专利名称：一种食管癌免疫质谱检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术及质谱检测，具体地说，涉及一种食管癌免疫质谱检测试剂盒。
背景技术：
食管癌是常见的消化道恶性肿瘤。据统计，2008年全球食管癌新发病例为 482300,死亡病例为406800。食管癌分为食管癌和食管腺癌,在我国，食管癌是食管癌的主 要类型，尤其是在北方地区。近年来，虽然对食管癌的治疗取得了一些进展，但是食管癌的 死亡率仍居高不下。究其原因，主要是其早期症状具有隐蔽性和非特异性，临床发现和治疗 的食管癌患者大多已属中、晚期，早期食管癌与中、晚期食管癌的预后有很大差别，经综合 治疗的早期食管癌患者5年生存率可达90%以上，而中、晚期患者只有25%-40%。因此，开展 食管癌的早期诊断早期治疗是目前提高食管癌治疗效果的有效途径。而当食管病变局限于 黏膜或黏膜下时，患者可能尚无感觉或仅有诸如轻微的梗噎感、胸骨后烧灼感等非特异性 症状，使早期诊断食管癌非常困难。
目前，国内外常采用的食管癌检测方法有脱落细胞学、内镜技术、标志物检查等方 法。食管上皮脱落细胞的获取方法有食管拉网及毛刷，经盐水冲洗、沉淀后做涂片检查。食 管拉网法是我国沈琼教授发明的，其特异度可达99%，敏感度为44%-90%，但由于这一方法 使受检者较为痛苦，难以作为普查手段在一般人群中开展，经过半个多世纪的实践发现， 在高发区食管拉网方法的受检率越来越低。内镜检查并进行活检是现今食管癌的主要确诊 手段，且随着其他技术与内镜的结合，产生了一些新的检查方法，明显提高了早期食管癌的 检出率，但其依然存在明显的缺陷，如可能会加重受检者的不适，诊断结果依赖于操作者的 经验和技巧等。运用组织标志物诊断食管癌，前提必然是要取得肿瘤组织或细胞，这只能通 过有创的、甚至繁琐的操作才能达到，并不适合人群普查。所以，积极寻找创伤小、检测方 便的食管鳞癌血清标志物检测方法成为当今临床诊断的热点。发明内容
本发明的目的是提供一种食管癌免疫质谱检测试剂盒。
为了实现本发明目的，本发明的一种食管癌免疫质谱检测试剂盒，其含有保藏号 为CGMCC No. 5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体，所述单克隆抗体共价连 接于固相载体上。
其中，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒等。
优选地，所述单克隆抗体可固定于固相载体上，如通过共价连接方式固定于包被 蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒上。
本发明选用的包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒(Protein GAgarose/Protein A Agarose)是免疫沉淀的基质,与包被蛋白G或蛋白A的磁珠(Protein G magnetic beads/ Protein A magnetic beads)相比，更具成本低的优点。
进一步地，本发明的食管癌免疫质谱检测试剂盒中还含有洗脱液，所述洗脱液任选 pH 值 2. 7 的 O. lmol/1 甘氨酸-HCl 溶液、5% 乙酸或含 O. l%(v/v) TFA 的 50-70% (v/v) ACN 溶液中的一种。
本发明中，抗人食管癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，是以多肽标志物抗原(序列为 Asn-Leu-Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-Hi s-Gln的多肽，命名为多肽5)与载体蛋白匙孔血蓝蛋白(KLH)的偶联物免疫原，免疫BALB/ C小鼠，然后筛选出的杂交瘤细胞株。本发明提供的抗人食管癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105 (即，抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105)现已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路 I号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏日期2011年9月27日，保藏号为 CGMCC No. 5269。
本发明还提供所述多肽免疫检测试剂盒的制备方法，该方法包括如下步骤将纯化后的单克隆抗体与固相载体悬浮液混合，使得终浓度为O. 15 μ g/μ L-1. 5 μ g/μ L，在 4°C旋转孵育15分钟-2小时，放置l_5min，沉淀，移出上清液，用100-200 μ L PBS缓冲液 (O. Olmol/1、ρΗ7. 4)清洗所述固相载体2_5次，即得所述检测试剂盒。
本发明还提供一种食管癌免疫质谱检测方法，该方法包括如下步骤利用上述检测试剂盒从血清样品中分离多肽标志物抗原，用高通量的MALD1-T0F-MS检测洗脱液中的所述多肽标志物抗原，由此建立完整的多肽免疫质谱检测方法。
为了将所述检测试剂盒中的与所述单克隆抗体原发生特异性结合的血清样品中的多肽标志物抗分离出来，使用洗脱液从所述固相载体上分离出所述多肽标志物抗原。
具体地，所述食管癌免疫质谱检测方法包括如下步骤
I)结合单克隆抗体与琼脂糖颗粒以共价键相互结合；
2)孵育将样品与结合了抗体的琼脂糖颗粒进行孵育；
3)清洗经过孵育，使得待分析物结合到抗体上，并清洗琼脂糖，洗掉未与抗体结合的杂质；
4)洗脱用洗脱液将待分析物洗脱下来；
5)检测用MALD1-TOF MS检测，并对数据进行分析。
优选地，所述食管癌免疫质谱检测方法包括如下步骤
I)取15-25 μ I固相载体，置于Eppendorf管中，加入1. 56 μ g-31.1yg单克隆抗体，4°C旋转混合15分钟-2小时，放置l_5min，移出上清液，用O. 01M、pH7. 4PBS缓冲液 100-200 μ L清洗所得固相载体沉淀2-5次；
2)取O. 48 μ g-24 μ g多肽标准品、10-50 μ L PBS，与步骤I)清洗后的所述固相载体混合，4°C旋转混合8-12h ；
3)放置l_5min，移出上清液，用100-200 μ L PBS清洗沉淀2_5次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净Eppendorf管中；以避免抗原非特异附着在管壁，降低检测本底值；
4)加入5-10 μ L洗脱液，吸排混合l_5min ；
5)离心，取上清液，用MALD1-T0F-MS检测，得到多肽标准品质谱；
6 )用40_60 μ I血清样品替代步骤2 )的多妝标准品，重复步骤2 ) _5 ),用MALD1-TOF-MS检测，测定血清样品中的多肽标志物抗原。
其中，步骤5)中采用的检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为201^，队激光器，激光波长337nm,能量2000,离子延迟提取时间(Pulse ion extraction, PIE) 390ns, 质谱信号单次扫描累加2000次,使用peptide II standard kit (Bruker)离子峰校正(m/ z 700-m/z3500)，质量扫描范围 500_5000Da。
本发明的食管癌免疫质谱检测方法操作简单，主要包括抗体固相化、多肽抗原孵育结合和质谱检测三个方面，即将包被蛋白G或蛋白A的琼脂糖颗粒与本发明的单克隆抗体混合孵育，抗体与蛋白G或蛋白A亲和结合后固相化，清洗，加入多肽抗原孵育，抗原与抗体特异性结合，清洗，洗脱液分离抗原，MALD1-T0F-MS检测。
本发明中涉及的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的结合特异性强；采用免疫与质谱技术连用，能实现食管癌高通量、高灵敏度、高精确度的检测。此外，本发明方法属于分子水平诊断技术，与肿瘤影像学相比操作简单、成本低。
通过将血清多肽肿瘤早期诊断试剂盒与质谱技术联合使用，可以同时检测多个生物标志群,是验证血清标志物和应用于临床检测的理想工具。
图1为本发明实施例2-4中多肽免疫质谱检测方法的流程图。
图2为本发明实施例2-4中合成肽5标准品的质谱图。
图3本发明实施例4中食管癌确诊血清样本的质谱图。
图4本发明实施例4中检测食管癌血清样本与正常血清的ROC曲线图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1多肽标志物抗原单克隆抗体的制备方法
I)采用偶联载体蛋白KLH的合成的多肽5作为免疫原免疫BALB/C小鼠；其中，多妝 5 的全长序列为Asn-Leu_Gly-His-Gly-His-Lys-His-Glu-Arg-Asp-Gln-Gly-His-Gly-His-Gln。
2)2周后检测尾血滴度，达到1:1000以上后，取BALB/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG作用下进行融合。
3)通过ELISA方法进行筛�。糜邢尴∈头ǘ苑置诳固逖粜缘脑咏涣鱿赴锌寺〈炕�。
4)筛选出10株针对合成肽5的杂交瘤细胞，其中一株敏感性较高(Ing/孔)，扩增细胞系，制备并纯化单抗腹水，检测单抗的效价(I 200000)、滴度(O. 0005 μ g/ml)及亚型鉴定(IgG2b)等，得到抗多肽5的特异性单克隆抗体。将该杂交瘤细胞株命名为抗人原发性肝癌多肽标志物单克隆抗体杂交瘤细胞株AP0105，并于2011年9月27日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏号为CGMCC No. 5269。
实施例2食管癌免疫质谱检测方法
技术领域：
本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为
I)取 25 μ L 包被蛋白 G 的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, SantaCruz),置于O.6mL Eppendorf管中，加入7. 78 μ g AP0105，4°C旋转(转速5r/min)，混合I小时，放置 3min,移出上清液,用 100 μ L PBS 缓冲液(O. 01mol/l、ρΗ7· 4)清洗 Protein G Agarose 3 次；
2)取24μ g合成肽5的多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50yL PBS,与步骤I)清洗后的Protein G Agarose混合,4°C旋转混合8h ;
3)放置 3min,移出上清液,用 200 μ L PBS 清洗 Protein G Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净的Eppendorf管中；
4)加入5 μ L含有0. 1%(v/v) TFA的70%(v/v) CAN溶液的洗脱液，吸排混合5min ；
5)离心，取上清液，用MALD1-T0F-MS检测，检测图谱如图2所示，多肽标准品峰明显，与理论偏差小于0.1Da0
其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长 337nm,能量2000,离子延迟提取时间(Pulse ionextraction, PIE) 390ns,质谱信号单次扫描累加 2000 次,使用 peptide II standard kit(Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z 3500)， 质量扫描范围50(T5000Da。
结果表明，经本发明的方法检测合成肽5标准品，得到的MALD1-TOF MS质谱图具有分辨率高、特异性强的特点。
实施例3食管癌免疫质谱检测方法
技术领域：
本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为
I)取 15 μ L 包被蛋白 A 的琼脂糖颗粒(Protein A Agarose, SantaCruz),置于 0.2mL Eppendorf 管中，加入1. 56 μ g APO105,4°C旋转(转速 5r/min),混合 15 分钟，放置 2min,移出上清液,用 100 μ L PBS 缓冲液(0. 01mol/l、ρΗ7· 4)清洗 Protein A Agarose 3 次；
2)取24 μ g合成肽5多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50yL PBS,与步骤I)清洗后的Protein A Agarose混合,4°C旋转混合8h ;
3)放置 2min,移出上清液,用 200 μ L PBS 清洗 Protein A Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净的Eppendorf管中；
4)加入5 μ L 5%乙酸洗脱液,吸排混合3min ；
5)离心，取上清液，用MALD1-T0F-MS检测，检测图谱如图2所示，从谱图中可以看出多肽标准品峰明显，与理论偏差小于0.1Da0
其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长 337nm,能量2000,离子延迟提取时间(Pulse ionextraction, PIE) 390ns,质谱信号单次扫描累加 2000 次,使用 peptide II standard kit(Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z 3500)， 质量扫描范围50(T5000Da。
实施例4食管癌免疫质谱检测方法
技术领域：
本发明的多肽免疫质谱检测方法的流程如图1所示。具体为
I)取 20 μ L 包被蛋白 G 的琼脂糖颗粒(Protein G Agarose, SantaCruz),置于0.2mL Eppendorf管中，加入7. 78 μ g AP0105，4°C旋转(转速5r/min)，混合I小时，放置 3min,移出上清液,用 100 μ L PBS 缓冲液(0. 01mol/l、ρΗ7· 4)清洗 Protein G Agarose 3次；
2)取24 μ g合成肽5多肽标准品(固相化学合成，北京中科亚光生物科技有限公司)、50μ L PBS,与清洗后的Protein G Agarose混合，4°C旋转混合8h ；
3)放置 3min,移出上清液,用 200 μ L PBS 清洗 Protein G Agarose 3 次；最后一次清洗时将其悬浮液移至另一干净的Eppendorf管中；
4)加入5 μ L pH 2. 7的O. lmol/1甘氨酸-HCl溶液,吸排混合3min ；
5)离心，取上清液，用MALD1-T0F-MS检测，图2中的谱图结果显示，多肽标志物峰值与理论偏差小于O. 2Da。谱图中杂峰较少，显示出目标峰有较高特异性。
6)另取50 μ L临床确诊的食管癌血清72份，正常血清120份，按上述同法平行操作，用MALD1-TOF-MS检测。食管癌血清的谱图如图3所示，可以看出，图3所示的谱图与标准品图2的谱图相同，显示出目标峰有较高特异性。
结果经统计，如图4的ROC曲线显示，敏感度达到75. 0%，特异度达到95. 1%。
其中，检测条件为正离子检测模式，离子源加速电压为20kV，N2激光器，激光波长 337nm,能量2000,离子延迟提取时间(Pulse ionextraction, PIE) 390ns,质谱信号单次扫描累加 2000 次,使用 peptide II standard kit(Bruker)离子峰校正(m/z 700-m/z 3500)， 质量扫描范围50(T5000Da。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种食管癌免疫质谱检测试剂盒，其特征在于，其含有保藏号为CGMCC No. 5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体，所述单克隆抗体固定于所述固相载体上。
2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述单克隆抗体通过共价连接方式固定于所述固相载体上。
3.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述固相载体为包被蛋白G或蛋白 A的琼脂糖颗粒。
4.根据权利要求1-3任一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中还含有洗脱液。
5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述洗脱液任选pH值2.7的 O. lmol/1甘氨酸-HCl溶液、5%乙酸或含O. 1%TFA的50_70%ACN溶液中的一种。
6.权利要求1-3任一项所述检测试剂盒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤将纯化后的单克隆抗体与固相载体悬浮液混合，使得终浓度为O. 15 yg/μ L-1. 5 yg/ μ L，在4 °C旋转孵育15分钟-2小时，放置l-5min，沉淀，移出上清液，用pH值7. 4的 O. Olmol/1 PBS缓冲液100-200 μ L清洗所述固相载体2_5次，即得所述检测试剂盒。
全文摘要
本发明提供了一种食管癌免疫质谱检测试剂盒，所述检测试剂盒含有保藏号为CGMCC No.5269的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体和固相载体，所述单克隆抗体固定于所述固相载体上。本发明所涉及的单克隆抗体针对多肽标志物抗原的结合特异性强；采用免疫与质谱技术连用，能实现食管癌高通量、高灵敏度、高精确度的检测。此外，本发明属于分子水平诊断技术，与肿瘤影像学相比操作简单、成本低。
文档编号G01N33/577GK102998450SQ20121047943
公开日2013年3月27日 申请日期2012年11月22日 优先权日2012年11月22日
发明者魏开华, 肖汉族, 孙云波, 傅海媛, 侯利平, 黄亚娟, 宋纯艳, 杨保安, 甄蓓, 徐淑芳, 张拓, 王东茂, 周晓明, 原剑 申请人:北京正旦国际科技有限责任公司, 湖南金健药业有限责任公司
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