专利名称：人类身高基因位点检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及分子生物学和医学领域，具体涉及检测人类身高基因位点是否发生突变的试剂盒，通过同时检测与身高密切相关的高迁移率族蛋白A2 (HMGA2)和锌指转录激活因子(ZBTB38)的单核苷酸多态性位点基因型来评估个体身高变化。
背景技术：
人们早就知道，基因遗传是决定身高的主要因素。父母如果个子高，孩子很可能个儿也高。基因和环境因素(如营养和锻炼)都对人的肥胖程度有重要影响，但身高却有大约90%是取决于基因。尽管身高与基因之间显然存在联系，科学家却一直未能发现人类共有的“身高”基因，知道现在才在一小群人身上找到基因影响身高的惟一证据。根据发表在《自然遗传学》杂志上的ー篇论文，英国和美国研究人员分析了具有欧洲血统、主要生活在英国、瑞典和芬兰的近5000名白人的DNA。通过全面的分析他们发现了一种名为HMGA2的基因。HMGA2的基因编码中，仅仅ー个“字母”的变化——从T (胸腺嘧啶)变成C (胞嘧啶)——就会使从双亲身上都遗传到这种改变的人身高高出近I厘米。仅从父母中的一方遗传到“C”的人则比获得两个“T”的人高出约半厘米。在对另外的近3万人作进ー步研究之后，研究小组认为约1/4的欧洲白人从父母那里获得的都是“C”。另有1/4的人从父母那里获得的都是“T”，这就使他们比前者矮大约I厘米。研究人员说，其他许多基因还有待发现，因为人类身高差异中仅有0. 3%能归因于HMGA2基因。位于英国西南�？巳氐陌氲阂窖г旱牡倌� 弗雷林是此项研究的负责人，他说“身高是典型的‘多基因遗传’特征，也就是说影响我们身高的是多个基因。”他说“显然，我们的研究结果不能解释为何有人身高I米92，而有人身高仅为I米45。人类将发现许多这样的基因，可能多至数百个，这只是其中的第一个。”另ー项后续工作是解释为何HMGA2有这样的影响。研究人员相信它通过调节细胞生长而影响人的身高。对“身高基因”的兴趣不仅仅是处于好奇，它可能有助于增进人们对疾病的了解。根据统计数据，个子高的人患某些癌症(例如前列腺癌、膀胱癌和肺癌)的风险更大，这意味着调节细胞繁殖的基因很可能也在某种程度上促使癌细胞激増。统计数据还表明个子矮和心脏病之间存在某种联系。哈佛大学医学院基因学教授乔尔 赫希霍恩说“这是首个令人信服的研究結果，它解释了 DNA如何对人类身高的正常差异产生影响。”上述所提到的HMGA2基因是已经证实的影响人类身高的基因，HMGA2是高迁移率蛋白(HMG)家族成员。高迁移率族(high mobility group, HMG)蛋白由HMGI/Y、HMGl/HMG2和HMG14/HMG17这3个超家族组成，为便于检索和研究，2000年有被重新命名为HMGA(HMGI/Y)、HMGB (HMG1/HMG2)和 HMGN (HMG14/HMG17)。其中，高迁移率族蛋白 A (highmobility group A, HMGA)家族包括HMGAlb和HMGA2，其共同特征是可以通过结构中包含的AT-books结合域与B型DNA中富含AT的区域进行结合，继而改变染色质的结构，调节相关基因的表达，从而影响胚胎形成、组织发育和肿瘤发生等过程。人类HMGA2基因位于人类12号染色体的ql5区，由5个外显子和4个内含子組成，其中外显子1-3编码3个DNA结合区域，外显子4编码DNA结合区域和酸性羧基末端之间的间隔区，外显子5则编码酸性羧基末端。HMGA2蛋白是HMGA2基因的表达产物。HMGA2蛋白是ー种非组蛋白染色体蛋白，本身缺乏转录活性，但是它能通过与染色质的结构，或直接与相关蛋白发生作用，继而调节其他基因的转录，从而影响胚胎形成、组织发育和肿瘤发生等多个过程。 HMGA2蛋白在胚胎发育和细胞分化增值中发挥着重要作用。敲出HMGA2基因的小鼠表现为侏儒表型，而后科学家们又针对人类身体中的HMGA2基因分析得出结论，HMGA2基因的表达与人类的身高差异有夫。另一个影响人类身高的基因ZBTB38 (Zinc finger and BTB domain containing38)基因，即锌指和含BTB域38基因，该基因在鼠上被称为ZENON基因，在人上被称为ZBTB38基因。该基因能够促进和抑制H19/IGF2的甲基化区域的等位基因发生甲基化(Filion et al. 2006; Kiefer et al. 2005; Sasai et al. 2005)。Sasai (2005)克隆了人ZBTB38基因，并分析了它的分子特征，发现该基因由2个独立的区域(BTB区和附属区域)抑制转录。Kiefer (2005)发现ZBTB38基因与许多通过特异性结合甲基化DNA形式来抑制转录的编码蛋白显著相关。Filion (2006)鼠ZBTB38基因不依赖甲基化调节儿茶酚酞合成的限速酶——酪氨酸羧化酶基因的转录。人类基因组中共预测有数百个编码含BTB结构域蛋白的基因，BTB结构域是ー个进化保守的蛋白互作结构域，位于该家族蛋白的N末端区域,属C2H2型锌指转录因子(Zollman et al. 1994)。BTB结构域通过与锌指结构域(zincfinger domainノ、bZIP结丰勾: (basic region leucine zipper domainノ、KeIch(keIchrepeats)、MATH结构域或锚蛋白重复(ankyrin repeats)等结构域,通过协同作用行使转录调节、造血、染色质重塑、肿瘤发生、干细胞稳态、细胞骨架组织、蛋白降解以及发育等生物学功能(Aravind et al. 1999; Albagli et al. 1995; Costoya et al.2007)。人 ZBTB38基因与具有相似蛋白�？榻峁沟腪BTB17、ZBTB7、HIC-I等基因都与细胞分化、肿瘤发生有关(Filion et al. 2006; Maeda et al. 2005; Patel et al. 2006; Pinte et al. 2004)。Melnick(2000)通过研究把人ZBTB38基因的BTB结构域序列与人转录抑制子PLZF、HIC_1、BCL6、ZBTB17和ZBTB7进行比对，发现作为PLZF蛋白ニ聚体晶体结构关键成分的保守残基在ZBTB38和HIC-1、BCL6、ZBTB17、ZBTB7中也存在，并且都包含形成a螺旋的氨基酸簇，这些基因都属转录因子，被定位于细胞核。国外许多研究(Gudbjartsson et al. 2008; Lettre et al. 2008; Mateescu etal. 2005; Weedon et al. 2008)证实了 ZBTB38基因的多态位点对于影响人类体高和形态大小有明显的生物学作用。Gudbjartsson (2008)认为人ZBTB38基因通过调节IGF II的生成来影响成年人的形态大�。⑾至� ZBTB38基因的多态位点(rs6763931)的A等位基因突变与人类身高显著相关(P=l. 4X 10_27)，并且该位点所在序列在血液和脂肪组织中高度表达。Lettre (2008)在ZBTB38等基因上发现了几个与人类身高和形态大小有显著相关新多态位点，其中rs724016位点位于内含子上，与显著的影响人类身高(P=5. OX 10_12)。同吋，通过运用全基因组扫描方法，发现了 ZBTB38基因的多态位点(rs6440003)与成年人身高显著相关(rs6440003，P=L 8X1(T24)。Mateescu (2005)和 Weedon (2008)分别用全基因组扫描方法证实了 ZBTB38 基因的多态位点(rs6763931、rs724016、rs6440003、rsl0513137)与人类形态大小有显著关系。
发明内容本实用新型针对目的是提供ー种采用荧光定量PCR技术同时检测两个人类身高基因SNP位点的试剂盒。该试剂盒由包装盒体、衬垫、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管、装有阳性对照品的ー个试管、装有阴性对照品的ー个试管组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液、阳性对照品和阴性对照品。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用 上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。其中，高迁移率族蛋白A2 (HMGA)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- TCAATACTACCTCTGA -3’下游引物序列5’- GTAATAAGTACTAGAC -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - ATGTTACAAcGAATTT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- ATGTTACAAtGAATTT - TAMRA -3’锌指和含BTB域38 (ZBTB38)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GCTTAGAAGAGATGCT -3’下游引物序列5’- CATTTAAATAATTTTC -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - AACAATGCAaCTAAAGA - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - AACAATGCAgCTAAAGA -TAMRA -3’对照品分为阳性对照品和阴性对照品，阴性对照品为无菌双蒸水样品，阳性对照品为ロ腔粘膜细胞DNA样品。本试剂盒保存于_20°C，尽量减少反复冻融。本实用新型试剂盒使用方法毎次检测均应设立阳性对照和阴性对照。扩增检测在荧光定量PCR仪上进行，分为6个反应管，每ー个SNP位点检测使用3个反应管，其中I个反应管为被检测样品，阳性对照和阴性对照各使用I个反应管，每管中总体积10 iil，其中Siil PCR反应液，2 检测样品(基因组DNA、阳性对照或阴性对照)。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧光定量PCR仪上进行終点荧光读�。莸玫降磨宋馔己褪凳崩┰銮叨寥”患觳庋返腟NP位点基因型。本实用新型提供的该试剂盒主要用于检测人类身高基因SNP位点，从而告知被检者身高变化数值。[0037]本实用新型的特点是该试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个人类身高基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测ー个SNP位点，本实用新型试剂盒将同一疾病的所有SNP位点检测整合在ー个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体身高变化的评估也更便捷。
图I为本实用新型的结构示意图。
具体实施方式
本实用新型结合附图和具体实施例作进ー步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本实用新型范围。 实施例I參见图1，本实用新型试剂盒由包装盒体I、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔、分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。其中荧光定量PCR反应液的成分包含PCR缓冲液、MgCl2、dNTPs、SNP位点检测用上游引物、SNP位点检测用下游引物、SNP位点基因型ー荧光探针、SNP位点基因型ニ荧光探针、Taq DNA聚合酶。本试剂盒保存于-20°C，尽量减少反复冻融。实施例2I.材料血样总DNA提取试剂盒购于美国Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相关试剂购于美国Promega公司，7900型荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。2.引物及探针高迁移率族蛋白A2 (HMGA)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- TCAATACTACCTCTGA -3’下游引物序列5，-GTAATAAGTACTAGAC -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - ATGTTACAAcGAATTT - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC- ATGTTACAAtGAATTT - TAMRA -3’锌指和含BTB域38 (ZBTB38)上的SNP位点检测引物和探针为上游引物序列5’- GCTTAGAAGAGATGCT -3’下游引物序列5’- CATTTAAATAATTTTC -3’基因型ー荧光探针序列5’-FAM - AACAATGCAaCTAAAGA - TAMRA -3’基因型ニ荧光探针序列5’-VIC - AACAATGCAgCTAAAGA -TAMRA -3’3.样本检测选取30例血液样本，其中筛选18例身高较高的样本。样本用血样总DNA提取试剂盒提取总DNA。每一例检测为12个反应管，每管中总体积lOiil，其中8iU PCR反应液，姆ー个SNP位点检测使用3个反应管，I个反应管中加入2 u I被检测DNA,另外2个反应管中加入2 u I阳性对照和阴性对照，在ABI7900荧光定量PCR仪上进行扩增。反应条件为50°C、2分钟，95°C、10分钟，再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、I分钟。反应完成后在荧 光定量PCR仪上进行终点荧光读取。
权利要求1.一种人类身高基因位点检测试剂盒，其特征是由包装盒体(I)、衬垫(2)、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管(3)、装有阳性对照品的一个试管(4)、装有阴性对照品的一个试管(5)组成，衬垫(2)上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液(3 )、阳性对照品(4 )和阴性对照品(5 )。
专利摘要本实用新型提供了一种检测人类身高基因位点是否发生突变从而评估个体身高变化的试剂盒，由包装盒体1、衬垫2、装有检测两个SNP位点的荧光定量PCR反应液的两个试管3、装有阳性对照品的一个试管4、装有阴性对照品的一个试管5组成，衬垫上设有容器孔，分别放置两管荧光定量PCR反应液3、阳性对照品4和阴性对照品5。本实用新型试剂盒运用荧光定量PCR技术实现了同时检测两个人类身高基因SNP位点基因型的目的，相对于现有的荧光定量PCR试剂盒只检测一个SNP位点，本实用新型试剂盒将与同一疾病的两个SNP位点检测整合在一个试剂盒内，使用更方便而且成本更低，对个体身高变化的评估也更便捷。
文档编号G01N21/64GK202401071SQ201120569479
公开日2012年8月29日 申请日期2011年12月31日 优先权日2011年12月31日
发明者任峻, 张华忠 申请人:浙江爱易生物医学科技有限公司
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