专利名称：肌酸激酶生物传感器及其试剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物传感器技术领域，是一种电流型生物传感器快速检测总肌酸激酶试条和所用试剂的制造方法，这种试条可以快速检测总肌酸激酶的浓度。
背景技术：
肌酸激酶(Creatine Kinase)存在于全身的肌肉组织和大脑组织的细胞浆和线粒体中，使一个与细胞内能量代谢、肌肉收缩、ATP的再生有直接关系的重要激酶。可逆地催化以下反应
注CK肌酸激酶，Creatinephosphate磷酸肌酸，ADP腺苷二磷酸，Creatine肌酸，ATP三磷酸腺苷，Mg肌酸激酶反应活性必需的镁离子。
肌酸激酶活性的测定是临床诊断肌肉疾病、神经疾病、脑病和心脏疾病的常规检查的基本项目之一。心血管疾�。绕涫切募」Ｈ切脑嘌芗膊≈兄饕劳鲈�。病人发病急、死亡危险性高，肌酸激酶在心肌梗塞后几个小时内增高，因此快速诊断病人的肌酸激酶是十分必要的。此外，前列腺癌、肺癌、神经真性瘤患者的肌酸激酶水平高于正常人。而糖尿病人的高血糖抑制肌肉组织中激酶活性的表达，肌酸激酶活性降低是糖尿病发展的结果或糖尿病病情进一步发展的原因。并且激酸肌酶检测是运动员体育训练强度的重要指标之一。正常情况下，肌细胞膜结构完整、功能正常，肌酸激酶(CK)极少透出细胞膜。训练及训练造成的微损伤会使血清中肌酸激酶活性增加。血清肌酸激酶是评定肌肉承受刺激和骨骼肌微细损伤及其适应与恢复的重要敏感指标。
目前，常用的测定血清肌酸激酶的方法是酶耦联试剂盒法、干式生化分析法和免疫分析法，这几种方法都需要昂贵的配套检测仪器。仪器本身无随时待命供急诊需要的设计功能。检测仪器由于采用光学比色法原理等，容易受到血清中其他物质的干扰，检测有误差，且不能检测全血。
发明内容
本发明的目的是针对心肌梗塞急诊病人和运动员外出训练检测等应用，提供一种快速、准确、方便，并可以与便携式小型仪表配套的可用于全血检测的便携式生物传感器肌酸激酶试条。
为达到上述目的，本发明的技术解决方案是提供一种肌酸激酶生物传感器，包括如下结构在绝缘性基板上表面有一对平行电极及电极引线；两电极分别为工作电极和对电极，两电极上方覆有绝缘层；绝缘层横向有一槽沟；槽沟上方覆盖有封装层；绝缘性基板、槽沟与封装层围成的空间组成毛细作用沟道，毛细作用沟道两端为毛细进样口，该毛细作用沟道为电极反应区，其在毛细作用沟道的两电极表面有一纳米材料层，纳米材料层上表面固定有反应试剂层；纳米材料层，为铂黑粒子或高分子纳米材料中的一种；以获取高活性的电极表面和高比表面积的纳米材料层。
所述的肌酸激酶生物传感器，其所述反应试剂包括电子接受体、耦联反应组合试剂、缓冲液、酶激活剂、酶还原剂、抗凝剂和表面活性剂。
所述的肌酸激酶生物传感器，其所述高分子纳米材料为高分子羧甲基纤维素钠，其中高分子羧甲基纤维素含量为0.1~1％。
所述的肌酸激酶生物传感器，其所述耦联反应组合试剂，与被分析物起反应，能产生与被分析物总肌酸激酶的浓度相对应的电流；电子接受体为铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾组成的组中的任一种；缓冲液为磷酸缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液组成的组中的任一种；
酶激活剂为醋酸镁或氯化镁；酶还原剂为N-乙酰半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或含巯基物质的一种；抗凝剂为肝素、草酸盐、柠檬酸盐和EDTA中的任一种；表面活性剂为TritonX-100、二乙醇酰胺、烷基醇酰胺磷酯盐、醇醚羧酸盐、单烷基磷酸酯、十二烷基磺酸钠或烷基酚聚氧乙烯醚中的任一种。
所述的肌酸激酶生物传感器，其所述耦联反应组合试剂包括磷酸肌酸、葡萄糖、单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、辅酶II(NADP)或辅酶II(NAD)、己糖激酶或葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、心肌黄酶这几种试剂的全部或部分。
所述的肌酸激酶生物传感器，其电子接受体的浓度范围10mM~100mM、缓冲液浓度范围10~100mM、酶激活剂浓度范围0.1~10mM、酶还原剂浓度范围5~20mM、抗凝剂浓度范围0.5~5mM、表面活性剂浓度范围0.1～0.5％。
一种肌酸激酶生物传感器所用试剂的制备方法，包括下列步骤a)首先将磷酸肌酸、葡萄糖混合制备成溶液R1；b)将单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、辅酶II(NADP)或辅酶II(NAD)、己糖激酶或葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和心肌黄酶这几种试剂的全部或部分、缓冲液、酶激活剂、酶还原剂、抗凝剂和表面活性剂混合制备成溶液R2；c)对电极表面活化处理后，将溶液R1、R2和电子接受体溶液混合均匀，然后均匀的滴加在电极纳米材料层上；d)对c)步所得半成品进行干燥后，用绝缘材料覆盖成封装层；e)用切条机将试条阵列切成单个试条，然后真空封装，备用。
所述的试剂制备方法，其所述c)步中对电极表面活化处理，是用等离子体法快速活化电极表面。
所述的试剂制备方法，其所述d)步，是把c)步所得半成品放在温度为35～37℃的干燥箱中干燥20～25分钟后，用绝缘材料覆盖封装层。
所述的肌酸激酶生物传感器，其检测系统采用电流法检测。
本发明产品与目前国内外产品比较具有许多优势。本发明的试条和介绍的方法与已经商业化的系列的便携式电流型仪表是兼容的，因此可以随身携带、检测简单快捷；由于一次性试条的生产工艺采用先进的微机电系统(MEMS)工艺，既保证了检测的可靠性和一致性，又降低了试条的生产成本；采用简单有效的酶的固定方法，采用了电化学电流检测的原理，较之比色法原理精确，使得试条的生产更为简便；试条采用毛细设计，使进样更快，需血量更少(3μl)，而且系统的响应快，灵敏度高。
图1是本发明设计的两电极系统的分层示意图；图2本发明的电极平面图。
图3本发明实施例的不同浓度高分子羧甲基纤维素(CMC)的循环伏安比较图。
图4本发明实施例的肌酸激酶实时响应图。
图5本发明实施例的肌酸激酶线性关系图。
具体实施例方式本发明的传感器试条电极的制备方法参照已申请专利00410030214.X和200410031948.X。
用等离子体法快速活化电极表面的技术参照已申请专利02154524.3。
本发明提供了一种在电极表面反应区内组装一层高分子纳米颗粒的方法。通过在电极表面均匀滴加不同浓度的亲水性大分子羧甲基纤维素钠，于37℃温度条件下干燥后，获得具有不同孔径的电极纳米层。该方法进一步加强了电极表面的亲水性，增大了电极的有效表面积。不仅有利于酶试剂的固定化，而且增加了电极的电化学活性。
本发明提供了在纳米颗粒上固定反应试剂的方法。
本发明将反应试剂固定在电极上形成试剂层，固定在高分子纳米层上的反应试剂包括电子接受体，与被分析物起反应且能产生与被分析物浓度相对应的电流的耦联反应的组合试剂，同时还包括缓冲液、酶激活剂、还原剂、抗凝剂和表面活性剂。
本发明试剂组合所依据的反应原理如下
其中Creatine phosphate磷酸肌酸；Creatine肌酸；CK肌酸激酶；Glucose葡萄糖；Glucose-6-phosphate 6-磷酸-葡萄糖；Gluconolactone-6-phosphate 6-磷酸葡糖内酯；HK己糖激酶；GPD磷酸葡萄糖脱氢酶；NADPH NADP+(辅酶II)还原型/氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸；DIA心肌黄酶；Fe(CN)64-/Fe(CN)64-还原型/氧化型铁氰化钾首先将适当浓度的磷酸肌酸、葡萄糖混合制备成溶液R1，将适当浓度的单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、辅酶II(NADP)、己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、心肌黄酶、醋酸镁、还原型谷胱甘肽、EDTA、TritonX-100混合制备成溶液R2，在电极表面活化处理好后，再将溶液R1、R2和铁氰酸钾溶液混合均匀，然后用点样仪均匀滴加在电极高分子纳米层上。在35～37℃干燥箱中干燥20～25分钟后，用绝缘材料覆盖封装，用切条机将试条阵列切成单个试条。然后真空封装。备用。
试剂中磷酸肌酸的适用浓度范围10~1000mM，其优化反应范围50mM~100mM。葡萄糖的适用浓度范围10~1000mM，其优化反应范围50mM~100mM。单磷酸腺苷的适用浓度范围1~100mM，其优化反应范围5mM~20mM。二磷酸腺苷的适用浓度范围0.5~100mM，其优化反应范围1mM~20mM。辅酶II的适用浓度范围0.5~100mM，其优化反应范围1mM~20mM。己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、心肌黄酶适用浓度范围1~2000U/ml，其优化反应范围1~40U/ml。
起氧化还原作用的电子接受体由从铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾组成的组中选择出的一种；通过电子介体将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面，使得电流型酶传感器的响应速度和检测灵敏度得到了提高，同时降低了反应的电压。所述电子接受体为铁氰酸钾，使工作电位降至0.2V，减少血液中其它活性物质的干扰。铁氰酸钾的适用浓度范围0.1mM~300mM，其优化反应范围10mM~100mM。
缓冲液为磷酸缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液组成的组中选择出的一种；所述缓冲液为磷酸缓冲液。缓冲液用于提供一个酸碱度pH值稳定的反应环境，反应的最佳酸碱度pH为6～8，浓度范围10~100mM。
肌酸激酶反应中，镁离子是必须的，酶激活剂为醋酸镁或氯化镁。选用醋酸镁，其适用浓度范围1~100mM，最佳浓度范围5~20mM。
由于血清中大多数肌酸激酶是以非活性形式存在的，为了精确定量测定其活性，必须将其激活，常用的酶还原剂为N-乙酰半胱氨酸、还原型谷胱甘肽等含巯基物质的一种；所述酶还原剂为还原性谷胱甘肽。由于巯基化合物在溶液中稳定性差，因此，还原性谷胱甘肽需用新鲜配制的溶液。其适用浓度范围0.1~10mM，最佳浓度范围0.1~5mM。
由于全血检测过程中，血液很容易凝固，一般血液在2~5分钟开始凝固，因此，为了反应顺利进行，需在试剂中添加抗凝剂。抗凝剂为从肝素、草酸盐、柠檬酸盐和EDTA中选择出的一种；所述抗凝剂为EDTA。其适用浓度范围0.1~10mM，最佳浓度范围0.5~5mM。
所述表面活性剂为TritonX-100。添加0.05～1％非离子型的表面活性剂。优选0.1～0.5％浓度表面活性剂。
本发明的上述各种目的、方法、特点和优点，通过下面结合附图和实施例可以得到更加详细的说明。
实施例1图1、图2是本发明设计的两电极图。首先，采用微机电系统(MEMS)工艺在绝缘性基材1上制备好薄膜金电极2、3，在薄膜金电极2、3上粘加第二绝缘层4，第二绝缘层4中设有毛细作用沟道7，毛细作用沟道7形成反应区。(5是封装层，6是电极引线、10是毛细进样口)。然后，电极2、3经离子清洗机活化后，在电极2、3反应区即毛细作用沟道7中组装一层高分子羧甲基纤维素(CMC)纳米颗粒层8，在37℃电热鼓风干燥箱内干燥20分钟，取出备用。
然后添加试剂，试剂为磷酸肌酸100mM；葡萄糖50mM；醋酸镁20mM；单磷酸腺苷(AMP)20mM；腺苷二磷酸(ADP)5mM；烟碱腺苷二核酸磷酸(NADP)5mM；葡萄糖6-磷酸脱氢酶4U/ml；己糖激酶4U/ml；心肌黄酶2U/ml；谷胱甘肽3mM；EDTA1mM；TritonX-1000.2％；铁氰酸钾25mM；磷酸缓冲液0.01M。
将5μl上述试剂溶液滴加在毛细作用沟道7中，覆有一层高分子羧甲基纤维素(CMC)的纳米颗粒层8上，在37℃的干燥箱中干燥20分钟，形成试剂层9。从干燥箱中取出试条，加盖透明绝缘封装层5，形成毛细作用沟道7，及两端的毛细进样口10。用切条机将试条阵列切成单个试条。然后真空封装。
实施例2在制备好的电极2、3上，用离子水清洗后，滴加0.5％和1％的高分子羧甲基纤维素(CMC)，在37℃电热鼓风干燥箱内干燥20分钟。取出后，检测其伏安特性曲线。图3中，为电极2、3上，组装不同浓度的高分子羧甲基纤维素(CMC)(1)0％；(2)0.5％；(3)1％的循环伏安图。扫描速率100mV/s，溶液基相0.01M磷酸缓冲液(pH7.4)，0.03MK3Fe(CN)6。由图3可见，随着高分子羧甲基纤维素(CMC)浓度增加，其电流增大，但随高分子羧甲基纤维素(CMC)浓度增大，高分子纳米膜增厚，电子传递速率降低，影响反应速度；背景反应电流增大。因此需要选择合适的浓度。一般选择0.1~1％，根据具体情况来确定。在组装高分子纳米膜的电极2、3表面，表面积明显增大，加入液状反应试剂后，纳米材料层8与试剂形成溶胶层，因此产生更大的反应电流，增大反应灵敏度。
实施例3在试条的工作电极和参比电极之间施加+0.2V的电压。在修饰了高分子材料羧甲基纤维素钠(CMC)纳米层8的电极2、3上，滴加混合试剂，待反应电流(背景电流)平稳后，加入不同活性的肌酸激酶缓冲液，与试剂和高分子纳米层8发生作用，产生电流，经电极引线6流出，在电化学生物传感器检测系统上可以快速检测出与总肌酸激酶的活性相对应的电流。产生的电流与激酸肌酶活性成正比。并且在很宽的范围内呈现很好的线性相关性。因此，该传感器试条具有良好的应用价值。见图4a，为生物传感器对不同浓度肌酸激酶实时响应曲线。肌酸激酶活性(1)800U/ml；(2)400U/ml；(3)80U/ml；(4)8U/ml；(5)800U/L；(6)400U/L；(7)80U/L；(8)40U/L；(9)8U/L。图4b是图4a虚线部分放大图。图5为肌酸激酶线性关系图。图5a为肌酸激酶高活性范围，反应时间140秒；图5b为肌酸激酶底活性范围，反应时间280秒。
本发明用了优选实施例进行说明，优选实施例只是为了说明的目的，而不是对本发明的限制。在上述说明的基础上可以对本发明作许多改进和改变。因此，在所附权利要求书的范围内，本发明可以有不是上述的其它实现方式。例如其它组合的试剂配方、在试剂层上覆盖过滤膜从而消除红细胞的干扰而用于全血肌酸激酶的检测、可采用光学检测法、可采用其它纳米颗�：头悄擅撞牧闲奘蔚牡缂从η�、三电极形式、厚膜电极的制备形式等。
权利要求
1.一种肌酸激酶生物传感器，包括如下结构在绝缘性基板上表面有一对平行电极及电极引线；两电极分别为工作电极和对电极，两电极上方覆有绝缘层；绝缘层横向有一槽沟；槽沟上方覆盖有封装层；绝缘性基板、槽沟与封装层围成的空间组成毛细作用沟道，毛细作用沟道两端为毛细进样口，该毛细作用沟道为电极反应区，其特征在于在毛细作用沟道的两电极表面有一纳米材料层，纳米材料层上表面固定有反应试剂层；纳米材料层，为铂黑粒子或高分子纳米材料中的一种；以获取高活性的电极表面和高比表面积的纳米材料层。
2.如权利要求1所述的肌酸激酶生物传感器，其特征在于所述反应试剂包括电子接受体、耦联反应组合试剂、缓冲液、酶激活剂、酶还原剂、抗凝剂和表面活性剂。
3.如权利要求1所述的肌酸激酶生物传感器，其特征在于所述高分子纳米材料为高分子羧甲基纤维素钠，其中高分子羧甲基纤维素含量为0.1~1％。
4.如权利要求2所述的肌酸激酶生物传感器，其特征在于所述耦联反应组合试剂，与被分析物起反应，能产生与被分析物总肌酸激酶的浓度相对应的电流；电子接受体为铁氰酸盐、亚甲基蓝、二茂铁及其衍生物、对笨醌、吩嗪硫酸甲酯、靛酚及其衍生物和β-萘醌-4-磺酸钾组成的组中的任一种；缓冲液为磷酸缓冲液、TRIS缓冲液、MES缓冲液组成的组中的任一种；酶激活剂为醋酸镁或氯化镁；酶还原剂为N-乙酰半胱氨酸、还原型谷胱甘肽或含巯基物质的一种；抗凝剂为肝素、草酸盐、柠檬酸盐和EDTA中的任一种；表面活性剂为TritonX-100、二乙醇酰胺、烷基醇酰胺磷酯盐、醇醚羧酸盐、单烷基磷酸酯、十二烷基磺酸钠或烷基酚聚氧乙烯醚中的任一种。
5.如权利要求4所述的肌酸激酶生物传感器，其特征在于所述耦联反应组合试剂包括磷酸肌酸、葡萄糖、单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、辅酶II(NADP)或辅酶II(NAD)、己糖激酶或葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、心肌黄酶这几种试剂的全部或部分。
6.如权利要求4所述的肌酸激酶生物传感器，其特征在于所述电子接受体的浓度范围10mM~100mM、缓冲液浓度范围10~100mM、酶激活剂浓度范围0.1~10mM、酶还原剂浓度范围5~20mM、抗凝剂浓度范围0.5~5mM、表面活性剂浓度范围0.1～0.5％。
7.如权利要求5所述的肌酸激酶生物传感器，其特征在于所述耦联反应组合试剂中，磷酸肌酸的浓度范围为10~1000mM；葡萄糖的浓度范围为10~1000mM；单磷酸腺苷的浓度范围为1~100mM；二磷酸腺苷的浓度范围为0.5~100mM；辅酶II的浓度范围为0.5~100mM；己糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、心肌黄酶的浓度范围为1~2000U/ml。
8.一种肌酸激酶生物传感器所用试剂的制备方法，其特征在于包括下列步骤a)首先将磷酸肌酸、葡萄糖混合制备成溶液R1；b)将单磷酸腺苷(AMP)、二磷酸腺苷(ADP)、辅酶II(NADP)或辅酶II(NAD)、己糖激酶或葡糖激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和心肌黄酶这几种试剂的全部或部分、缓冲液、酶激活剂、酶还原剂、抗凝剂和表面活性剂混合制备成溶液R2；c)对电极表面活化处理后，将溶液R1、R2和电子接受体溶液混合均匀，然后均匀的滴加在电极纳米材料层上；d)对c)步所得半成品进行干燥后，用绝缘材料覆盖成封装层；e)用切条机将试条阵列切成单个试条，然后真空封装，备用。
9.如权利要求7所述的试剂制备方法，其特征在于所述c)步中对电极表面活化处理，是用等离子体法快速活化电极表面。
10.如权利要求7所述的试剂制备方法，其特征在于所述d)步，是把c)步所得半成品放在温度为35～37℃的干燥箱中干燥20～25分钟后，用绝缘材料覆盖封装层。
11.如权利要求1所述的肌酸激酶生物传感器，其特征在于检测系统采用电流法检测。
全文摘要
本发明肌酸激酶生物传感器及其试剂的制备方法，涉及生物传感器技术领域，可以快速检测总肌酸激酶的浓度。本发明肌酸激酶生物传感器，在毛细作用沟道的两电极表面有一纳米材料层，纳米材料层上表面固定有反应试剂；纳米材料层，为铂黑粒子或高分子纳米材料中的一种；以获取高活性的电极表面和高比表面积的纳米材料层。其试剂的制备方法，是先配置两种溶液，再与电子接受体溶液混合而成。当被分析物——含有肌酸激酶的样品——通过毛细作用滴加到试条反应区上后，用电化学生物传感器检测系统可以快速检测出总肌酸激酶的浓度。
文档编号G01N33/50GK1737158SQ20041005851
公开日2006年2月22日 申请日期2004年8月16日 优先权日2004年8月16日
发明者刘春秀, 蔡新霞, 姜利英, 罗贤波, 李华清 申请人:中国科学院电子学研究所
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