专利名称：一种胰蛋白酶的检测方法
技术领域：
本发明涉及蛋白质检测领域，尤其涉及一种胰蛋白酶的检测方法。
背景技术：
蛋白酶能够催化水解靶蛋白中的特异性肽键，涉及调控重要的生理、病理过程。胰蛋白酶是一种由胰腺分泌的水解酶，可将肽链中赖氨酸和精氨酸残基的羧基端切断，胰蛋白酶在医药、食品及工业生产中均有应用，能溶解变形蛋白质，对未变性的蛋白质无作用，能使脓液、痰液、血凝块等分解、变�。铀俅疵婢换褂锌寡椎淖饔茫涣俅采嫌糜谂�、血胸、外科炎症、溃疡、创伤性损伤、瘘管等所产生的局部水肿、血肿及脓肿等；胰蛋白酶在促进其他胰腺酶原活化，控制胰腺外分泌功能中具有重要作用；胰蛋白酶的升高是急性酒精 性胰腺炎最准确的指示器；胰蛋白酶的缺乏或变异将会引起胎粪性肠梗塞、遗传性胰腺炎等胰腺疾病。因此胰蛋白酶的检测在健康、医药和食品质量控制中具有重要的作用。现有技术中胰蛋白酶的检测方法主要有荧光法、电化学法、比色法。荧光法一般需要选择合适的荧光标记物，并要对探针进行荧光标记，电化学方法涉及复杂的电极修饰，步骤繁琐。金属与蛋白质结合成为金属纳米簇，当金属纳米簇与胰蛋白酶混合时，金属纳米簇中的蛋白质被胰蛋白酶水解后与金属分离，分离后的金属粒子会发生团聚，溶液的颜色会发生改变，可通过比色来实现胰蛋白酶的检测，如Lin等(Biomaterials, 2010, 31,6087-6095)将胰蛋白酶底物和1_巯基己醇吸附在金纳米颗粒表面，当胰蛋白酶水解底物，金纳米颗粒的稳定环境被破坏，产生聚集；Zhang等(Analyst, 2011,136, 3136-3141)基于短的聚精氨酸(Arg6)能够诱导金纳米颗粒聚集，而聚精氨酸被胰蛋白酶水解为小的片段后不能诱导金纳米颗粒聚集。比色方法无需修饰和标记，相对简单，易于操作。
发明内容
本发明旨在解决上述现有技术中存在的问题，提出一种利用比色进行胰蛋白酶检测的方法，步骤简单，易于操作。本发明提供了一种胰蛋白酶检测方法，包括以下步骤将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值；检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属纳米粒子形成。 优选地，所述的核-壳型纳米颗粒选自多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒、多聚精氨酸-金纳米颗粒或多聚精氨酸-银纳米颗粒。优选地，所述的反应温度为30_40°C。优选地，所述的反应时间为l_2h。
优选地，所述的反应温度为37°C，反应时间为2h。优选地，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质的质量比为(5-50)μ moI : (5-50)mg。优选地，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质的质量比为I μ mo I : Img0优选地，所述的核-壳型纳米颗粒按照以下方法制备将金属离子和蛋白质或多肽混合，得到混合溶液；将混合溶液放置于50-70°C下孵育O. 5_3h。优选地，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。 本发明的胰蛋白酶检测方法利用蛋白质或多肽包被金属形成核-壳型纳米颗粒，既作为胰蛋白酶作用的底物，又作为颜色变化的指示剂，未加入胰蛋白酶时，溶液显示的为核-壳型纳米颗粒的颜色，当与胰蛋白酶混合后，核-壳型纳米颗粒表面的蛋白质被水解，核-壳型纳米颗粒结构被破坏，金属核心暴露并发生聚集，形成金属纳米粒子，溶液的颜色发生变化，核-壳型纳米颗粒的颜色变浅，金属纳米粒子的颜色得到显现，利用这两种颜色吸光值的比值表征核-壳型纳米颗粒的减少量，即蛋白质被水解的量，即也表征胰蛋白酶的含量。本发明的有益效果在于，本发明提供的胰蛋白酶检测方法操作简单，且无需对探针进行修饰或标记。
图I是实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱。图2是实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒的粒径分布图。图3是实施例I中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。图4是实施例2中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。图5是实施例3中的胰蛋白酶浓度与吸光度比值的标准曲线图。图6是实施例5中胰蛋白酶检测的特异性对比图。
具体实施例方式为了使本领域的技术人员更好的理解本申请的技术方案，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。本发明提供了一种胰蛋白酶的检测方法，包括以下步骤将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值；检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属形成。胰蛋白酶为蛋白水解酶的一种，能够选择性的水解蛋白质，只作用于精氨酸和赖氨酸的羧基端，在医药、食品、工业生产中都有着广泛的应用。本发明以核-壳型纳米颗粒作为颜色变化的指示剂，利用胰蛋白酶水解核-壳型纳米颗粒中的蛋白质后金属发生聚集形成金属纳米粒子，产生颜色变化，利用比色法对胰蛋白酶进行检测。本发明的检测方法中所述的核-壳型纳米颗粒优选按照以下方法制备将金属离子和蛋白质混合，得到混合溶液；将混合溶液放置于50_70°C下孵育O. 5_3h。优选地，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。核-壳型纳米颗粒是一种由金属作为核心，蛋白质或多肽分子作为保护基团组装 而成的核-壳型纳米颗粒，为水溶性，在可见光到近红外光区范围内可发射光谱，还具有生物相容性好、光稳定性强等优点。本发明中金属优选为金离子或银离子，更优选为金离子，最优选为氯金酸中的金离子；所述的蛋白质或多肽优选为多聚精氨酸或多聚赖氨酸，更优选为多聚赖氨酸；所述的金属的物质的量与蛋白质或多肽的质量比优选为(5-50) μ mol (5-50)mg，更优选为(25-50) μ mo I : (25-50) mg,最优选为 I μ mo I : Img。得到混合溶液后，将混合溶液置于50_70°C下孵育O. 5_3h，更优选为65_70°C下孵育O. 5-3h，最优选为65°C下孵育3h，反应后得到本发明的核-壳型纳米颗粒。得到核-壳型纳米颗粒后，将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒混合，核-壳型纳米颗粒优选为多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒、多聚精氨酸-金纳米颗粒或多聚精氨酸-银纳米颗粒，更优选为多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒，最优选为多聚赖氨酸-金纳米颗粒；胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒混合反应温度采用本领域技术人员熟知的胰蛋白酶最适温度，优选为30-40°C，更优选为37°C ;胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒混合反应时间优选为l_2h，更优选为2h。反应完毕后，得到反应产物，检测核-壳型纳米颗�：徒鹗裟擅琢Ｗ拥奈庵担龅暮�-壳型纳米颗粒测定波长优选为核-壳型纳米颗粒紫外-可见光吸收光谱中吸光值得到最大值时对应的波长，金属纳米粒子测定波长优选为金属纳米粒子紫外-可见光吸收光谱中吸光值得到最大值时对应的波长。根据上述技术方案得到核-壳型纳米颗�：徒鹗裟擅琢Ｗ拥奈庵岛螅扑闼鼋鹗裟擅琢Ｗ佑牒�-壳型纳米颗粒吸光值的比值，根据所述比值与标准曲线对比，得到胰蛋白酶的含量。其中，所述的标准曲线中金属纳米粒子与核-壳型纳米颗粒吸光值的检测与所述的技术方案中金属纳米粒子与核-壳型纳米颗粒吸光值的检测方法相同，按照一定的浓度梯度配置胰蛋白酶溶液，即为胰蛋白酶标准溶液，将已知浓度的胰蛋白酶标准溶液与核-壳型纳米颗粒混合反应，计算各个浓度的胰蛋白酶标准溶液反应产物的金属纳米粒子与核-壳型纳米颗粒吸光值的比值，根据金属纳米粒子与核-壳型纳米颗粒吸光值的比值与胰蛋白酶浓度的对数作图(胰蛋白酶浓度的对数为横坐标，金属纳米粒子与核-壳型纳米颗粒吸光值的比值为纵坐标)，进行线性回归分析，得到胰蛋白酶浓度与所述比值的线性方程。所述的胰蛋白酶标准溶液的配置采用本领域人员熟知的胰蛋白酶标准溶液的配置方案。所述的胰蛋白酶标准溶液浓度优选为(10-9-10-3) g/mL。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例试剂配置多聚赖氨酸溶液称取多聚赖氨酸(分子量30000 70000) 5mg溶于ImL超纯水中，分装，冻存，备用。多聚赖氨酸溶液浓度为5mg/mL。聚精氨酸溶液称取聚精氨酸(分子量30000 70000) 5mg溶于ImL超纯水中，分装，冻存，备用。聚精氨酸溶液浓度5mg/mL。氯金酸溶液将Ig三水合氯金酸溶于50mL超纯水中，盛于棕色试剂瓶中，4°C保存，备用。氯金酸溶液浓度为O. 05mol/L。胰蛋白酶溶液称取胰蛋白酶lmg，溶于ImL PBS(10mM,pH = 7. 4)中，分装，冻存， 备用。胰蛋白酶溶液浓度为lmg/mL。牛血清白蛋白BSA溶液称取BSA Img,溶于 ImL PBS(10mmol/L,pH = 7. 4)中，4°C保存，备用。BSA溶液的浓度为lmg/mL。实施例I取200 μ L，5mg/mL多聚赖氨酸溶液溶于780 μ L超纯水中，取20 μ L，O. 05mol/L氯金酸溶液与多聚赖氨酸溶液溶混合，震荡数秒，在65°C下，培育3h，即得到多聚赖氨酸包被的核-壳型纳米颗粒。图I为核-壳型纳米颗粒的紫外-可见吸收光谱，核-壳型纳米颗粒的最大吸收波长为530nm ;图2所示为核-壳型纳米颗粒的粒径分布，所制备的核_壳型纳米颗粒的粒径约为20. 49nm。将lmg/mL胰蛋白酶溶液稀释为胰蛋白酶终浓度分别为250 μ g/mL，10 μ g/mL，I U g/mL, 0. I μ g/mL, 0. 01 μ g/mL 的标准溶液。取50 μ L制得的核-壳型纳米颗粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶标准溶液，反应体系的终体积为400 μ L，在37°C下，反应2h，即可观察到反应前后溶液颜色的变化。实验得知，金属纳米粒子的最大吸收波长为600nm。本实施例中核-壳型纳米颗粒呈粉红色，由于多聚赖氨酸被水解，核-壳型纳米颗粒的蛋白质外壳被破坏，金属发生团聚形成金属纳米粒子，反应后溶液呈紫色。将反应后的溶液分别在600nm和530nm下检测吸光值，并计算二者的比值。以胰蛋白酶质量浓度的对数为横坐标，以反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图3所示，本实施例中胰蛋白酶质量浓度的对数与反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值之间正相关，线性回归曲线方程为Y =
O.12071gC+l. 5478，R2为O. 9737，其中C为胰蛋白酶的质量浓度，Y为反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值，线性范围为10_4_10_8g/mL。本发明的胰蛋白酶检测方法具有较高的灵敏度，检测线可达10_8g/mL。实施例2取40 μ L, 5mg/mL多聚赖氨酸溶液溶于920 μ L超纯水中，取40 μ L,0. 05mol/L氯金酸溶液与多聚赖氨酸溶液溶混合，震荡数秒，在50°C下，培育O. 5h，即得到多聚赖氨酸包被的核-壳型纳米颗粒。将lmg/mL胰蛋白酶溶液稀释为胰蛋白酶终浓度分别为250 μ g/mL，10 μ g/mL，I μ g/mL, O. I μ g/mL, O. OI μ g/mL 的标准溶液。取50 μ L制得的核-壳型纳米颗粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶标准溶液，反应体系的终体积为400 μ L，在30°C下，反应2h，即可观察到反应前后溶液颜色的变化。将反应后的溶液分别在600nm和530nm下检测吸光值，并计算二者的比值。以胰蛋白酶质量浓度的对数为横坐标，以反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图4所示，本实施例中胰蛋白酶质量浓度的对数与反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值之间正相关，线性回归曲线方程为Y =
O.12581gC+l. 5517，R2为O. 8506，其中X为胰蛋白酶的质量浓度，Y为反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值。实施例3·
取400 μ L, 5mg/mL多聚赖氨酸溶液溶于596 μ L超纯水中，取4μ L,0. 05mol/L氯金酸溶液与多聚赖氨酸溶液溶混合，震荡数秒，在70°C下，培育3h，即得到多聚赖氨酸包被的核-壳型纳米颗粒。将lmg/mL胰蛋白酶溶液稀释为胰蛋白酶终浓度分别为250 μ g/mL，10 μ g/mL，I U g/mL, 0. I μ g/mL, 0. 01 μ g/mL 的标准溶液。取50 μ L制得的核-壳型纳米颗粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶标准溶液，反应体系的终体积为400 μ L，在40°C下，反应lh，即可观察到反应前后溶液颜色的变化。将反应后的溶液分别在600nm和530nm下检测吸光值，并计算二者的比值。以胰蛋白酶质量浓度的对数为横坐标，以反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值为纵坐标绘制标准曲线，结果如图5所示，本实施例中胰蛋白酶质量浓度的对数与反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值之间正相关，线性回归曲线方程为Y =
0.15741gC+l. 7239，R2为O. 8982，其中X为胰蛋白酶的质量浓度，Y为反应后的溶液在600nm和530nm下吸光值的比值。实施例4取50 μ L实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒分散于300 μ L PBS溶液中，并加入50 μ L胰蛋白酶样品，反应体系的终体积为400 μ L，在37°C下，反应2h，即可观察到反应前后溶液颜色的变化。将反应后的溶液分别在600nm和530nm下检测吸光值，并计算二者的比值为
1.0647。将比值代入到图3的标准曲线中，计算得到胰蛋白酶样品的浓度为100μ g/mL。实施例5取50 μ L实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒分散于250 μ L PBS溶液中，并加入100 μ L lmg/mL的胰蛋白酶溶液，反应体系的终体积为400 μ L，在37°C下，反应2h，即可观察到反应前后溶液颜色的变化。将反应后的溶液检测吸光值。对比例I取50 μ L实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒分散于250 μ L PBS溶液中，并加入100 μ L BSA溶液,反应体系的终体积为400 μ L,在37°C下,反应2h,即可观察到反应前后溶液颜色的变化。将反应后的溶液检测吸光值。对比例2取50 μ L实施例I中制备的核-壳型纳米颗粒分散于250 μ L PBS溶液中，并加入100 μ L超纯水,反应体系的终体积为400 μ L,在37°C下,反应2h,即可观察到反应前后溶液颜色的变化。将反应后的溶液检测吸光值。图6为实施例5，对比例1，对比例2反应后的溶液在不同波长下吸光值的变化，对比例I和对比例2在530nm处吸光值最大，没有发生金属团聚，核_壳型纳米颗粒表面的多聚赖氨酸没有被水解；而实施例5在600nm处吸光值最大,实施例5发生了金属团聚,赖氨 酸被胰蛋白酶水解，对比例I中多聚赖氨酸不能被BSA水解，说明本发明的检测方法对胰蛋白酶有特异性。以上所述的本发明实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。
权利要求
1.一种胰蛋白酶检测方法，包括以下步骤 将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物； 检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值； 检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值； 计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量； 其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属形成。
2.根据权利要求I所述的胰蛋白酶检测方法，其特征在于，所述的核-壳型纳米颗粒选自多聚赖氨酸-金纳米颗粒、多聚赖氨酸-银纳米颗粒、多聚精氨酸-金纳米颗粒或多聚精 氨酸-银纳米颗粒。
3.根据权利要求I所述的胰蛋白酶检测方法，其特征在于，所述的反应温度为30-40。。。
4.根据权利要求I所述的胰蛋白酶检测方法，其特征在于，所述的反应时间为l_2h。
5.根据权利要求I所述的胰蛋白酶检测方法，其特征在于，所述的反应温度为37°C，反应时间为2h。
6.根据权利要求I所述的胰蛋白酶检测方法，其特征在于，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质或多肽的质量比为(5-50) μ mol (5-50)mg。
7.根据权利要求6所述的胰蛋白酶检测方法，其特征在于，所述的核-壳型纳米颗粒中金属的物质的量与蛋白质或多肽的质量比为Iymol Img0
8.—种权利要求I中所述的核-壳型纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤 将金属离子和蛋白质或多肽混合，得到混合溶液； 将混合溶液放置于50-70°C下孵育O. 5-3h。
9.根据权利要求8所述的核-壳型纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述的混合溶液放置于65°C下孵育3h。
10.根据权利要求8所述的核-壳型纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述金属离子的物质的量与蛋白质的质量比为(5-50) μ mol (5-50)mg。
全文摘要
本发明公开了一种胰蛋白酶检测方法，步骤如下将胰蛋白酶与核-壳型纳米颗粒反应，得到反应产物；检测反应产物中核-壳型纳米颗粒的吸光值；检测反应产物中金属纳米粒子的吸光值；计算金属纳米粒子的吸光值与核-壳型纳米颗粒的吸光值的比值，根据标准曲线得到胰蛋白酶的含量；其中，所述的核-壳型纳米颗粒为蛋白质或多肽包被金属形成。本发明还提供了所述核-壳型纳米颗粒的制备方法。本发明提供的胰蛋白酶检测方法操作简单，且无需对探针进行修饰或标记。
文档编号G01N21/78GK102944558SQ20121050608
公开日2013年2月27日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者蔡林涛, 武春雷, 张鹏飞, 粟武 申请人:深圳先进技术研究院
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