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专利名称：一种基于量子点荧光定量检测过敏原α-乳白蛋白的方法
技术领域：
本发明属于食品分析技术领域，涉及ー种分析检测食品中过敏原的方法。
背景技术：
乳制品是人们重要的食物蛋白来源，同时又是易引起特定人群过敏的食物，严重�：ψ畔�费者健康。解决食物过敏的首要任务是检测过敏原，以便于过敏食物的风险评估、生产和标示。美国和欧盟对八大类主要过敏食品均要求标示以提醒消费者。乳制品中过敏成分复杂，据统计，超过51%牛乳过敏患者的过敏原是α-乳白蛋白。因此，开展针对α-乳 白蛋白的检测，对预防乳制品引发的过敏具有重要意义。目前，食物过敏原检测有PCR、RT-PCR、HPLC, ELISAjf -质联用等技术，这些技术价格昂贵、费吋、灵敏度和特异性低，应用受到限制。由于激发食物过敏反应的阈值有个体化差异，加之，过敏食物中过敏成分复杂，因此，建立高效、特异、灵敏的食物过敏原检测新技术是未来发展趋势。量子点是ー种直径在1-100 nm之间，能够接受激发光产生荧光的半导体纳米颗粒，具有宽激发、窄发射、发射峰可调以及荧光寿命长等优良特性。近年来，在医学、生物学领域，人们集中研究用量子点代替传统的化学荧光标记物用于免疫学检测。根据量子点的这些光学特点，以其标记单克隆抗体建立免疫吸附技术可定量检测食品中过敏原，将大大提高检测方法的灵敏度和特异性。目前，在我国，利用荧光量子点标记单抗技术针对食品中过敏原快速定量检测还是空白。

发明内容
本发明的主要目的在于提供ー种基于荧光量子点定量检测粉剂和液态奶制品中过敏原α-乳白蛋白的方法。该方法准确、快速、操作简单、特异性好、灵敏度高。为实现上述目的，本发明所采取的技术方案如下。I、α-乳白蛋白单克隆抗体的制备。以α-乳白蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，采用腹部皮下多点注射方式免疫，利用细胞融合技术将脾细胞与骨髄瘤细胞融合获得可分泌抗体的细胞株，通过筛选得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并借助小鼠体内诱生腹水法大量制备抗体，最后经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到单克隆抗体。2、量子点偶联单克隆抗体。量子点偶联单克隆抗体采用碳ニ亚胺法。选用羧基修饰后的CdSe/ZnS量子点，通过I-(3-ニ甲氨基丙基)-3-こ基碳ニ亚胺盐酸盐(EDC)、#-羟基琥珀酰亚胺(NHS)两种偶联剂的作用使量子点表面羧基与α-乳白蛋白单克隆抗体表面氨基共价偶联。偶联时，量子点、EDC、NHS和α -乳白蛋白单克隆抗体按照1:10:6:4的摩尔比进行偶联。其中EDC、NHS均用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液配制，取量子点加入EDC溶液中室温涡旋活化5 min后，再加入一定量的NHS溶液反应5-10min，最后取α-乳白蛋白单克隆抗体加入反应液后涡旋混匀，置于37°C摇床上避光反应I. 5-2h。偶联结束后，将偶联产物用截留分子量为3kDa的超滤管超滤除去剰余的偶联剂，并浓缩至200-300 Uし3.量子点标记α-乳白蛋白单克隆抗体的纯化。采用SephadeX-G200凝胶层析柱纯化偶联产物，去除未反应的α -乳白蛋白单克隆抗体和量子点。首先，利用磷酸盐缓冲液(PBS)平衡层析柱，流速0.2 mL/min;取经超滤后偶联混合物上样，上样结束后，开始用PBS洗脱，同时打开自动收集器收集洗脱液；由于偶联产物中的量子点标记单抗分子量比游离α-乳白蛋白单克隆抗体大，在凝胶过滤层析时，量子点标记α-乳白蛋白单克隆抗体先被洗脱出来，游离单抗稍后被洗脱出来(见图I )。洗脱结束后，利用超滤管浓缩两个洗脱峰，并在荧光紫外灯下观察，发现峰a有荧光，而峰b未见荧光，所以判断峰a为纯化后的量子点标记α-乳白蛋白单克隆抗体。4.荧光吸收光谱分析。将量子点及偶联产物分别用PBS稀释后置于比色皿中，365 nm激发光激发，在350-700 nm范围内扫描发射波长，对比偶联前后量子点最大发射峰峰值变化(图2)。从图谱2中a可知量子点在575nm处有发射峰，而偶联抗体量子点在572nm处有发射峰，蓝移3nm，同时荧光強度增强。引起发射峰位变化的原因可能是CdSe/ZnS量子点表面的羧基与抗体表面氨基共价偶联后，使量子点的表面电荷数減少，从而降低了量子点间的偶极与偶极的相互作用，导致Stokes位移减�。�其荧光发射峰发生了蓝移，由此证明偶联过程顺利且有效。5.竞争性FLISA法检测α-乳白蛋白的标准曲线绘制。采用棋盘滴定确定最佳纯化α -乳白蛋白以及荧光标记单克隆抗体稀释倍数。用碳酸盐缓冲液稀释纯化的α-乳白蛋白，96孔酶标板每孔100 yL，4°C包被过夜，PBS清洗三次，毎次5 min扣干，每孔加250 μ L，1%明胶液37°C封阻I h后清洗，每孔加入浓度梯度已知的纯化α-乳白蛋白与量子点标记α-乳白蛋白单克隆抗体预混液100 yL，37°C反应I h后采用荧光酶标仪检测吸光值，根据吸光值与浓度的关系绘制(荧光值-浓度)α -乳白蛋白标准曲线。6.被检测样品的预处理。(I)液态乳制品取一定量的市购液态乳制品于离心管中，采用低温冷冻离心机8000rpm，4°C离心lOmin，去除脂肪层，取样以磷酸盐缓冲液稀释100倍后作为检测样。(2)粉剂乳制品商品称取粉剂商品以磷酸盐缓冲液溶解配成100 mg/mL溶液，涡旋混匀后离心去沉淀，取上清以磷酸盐缓冲液稀释100倍后作为检测样。7.样品检测。将所需检测食品进行相应预处理，得到检测样。根据上述方法包被纯化蛋白、封阻清洗后，每孔加入经预处理的乳制品与荧光标记α-乳白蛋白单克隆抗体预混液100 UL,37°C反应lh，荧光酶标仪检测吸光值，得到的吸光值带入标准曲线计算出被检食品中过敏原α-乳白蛋白的含量。本发明的优点是1、本发明利用量子点标记单克隆抗体检测过敏原，结合了量子点荧光的高灵敏性和单抗识别抗原的特异性的优点；2、基于量子点标记抗体的竞争性免疫吸附定量检测乳及乳制品中α-乳白蛋白的方法，具有快速、操作简便、稳定、特异性好和灵敏度高等特点，便于高通量分析检测；3、本发明所建立的方法将为高通量分析检测多种、食品中相关过敏原提供了一种有效的手段，具有良好的推广和应用前景。


图I为偶联产物层析效果。a:量子点偶联α-乳白蛋白单克隆抗体；b:未偶联量子点的游离α-乳 白蛋白单克隆抗体。图2为量子点偶联单抗前后荧光光谱分析。a :量子点；b :偶联α -乳白蛋白单克隆抗体后量子点。
具体实施例方式本发明将通过以下具体实例作进ー步说明。实施例I :定量检测优乐美奶茶中过敏原α -乳白蛋白。I.样品预处理。称取优乐美奶茶速溶粉以磷酸盐缓冲液溶解配成100 mg/mL溶液，涡旋混匀后离心去沉淀，取上清以磷酸盐缓冲液稀释100倍后作为检测样。2.样品检测。(I)抗原蛋白用包被液稀释至最佳包被浓度1μ g/ml后加入酶标板中，每孔100yL，4°C包被过夜。(2)洗涤用PBST洗涤三次，每次5min，扣干。(3)封阻选用1%明胶封阻未包被上抗原蛋白的微孔，每孔250 μ L，37°C孵育Iho包被结束后取出以PBST洗涤三次后扣干，每次5 min。(4)竞争反应将竞争抗原蛋白标品在O. 0001-1. 28 μ g/mL范围内做梯度稀释后与量子点标记的单克隆抗体混合，同时取待检样品一式三份，每份50 μ L与等体积量子点标记单抗混合，37°c恒温预反应lh。预反应结束后吸出反应液加入(3)中已封阻好的孔板中，同时设置阴性孔(PBS代替竞争抗原和量子点标记的单克隆抗体)，阳性孔(PBS代替竞争抗原)，37°C孵育Ih后，以PBST洗涤三次。(5)酶标板置于全波长多功能酶标仪下检测荧光值，激发波长为360 nm，发射波长为580 nm。根据荧光值绘制标准曲线，并由线性回归方程及样品荧光值计算样品中乳白蛋白的含量，三次检测取平均值最为检测值。3.結果。绘制标准竞争曲线方程为Y=O. 0892Χ-0. 3577，检测灵敏度O. 03 μ g/mL。优乐美奶茶样品中α-乳白蛋白的含量为O. 23g/L。实施例2 :定量检测蒙牛纯牛奶中过敏原α -乳白蛋白。I.样品预处理。取I mL市购的蒙牛纯牛奶于离心管中，采用低温冷冻离心机8000rpm，4°C离心lOmin，去除脂肪层，取样以磷酸盐缓冲液稀释100倍后作为检测样。2.样品检测。(I)抗原蛋白用包被液稀释至得最佳包被浓度I μ g/mL后加入酶标板中，每孔100yL，4°C包被过夜。
(2)洗涤用PBST洗涤三次，每次5min，扣干。(3)封阻选用1%明胶封阻未包被上抗原蛋白的微孔，姆孔250 μ L,37°C孵育lh。包被结束后取出以PBST洗涤三次后扣干，每次5min。(4)竞争反应将竞争抗原蛋白标品在O. 0001-1. 28 μ g/mL范围内做梯度稀释后与量子点标记的单克隆抗体混合，同时取待检样品一式三份，每份50 μ L与等体积量子点标记单抗混合，37°C恒温预反应lh。预反应结束后吸出反应液加入(3)中已封阻好的孔板中，同时设置阴性孔(PBS代替竞争抗原和量子点标记的单克隆抗体)，阳性孔(PBS代替竞争抗原)，37°C孵育Ih后，以PBST洗涤三次。 (5)酶标板置于全波长多功能酶标仪下检测荧光值，激发波长为360 nm，发射波长为580 nm。根据荧光值绘制标准曲线，并由线性回归方程及样品荧光值计算样品中乳白蛋白的含量，三次检测取平均值最为检测值。3.結果。绘制标准竞争曲线方程为Υ=0·0892Χ-0·3577，检测灵敏度0.03yg/mL。样品中α-乳白蛋白的含量为1.58 g/L，而常乳中α-乳白蛋白的含量约为O. 8-2. O g/L，说明这种检测方法是可行的。
权利要求
1.一种基于量子点荧光定量检测过敏原α-乳白蛋白的方法，其特征是按下列步骤 (1)以α-乳白蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠，采用腹部皮下多点注射方式免疫，利用细胞融合技术将脾细胞与骨髓瘤细胞融合获得可分泌抗体的细胞株，通过筛选得到分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，并借助小鼠体内诱生腹水法大量制备抗体，最后经辛酸-硫酸铵沉淀法纯化得到α-乳白蛋白单克隆抗体； (2)将羧基修饰后的CdSe/ZnS量子点、1_(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、斧羟基琥珀酰亚胺和α-乳白蛋白单克隆抗体按1:10:6:4的摩尔比进行偶联，其中I-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、Ν~羟基琥珀酰亚胺均用pH值为7. 4的磷酸盐缓冲液配制，取CdSe/ZnS量子点加入1_ (3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液中室温涡旋活化5 min后，再加入羟基琥珀酰亚胺溶液反应5-10min，最后取α-乳白蛋白单克隆抗体加入反应液后涡旋混匀，置于37°C摇床上避光反应1.5-2h ;偶联结束后，将偶联产物用截留分子量为3kDa的超滤管超滤除去剩余的偶联剂，浓缩； (3)用磷酸盐缓冲液平衡层析柱，流速O.2 mL/min ;取步骤(2)的偶联混合物上样，上样结束后，用磷酸盐缓冲液洗脱，收集洗脱前期的洗脱液，即为纯化后的量子点标记α -乳白蛋白单克隆抗体； (4)用碳酸盐缓冲液稀释步骤(3)得到的α-乳白蛋白，96孔酶标板每孔100yL,4°C包被过夜，PBS清洗三次，每次5 min扣干，每孔加250 μ L，1%明胶液37°C封阻I h后清洗，每孔加入浓度梯度已知的α -乳白蛋白与量子点标记α -乳白蛋白单克隆抗体预混液100yL，37°C反应I h后采用荧光酶标仪检测吸光值，根据吸光值与浓度的关系绘制α-乳白蛋白标准曲线； (5)样品检测将所需检测食品进行去脂预处理，包被α-乳白蛋白、封阻清洗后，每孔加入经预处理的乳制品与量子点标记的α -乳白蛋白单克隆抗体预混液100 μ L，37°C反应lh，荧光酶标仪检测吸光值，得到的吸光值带入标准曲线计算出被检食品中过敏原α-乳白蛋白的含量。
全文摘要
一种基于量子点荧光定量检测过敏原α-乳白蛋白的方法及其应用，以α-乳白蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，利用荧光量子点偶联标记α-乳白蛋白单克隆抗体，采用竞争性免疫吸附法形成荧光免疫复合物，然后在全波长多功能酶标仪下检测荧光信号，通过建立标准曲线，实现食品中过敏原α-乳白蛋白的定量检测。本发明构建的方法可广泛应用于各种粉剂和液态奶制品中相关过敏原检测，且具有快速、准确、灵敏度高、重现性好和特异性佳等特点，为高通量检测多种食品中相关过敏原提供了一种有效的手段，具有良好的推广和应用前景。
文档编号G01N21/64GK102680705SQ20121014855
公开日2012年9月19日 申请日期2012年5月15日 优先权日2012年5月15日
发明者余宙, 佟平, 刘波, 吴志华, 李欣, 杨安树, 程芬芬, 郑义成, 陈红兵, 龙彩云 申请人:南昌大学