9)及其反义链。4.多重荧光定量PCR的引物及探针设计
①EBNA-I基因编码区采用统一引物 5，- GAA ATT TGA GAA CAT TGC AGA AG-3’ (SEQ ID NO. 10)和 5，- GGTCC AGG GGC CAT TCC AA-3’ (SEQ ID NO. 11)扩增。针对P-thr特异性探针FAM-ACTTGT GAT GAA ACT GGA CTC AGG(SEQ ID NO. 12)； 针对 V-val 特异性探针 HEX- GTT AGT GAG GAA AAT GGA CTC ATT (SEQ ID NO. 13)； 针对 V-Ieu 特异性探针 CY3-ACT TGT GAG GAT AAT AGA CTC ATT (SEQ ID NO. 14)。②EBNA-1基因启动子
采用统一引物 5’- CCA CAA ATC ATC TAA ACC GTA AG-3，(SEQ ID NO. 15)和 5’- AGTGAC CCC GAA ATC GAA CA-3’ (SEQ ID NO. 16)扩增。针对Cp 特异性探针 FAM-GTC CTT GTC TCT ATG CCA TCT (SEQ ID NO. 17)；针对 Fp 特异性探针 HEX- TCT CTA TCC ACC GCC GCC CCG GAA (SEQ ID NO. 18)；
针对 Zp 特异性探针 CY3-AAG GTG CAA TGT TTA GGA GTT AC (SEQ ID NO. 19)。③LMPl 基因
针对 Xhol-loss，采用引物 5’- TG GAA CAC GAC CTT GAG AGG -3，(SEQ ID NO. 20)和5，-AC AGT AGC GCC AAG AGC AG-3，(SEQ ID NO. 21 )，以及特异性探针 FAM- CAC GGC CCCCTC TCC CCC CCC CTC CCT CTT (SEQ ID NO. 22)进行扩增。另两种突变采用引物5’ -CGG AAG AGG TGG AAA ACA AAC-3’ (SEQ ID NO. 23)和5’ - GTG GGG GTC GTC ATC ATC TCG-3’ (SEQ ID NO. 24)扩增。针对30bp Deletion 特异性探针 HEX- ATG ACA GAC GGT GGC GGT GAT CCA (SEQID NO. 25)；
针对 Ser366Thr 特异性探针 CY3-CTG CTT TTG GGT ACT TCT GGT TCC GGT (SEQ IDNO. 26)。5.多重荧光定量PCR的反应体系和反应条件
反应体系
权利要求
1.Epstein-Barr病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒含有以下试剂 a、扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对；和 b、Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针，所述的基因突变为EBNA-I基因编码区的 P-thr、V-val 和 V_leu，EBNA-I 基因启动子 Cp、Fp 和 ZpJP LMPl 基因 Xhol-loss、30bp Deletion 和 Ser366Thr ； C、不同浓度的Epstein-Barr病毒基因突变标准品系列； d、用于荧光定量PCR反应的PCR反应液(包含ROX荧光、dNTP、DNA聚合酶及其缓冲液)。
2.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增Epstein-Barr病毒关键革巴基因突变的特异性引物对为 a、EBNA-I基因编码区SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11 ； b、EBNA-I基因启动子SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 ；c、LMPl基因 XhoI-Ioss :SEQ ID NO. 20 和 SEQ ID NO. 21，LMPl 基因 30bp Deletion 和Ser366Thr SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24。
3.根据权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述的Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针具有下列核苷酸序列 a、针对P-thr特异性探针SEQID NO. 12，针对V_val特异性探针SEQ ID NO. 13，和针对V-Ieu特异性探针SEQ ID NO. 14 ； b、针对Cp特异性探针SEQID NO. 17，针对Fp特异性探针SEQ ID NO. 18，针对Zp特异性探针 SEQ ID NO. 19 ； C、针对XhoI-Ioss特异性探针SEQ ID NO. 22，针对30bp Deletion特异性探针SEQ IDNO. 25，针对 Ser366Thr 特异性探针 SEQ ID NO. 26。
4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒在制备检测鼻咽癌疾病药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及EBV病毒的多重荧光定量PCR检测试剂盒，所述的试剂盒含有以下试剂a、扩增Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性引物对；和b、Epstein-Barr病毒关键靶基因突变的特异性探针，所述的基因突变为EBNA-1基因编码区的P-thr、V-val和V-leu，EBNA-1基因启动子Cp、Fp和Zp，和LMP1基因XhoI-loss、30bpDeletion和Ser366Thr。本发明优点在于能够达到准确预测高危人群鼻咽癌发病风险的目的；掌握高危人群体内的主要致癌突变，将鼻咽癌的人群筛查和人群干预结合起来；具有高灵敏度，操作快速，成本较低的优点，具有广阔的市场。
文档编号G01N21/64GK102839222SQ20111016510
公开日2012年12月26日 申请日期2011年6月20日 优先权日2011年6月20日
发明者刘斌 申请人:广州市第十二人民医院
专业数控铣床产品供应商
20年生产经验，实力工厂，精工品质，质量有保障
