专利名称：图像处理装置、培养观察装置及图像处理方法
技术领域：
本发明涉及当将已分化的体细胞初始化而建立人工多功能性干细胞(近似ES细胞的具有多分化及增殖能力的细胞，以下称为“iPS细胞”)时观察iPS细胞集落的育成状态的培养观察装置、适用于该培养观察装置的图像处理装置及图像处理方法。
背景技术：
目前，在建立来源于老鼠的iPS细胞时，为了将细胞有无初始化可视化，使用将荧光蛋白质基因(EGFP基因)插入看作是维持多功能性的基因的ECAT4(Nan0g)的转座基因而成的老鼠。该情况下，EGFP成为初始化标记，可通过有无发荧光来确认细胞是否被初始化(参照非专利文献1等)。非专利文献 1 :Keisuke Okita，Tomoko Ichisaka，and Shinya Yamanaka, “Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells”， Nature Vol 488，19July 2007，P313-317但是，在再生医疗的用途中建立来源于人的iPS细胞时，应该避幵标记基因的使用。
发明内容
因此，本发明的目的在于，提供一种不使用荧光蛋白质基因等标记基因就能够判别细胞有无初始化的图像处理装置、培养观察装置、及图像处理方法。本发明的图像处理装置具备抽取单元，从细胞集落的相位差显微镜图像中抽取表示该细胞集落的轮廓的明确度的特征量；自动判別单元，基于所述抽取单元抽取的特征量和预定的判別基准，自动判別所述细胞集落是否为iPS细胞集落。本发明的培养观察装置具备取得收纳于所述恒温室内的培养容器的相位差显微镜图像的摄像单元、对所述摄像单元取得的相位差显微镜图像进行处理的本发明的图像处理装置。本发明的图像处理方法包括如下步骤抽取步骤，从细胞集落的相位差显微镜图像中抽取表示该细胞集落的轮廓的明确度的特征量；自动判別步骤，基于按所述抽取步骤抽取的特征量和预定的判別基准，自动判別所述细胞集落是否为iPS细胞集落。本发明的图像处理装置具备抽取单元，从细胞集落的相位差显微镜图像中抽取表示该细胞集落的边缘变化度的特征量；自动判別单元，基于所述抽取单元抽取的特征量和预定的判別基准，自动判別所述细胞集落是否为iPS细胞集落。根据本发明，实现一种不使用荧光蛋白质基因等标记基因就能够判别细胞有无初始化的图像处理装置、培养观察装置、图像处理方法。
图1是恒温箱的正面图2是正面门18敞开时的恒温箱的正面图；图3是表示观察单元观的构成的概要图；图4是恒温箱11的电路方框图；图5是各次实验的控制单元14的动作流程图；图6是手动模式的控制单元14的动作流程图；图7是自动模式的控制单元14的动作流程图；图8是合成宏观图像I的例子；图9是二值化图像Γ的例子；图10是二值化集落图像I “的例子；图11是合成宏观图像I的局部放大图；图12是合成宏观图像I的局部放大图(所指定的细胞集落的框发生了变化的情形)；图13(A)是所指定的细胞集落的放大图，(B)是未指定的细胞集落的放大图；图14是轮廓线Lc的例子；图15是说明带状区域100AU00B的图；图16是说明特征量的图；图17是对学习抽样数据gi'、学习抽样数据gn'进行说明的图；图18是对学习抽样数据gi、学习抽样数据gn进行说明的图；图19是对更新后的学习抽样数据gi及更新后的学习抽样数据gn进行说明图；图20是说明步骤S83的图；符号说明11恒温箱12第一框体13第二框体56操作面板14控制单元28观察单元15恒温室16正面开口17搬出搬入口18正面门19自动门30培养容器20 开口47试样台51第一照明部52第二照明部53显微观察部54容器观察部
55图像处理部49主体部分61 物镜62相位滤波器
具体实施例方式[第一实施方式]下面，对本发明的第一实施方式进行说明。本实施方式为恒温箱的实施方式。首先，对本实施方式的恒温箱的构造进行说明。图1是本实施方式的恒温箱的正面图，图2是正面门18敞开时的恒温箱的正面图。如图1、图2所示，恒温箱11具有进行生物细胞培养的第一框体12、收纳控制单元14 的第二框体13，第一框体12配置于第二框体13的上部。在第二框体13的前面设有操作面板56，在该操作面板56上设有监视器及输入钮等。在第二框体13的内部配置有控制单元14、观察单元观的一部分。在第一框体12的内部形成有由隔热材料覆盖着的恒温室15(图2)。该恒温室15 通过形成于第一框体12的正面的正面开口 16(图2)和形成于第一框体12的左侧面的搬出搬入口 17(图2)与外部进行联络。其中，正面开口 16(图2)通过左右对开的正面门18 可开关，搬出搬入口 17(图2)通过滑动式的自动门19(图1)可开关。另外，搬出搬入口 17 的尺寸设定为培养容器30 (图2)可穿过的尺寸。另外，在第一框体12的底面且在从正面侧看时靠右的位置形成有开口 20 (图幻，从该开口 20 (图幻突出有观察单元观的一部分。在恒温室15的壁面上内装有温度调节装置、喷雾装置、气体导入部、环境传感单元等。其中，温度调节装置具有珀尔帖元件，通过珀尔帖效应，进行恒温室15(图幻的加热或冷却。喷雾装置在恒温室15(图幻内进行喷雾，调节恒温室15(图幻内的湿度。气体导入部与恒温箱外的二氧化碳瓶连接，通过从该二氧化碳瓶向恒温室15 (图幻导入二氧化碳，调节恒温室15(图幻内的二氧化碳浓度。环境传感单元分别检测恒温室15 (图2)内的温度、湿度、二氧化碳浓度。在第一框体12的内部配置有储料器25、容器搬出搬入机构沈(图幻、容器输送机构27，如上所述，也配置有观察单元28的一部分。从第一框体12的正面看时，储料器25的配置部位为恒温室15(图2)的左侧。储料器25具有多个搁板，在各个搁板上能够收纳培养容器30。储料器25的最下段与第一框体12的搬出搬入口 17(图幻连续，在其最下段的空间内设置有用于将培养容器30搬出搬入的容器搬出搬入机构沈(图2)。在从第一框体12的正面看时，容器输送机构27的配置部位为恒温室15 (图2)的中央。该容器输送机构27在储料器25、容器搬出搬入机构沈(图幻、观察单元观之间进行培养容器30(图幻的交接。在从第一框体12的正面看时，观察单元观的配置部位为恒温室15 (图2)的右侧。 该观察单元观具有试样台47 (图幻、向试样台47 (图幻的上方伸出的臂48 (图2)、主体部分49(图2)。其中，试样台47(图2)及臂48(图2)位于第一框体12的恒温室15 (图 2)侧，主体部分49(图2)位于第二框体13侧。
图3是表示观察单元28的构成的概要图。如图3所示，观察单元28具有试样台 47、第一照明部51、第二照明部52、显微观察部53、容器观察部54、图像处理部55。其中，显微观察部53内装于主体部分49，照明部51在臂48中配置在与显微观察部53对向的位置。这些显微观察部53和第一照明部51构成相位差观察用的显微镜。另外，容器观察部M收纳于臂48，第二照明部52在主体部分49中配置在与容器观察部M对向的位置。这些容器观察部M和第二照明部52构成反射观察用的观察系统。试样台47由透光性的材质构成，在其上载置培养容器30。该试样台47由高精度的载物台构成，通过使培养容器30沿水平方向(XY方向)移动，能够将培养容器30插入相位差观察用显微镜(显微观察部53及第一照明部51)的光路，或插入反射观察用观察系统 (容器观察部M及第二照明部52)的光路。另外，试样台47通过使培养容器30和相位差观察用显微镜之间的Z方向的位置关系发生变化，能够进行相位差观察用显微镜的焦距调节。另外，试样台47通过使培养容器30和相位差观察用显微镜之间的XY方向的位置关系发生变化，能够变更相位差观察用显微镜的观察点。观察单元观在将培养容器30插入反射观察用观察系统(容器观察部M及第二照明部52)的光路的状态下，能够拍摄培养容器30的整体的反射像。以下将通过该拍摄而取得的图像称为“反射图像”。另外，观察单元28在将培养容器30插入相位差观察用显微镜(显微观察部53及第一照明部51)的光路的状态下，能够拍摄培养容器30的局部的放大相位差像。以下将通过该拍摄而取得的图像称为“相位差图像”。另外，显微观察部53的物镜61及相位滤波器62的组合可在观察倍率不同的多种组合之间进行切换。例如，在2倍观察用的组合(物镜611ow及相位滤波器621ow)和4倍观察用的组合(物镜61high及相位滤波器62high)之间切换。因而，观察单元28在将物镜611ow及相位滤波器621ow设定于光路的状态下，能够取得倍率2倍的相位差图像(低倍相位差图像)，在将物镜61high及相位滤波器62high 设定于光路的状态下，能够取得倍率4倍的相位差图像(高倍相位差图像)。图像处理部55对观察单元观取得的图像(反射图像、低倍相位差图像、高倍相位差图像中的任一种图像)实施各种图像处理。另外，图像处理部55可执行的图像处理具有从图像检测细胞集落的集落检测处理(后述)等。接着，对恒温箱11的电气系统进行说明。图4是恒温箱11的电路方框图。如图4所示，恒温箱11的控制单元14与自动门 19的门开关机构19a、温度调节装置21、喷雾装置22、气体导入部23、环境传感单元对、容器搬出搬入机构26、容器输送机构27、观察单元观、监视器56a、输入钮5 分别连接。控制单元14按照规定的控制程序，集中控制恒温箱11的各部。作为一个例子，控制单元14对温度调节装置21、喷雾装置22、气体导入部23、环境传感单元M进行分别控制，将恒温室15内维持在规定的环境条件下。另外，控制单元14基于用户输入的观察时间表，控制观察单元观及容器输送机构27，自动地执行培养容器30的观察步骤。另外，控制单元14具有由硬盘及非易失性存储器等构成的存储部14a，储存观察数据、管理数据、学习图像数数据、学习抽样数据、判別面数据等各种数据。其中，观察数据是针对每一培养容器而准备的数据，管理数据是针对每一次实验而准备的数据，学习图像数数据及学习抽样数据是所有的实验通用的数据。另外，存储部Ha也储存有控制单元14 的动作所必要的动作程序，后述的控制单元14的动作设为该动作程序相应的动作。接着，对本实施方式的培养容器30进行说明。培养容器30是培养皿(碟子)，在其底部形成有饲养细胞层。在该饲养细胞层上设有多个人体细胞生育的专用培养基层，在各人体细胞内预先导入有获得分化万能性所必要的基因。当从培养开始经过一定时间(例如，一周时间)时，在培养容器30内生育的人体细胞的一部分就成为iPS细胞，形成iPS细胞集落。通常，在一次实验中，多个(在此，50个)培养容器30同时进行培养。在这50个培养容器30之间，导入细胞的基因的种类互不相同，iPS细胞集落的出现率是各种各样的。 因而，这50个培养容器30的观察时间表通过在培养了一周时间以后对每一容器都统计iPS 细胞集落出现率的方式进行设定。这种观察时间表的实验通常在更换成为培养对象的培养容器组的同时进行多次。接着，对各次实验中的控制单元14的动作进行说明。图5是各次实验中的控制单元14的动作流程图。下面，按照顺序对各步骤进行说明。步骤Sl 控制单元14通过例如下面的步骤⑴ (6)进行50个培养容器30的注册。(1)控制单元14将用户插入搬入口 17的培养容器30搬入恒温室15，并且向容器输送机构27指示培养容器30的输送。容器输送机构27输送该培养容器30，且将其载置在试样台47的规定位置。( 控制单元14向观察单元观发出指示，以使其取得培养容器30的反射图像。观察单元观当将培养容器30配置在反射观察用观察系统(容器观察部M及第二照明部52) 的光路，且在该状态下取得培养容器30的反射图像时，将该反射图像显示于监视器56a，并且写在上述的观察数据中。(3)控制单元14向容器输送机构27发出指示，以使其将培养容器30收纳在储料器25中。容器输送机构27将培养容器30收纳在储料器25中。(4)控制单元14通过将步骤⑴ (3)重复50次，来注册全部50个培养容器30。 另外，控制单元14按注册顺序对一次注册的50个培养容器30分配容器号1 50。(5)控制单元14将与所注册的50个培养容器30相关的观察时间表(培养条件、 培养时间、观察内容等)输入给用户。在此，从用户输入在培养了大约一周时间以后针对每一容器统计iPS细胞集落的出现率的观察时间表。另外，从用户向控制单元14的信息输入经由输入钮56b进行(以下也同样)。控制单元14将用户输入的观察时间表写在本次实验的管理数据中。(6)控制单元14按照写在本次实验的管理数据中的观察时间表，开始进行所注册的50个培养容器30的培养。步骤S2 控制单元14将写在本次实验的管理数据中的观察时间表和当前的日时进行比较，判别是否到了培养容器30的观察时期。在到了观察时期的情况下，移至步骤S3， 在还没有到观察时期的情况下，则等待。
步骤S3 控制单元14将容器号设定为初始值。步骤S4 控制单元14向容器输送机构27发出指示，以使其输送对应于当前的容器号的培养容器30 (以下称为“关注培养容器30”)。容器输送机构27将关注培养容器30 从储料器25搬出，并载置在试样台47的规定位置。步骤S5 控制单元14向观察单元观指定，以使其取得关注培养容器30整体的高倍相位差图像。观察单元观将关注培养容器30配置在相位差观察用显微镜(显微观察部 53及第一照明部51)的光路，并且将物镜61及相位滤波器62的组合设定为4倍观察用的组合(物镜611ot及相位滤波器621(J，在该状态下，边阶跃状地挪动观察点边重复取得高倍相位差图像。另外，观察单元观通过将所取得的多个高倍相位差图像平铺(tiling，相互连接)，取得关注培养容器30整体的高倍相位差图像(合成宏观图像I)。另外，控制单元14 将该合成宏观图像I写在关注培养容器30的观察数据中，并且显示于监视器56a(参照图 8)。步骤S6 控制单元14将当前时点的学习图像数数据与阈值(例如，50枚)进行比较，在没有超过阈值的情况下，移至手动模式(步骤S7)，在超过了阈值的情况下，移至自动模式(步骤S8)。另外，手动模式(步骤S7)是用户进行iPS细胞集落的手动判別(示教)， 且控制单元14进行学习的模式。另外，自动模式(步骤S8)是控制单元14进行iPS细胞集落的自动判別的模式。另外，当前时点的学习图像数数据是直到当前时点的学习所使用的总的图像数。步骤S9 控制单元14向容器输送机构27发出指示，以使其将关注培养容器30收纳在储料器25中。容器输送机构27将关注培养容器30收纳在储料器25中。步骤SlO 控制单元14判别容器号是否达到最终值(在此，50)，在没有达到最终值的情况下，移至步骤S11，在达到了最终值的情况下，终止流程。步骤Sll 控制单元14在将容器号递增以后，返回到步骤S4。接着，对手动模式中的控制单元14的动作进行说明。图6是手动模式中的控制单元14的动作流程图。下面，按顺序对各步骤进行说明。步骤S71 控制单元14将关注培养容器30的合成宏观图像I (图8)赋予图像处理部55，并且对该图像处理部55发出指示，以使其实施集落检测处理。图像处理部55通过对该合成宏观图像I实施二值化处理，取得二值化图像Γ (图9)，通过将该二值化图像 I'中显现的多个暗区域中区域尺寸超出规定范围的区域排除在外，取得二值化集落图像 I"(图10)。接着，图像处理部55将该二值化集落图像I 〃作为检测结果输出到控制单元 14。控制单元14将该二值化集落图像I"中显现的多个暗区域分别看作细胞集落，作成分别包围那些细胞集落的矩形框的图像(框图像)，将该框图像重叠在监视器56a显示中的合成宏观图像I上(图11)。步骤S72 控制单元14向用户发出指示，以使其在显示中的合成宏观图像I上指定iPS细胞集落。另外，从控制单元14向用户的信息输出经由监视器56a而进行(以下也同样)。用户从显示于监视器56a的多个细胞集落中选出iPS细胞集落，将该iPS细胞集落指定给控制单元14。控制单元14当细胞集落被指定时，通过对包围该细胞集落的矩形框的状态(例如，颜色、粗细、线类型等)进行变更，将用户的指定内容可视化(图12)。另外，在误指定了 Non-iPS细胞集落的情况下，用户通过再度指定该细胞集落，来解除该指定。控制单元14在再度指定了指定结束的细胞集落的情况下，看作是指定已被解除，将包围该细胞集落的矩形框的状态恢复原状。其后，用户当选择典型的iPS细胞集落且终止指定时，向控制单元14输入完成通知。另外，图13(A)所示的是所指定的细胞集落的放大图，图13(B)所示的是未指定的细胞集落的放大图。由图13(A)、(B)可知，所指定的细胞集落轮廓线明确，与背景的区別清晰， 与此相对，未指定的集落轮廓线不明确，与背景的区別�：�。步骤S73 控制单元14判别是否输入了完成通知，在未输入完成通知的情况下，返回到步骤S72，在输入了完成通知的情况下，移至步骤S74。步骤S74 控制单元14将在输入了完成通知的时点显示的框图像写在关注观察容器30的观察数据中。另外，控制单元14将在输入了完成通知的时点指定的细胞集落的个数(即，在输入了完成通知的时点发生了状态变化的矩形框的个数)作为iPS细胞集落的个数进行统计。另外，控制单元14将在输入了完成通知的时点未指定的细胞集落的个数(即，在输入了完成通知的时点未发生状态变化的矩形框的个数)作为Non-iPS细胞集落的个数&。n进行统计。另外，控制单元14利用R = Nips/ (NNon+NiPS)的算式，计算出iPS细胞的出现率R的值，将该出现率R写在关注培养容器30的观察数据中，并且显示于监视器 56a0步骤S75 控制单元14通过对在步骤S71的过程中取得的二值化集落图像I “实施轮廓抽取处理，抽取各个细胞集落的轮廓线Lc (图14)。另外，细胞集落的轮廓线Lc不管该细胞集落是不是iPS细胞集落，都成为闭合曲线。然后，控制单元14按下面的步骤(1) (3)抽取各个细胞集落的特征量。(1)控制单元14计算出与细胞集落的轮廓线Lc接触且位于该轮廓线Lc的外侧的带状区域100A，并且计算出与该轮廓线Lc接触且位于轮廓线Lc的内侧的带状区域 100B (图 15)。(2)控制单元14计算出合成宏观图像I中相当于带状区域100A的部分相位差图像的亮度平均值A及亮度离散值oA，并且计算出合成宏观图像I中相当于带状区域100B 的部分相位差图像的亮度平均值B及亮度离散值σ B(图16(A))。(3)控制单元14通过亮度平均值A减去亮度平均值B，计算出细胞集落的轮廓的锐度(A-B)，并且通过取亮度离散值oA和亮度离散值oB之和，计算出细胞集落的轮廓周边的粗糙度(ο A+ ο B)(图16 (B))。这些锐度(A-B)及粗糙度(ο A+ ο B)就是细胞集落的特征量。另外，以下将具有两个成分的该特征量称为“特征向量”。在此，如图16的左侧示意地所示，iPS细胞集落的轮廓明确，且轮廓Lc的外侧及内侧的亮度分别大致均勻，因此iPS细胞集落的轮廓的锐度(A-B)比较大，iPS细胞集落的轮廓周边的粗糙度(οΑ+ο B)比较小。另一方面，如图16的右侧示意地所示，Non-iPS细胞集落的轮廓不明确，且轮廓的外侧及内侧的亮度分别不均勻，因此Non-iPS细胞集落的轮廓的锐度(A-B)比较�。� Non-iPS细胞集落的轮廓周边的粗糙度(ο A+ο B)比较大。步骤S76 控制单元14假想特征向量的向量空间(特征量空间)，根据那些细胞集落的特征向量，将用户指定的细胞集落(iPS细胞集落)映射到特征量空间，由此取得iPS 细胞集落的映射目的地的集合(学习抽样数)。另外，控制单元14根据那些细胞集落的特征向量，将用户未指定的细胞集落(Non-iPS细胞集落)映射到特征量空间，由此取得Non-iPS细胞集落的映射目的地的集合(学习抽样数)(图17)。然后，控制单元14通过对当前时点的iPS细胞集落的学习抽样数据^加上本步骤取得的学习抽样数据 gi'(取集合和)，并且对当前时点的Non-iPS细胞集落的学习抽样数据加上本步骤取得的学习抽样数据(取集合和)，来更新学习抽样数据(图18—图19)。另外，实验次数为零时的学习抽样数据g”。(即，学习抽样数据g”。的初始值)为零(空集合)。另外，控制单元14计算出将更新后的学习抽样数据^和更新后的学习抽样数据 &分开的超平面，以作为判別面ScX图19)。该超平面例如是距学习抽样数据&的重心的距离和距学习抽样数据&的重心的距离相等那样的超平面。然后，控制单元14通过将对所算出的判別面&进行规定的系数覆盖在当前时点的判別面数据上，来更新该判別面数据。 另外，在使用该判別面&判别细胞集落是否为iPS细胞集落时，只要将映射到判別面&的上侧的细胞集落看作是Non-iPS细胞集落，且将映射到判別面&的下侧的细胞集落看作是 iPS细胞集落即可。另外，本步骤的判別面&的算出方法除在此说明的方法以外，还可采用公知的任何方法。步骤S77 控制单元14将学习图像数数据递增，结束手动模式的流程。接着，对自动模式中的控制单元14的动作进行说明。图7是自动模式中的控制单元14的动作流程图。下面，按顺序对各步骤进行说明。步骤S81 与上述的步骤S51同样，控制单元14将关注培养容器30的合成宏观图像I (图8)赋予图像处理部55，并且对该图像处理部55发出指示，以使其执行集落检测处理。与上述的步骤S71同样，图像处理部55取得二值化集落图像I 〃(图10)，且将该二值化集落图像I"作为检测结果输出到控制单元14。控制单元14将该二值化集落图像I"中显现的多个暗区域分别看作细胞集落，作成分别包围那些细胞集落的矩形框的图像(框图像)，将该框图像重叠在监视器56a显示中的合成宏观图像I上(图11)。步骤S82:控制单元14通过对在步骤S81的过程中取得的二值化集落图像I “实施轮廓抽取处理，来抽取各个细胞集落的轮廓线Lc (图14)。然后，控制单元14按与上述的步骤S75相同的步骤抽取各个细胞集落的特征向量。步骤S83 控制单元14基于当前时点的判別面数据，在特征向量的向量空间(特征量空间)中设定判別面S0 (图20)。然后，控制单元14按下面的步骤(1) ( 判別步骤S82抽取的各个细胞集落是否为iPS细胞集落。(1)控制单元14根据该细胞集落的特征向量将细胞集落映射到特征量空间，由此计算出该细胞集落的映射目的地(例如，图20的X标记)。(2)控制单元14在步骤(1)计算出的映射目的地为当前的判別面&的上侧的情况下，将该细胞集落判断为Non-iPS细胞集落，在该映射目的地为当前的判別面&的下侧时，将该细胞集落判断为iPS细胞集落。(3)控制单元14在将细胞集落判断为iPS细胞集落的情况下，在监视器56a上变更包围该细胞集落的矩形框的状态(例如，颜色、粗细、线类型等)。由此，步骤O)的判別结果被可视化(图12)。步骤S84 控制单元14向用户发出指示，以使其确认步骤S83的判別结果是否正确。用户在监视器56a上确认该判別结果是否正确，如果正确，则向控制单元14输入完成通知，如果不正确，则将向手动模式的过渡指示输入到控制单元14。步骤S85 控制单元14判别是否输入了完成通知，在没有输入完成通知的情况下， 移至步骤S86，在输入了完成通知的情况下，移至步骤S87。步骤S86 控制单元14判别是否输入了向手动模式的过渡指示，在没有输入过渡指示的情况下，返回到步骤S84，在输入了过渡指示的情况下，移至手动模式的步骤S72。步骤S87 控制单元14将在输入了完成通知的时点显示的框图像写在关注培养容器30的观察数据中。另外，控制单元14在步骤S83中统计判断为iPS细胞集落的细胞集落的个数NiPS。另外，控制单元14在步骤S63中统计判断为Non-iPS细胞集落的细胞集落的个数4。 。另外，控制单元14利用R = NiPS/(NN。n+NiPS)的算式计算出iPS细胞的出现率R 的值，将该出现率R写在关注培养容器30的观察数据中，并且显示于监视器56a，然后结束自动模式的流程。由以上可知，本实施方式的控制单元14在学习图像枚数数据超过阈值(在此，50) 的时点，体现自动模式，因此在第一次实验使用的培养容器30的个数为50个的情况下，在第二次以后的实验中，不需要用户指定iPS细胞集落。另外，本实施方式的控制单元14在自动模式下从作为相位差显微镜图像的合成宏观图像I中抽取表示细胞集落轮廓的明确度的特征向量，基于该特征向量和设定于特征量空间的判別面Stl，自动判別该细胞集落是否为iPS细胞集落，因此不需要事先将标记基因导入细胞。另外，本实施方式的控制单元14将位于细胞集落的轮廓线Lc的外侧的带状区域 100A的亮度平均值A和位于轮廓线Lc的内侧的带状区域100B的亮度平均值B之间的差值 (A-B)作为特征向量的一个成分来抽�。虼四芄桓咦既范鹊亟邢赴涫欠裎猧PS细胞集落的判別。另外，本实施方式的控制单元14将带状区域100A的亮度离散值ο A和带状区域 100Β的亮度离散值σ B之和(σ A+ σ B)作为特征向量的一个成分来抽�。虼四芄桓咦既范鹊亟邢赴涫欠裎猧PS细胞集落的判別。另外，本实施方式的控制单元14基于用户对多个合成宏观图像I的手动判別(示教)的结果，设定作为自动判別的判別基准的判別面&，因此用户自己能够定制恒温箱11。另外，本实施方式的控制单元14只要学习图像枚数数据不超过阈值(在此，50)就不体现自动模式，因此能够将自动判別的精度可靠地设为一定精度以上。另外，本实施方式的控制单元14在用户对自动判別的判別结果不满的情况下，立即开始手动判別(示教)，因此能够避免误测定的可能性。另外，本实施方式的控制单元14即使学习图像枚数数据超过了阈值(在此，50)， 也能够根据用户的请求进行多次手动判別(示教)，因此用户也能够根据需要提高自动判別的精度。另外，图5所示的控制单元14的动作也可进行变形，如下所述。S卩，省略图5的步骤S6、S7，在步骤S5、S9之间插入步骤S8 (图7的子程序处理)。 但是，在该情况下，控制单元14事先执行获得iPS细胞集落的学习抽样数据的示教处理 (图6的子程序处理)。该示教处理中的控制单元14通过在合成宏观图像I上将iPS细胞集落指定给用户(指定数可以是任意的)，且执行图6(手动模式)的步骤S74 S77所示的处理，获得 iPS细胞集落的学习抽样数据而存储。因此，此后的控制单元14能够基于所存储的学习抽样数据，执行从被检查对象合成宏观图像I自动地判别iPS集落的自动判別处理。这样，如果另外实施示教处理，就能够以任意的定时立即开始自动判別处理。另外，也可将该学习抽样数据存储在与本装置同机种的另外的装置中，在该情况下，可省略该装置中的示教处理。另外，本实施方式的控制单元14使用值(A-B)作为轮廓线的锐度的指标，但也可以使用表示轮廓线的从内侧到外侧的亮度梯度的其他指标。例如，也可以使用值(B/A)。另外，本实施方式的控制单元14使用带状区域100A的亮度离散值ο々和带状区域100Β的亮度离散值οΒ之和(οΑ+οΒ)作为轮廓线周边的粗糙度的指标，但也可以使用带状区域100Α的亮度差Δ A和带状区域100Β的亮度差ΔΒ之和(ΔΑ+ΔΒ)。另外，在此所说的“带状区域的亮度差”是指相当于带状区域的部分相位差图像的最大亮度和最小亮度之差。另外，本实施方式的控制单元14使用二维特征向量作为特征向量，但也可以使用一维或三维以上的特征向量。另外，本实施方式的控制单元14将特征向量的成分设为轮廓的锐度和轮廓周边的粗糙度的组合，但也可以设为其他组合。作为特征向量的成分，作为有效的量，除轮廓的锐度、轮廓周边的粗糙度以外，还可举出轮廓线内的区域尺寸、轮廓线内的区域的亮度平均值等。另外，在本实施方式中，将应从细胞集落的相位差显微镜图像抽取的特征量设为表示细胞集落的轮廓的明确度的特征量，但也可以设为表示细胞集落的边缘的变化度(具体而言，边缘信号的变化量)的特征量。边缘信号的变化量可通过对细胞集落的相位差显微镜图像的微分处理等来抽取。例如，基于微分法的边缘检测处理(利用抽取边缘信号发生变化的部分的微分处理)、拉普拉斯算子的边缘检测处理(作为仅检测边缘强度的方法， 利用二次微分的拉普拉斯算子)等。另外，在本实施方式的恒温箱中，也可以在控制单元14进行图像处理部55的动作的一部分或全部。另外，也可以在图像处理部55进行控制单元14的动作的一部分或全部。另外，在本实施方式中，将培养对象设为人体细胞，但也可以设为其他动物的体细胞。但是，是否为iPS细胞集落的判別基准有可能会因动物的种类而不同，因此控制单元14 可以针对每一种动物来准备上述的学习图像数据、学习抽样数据、判別面数据。
权利要求
1.一种图像处理装置，其特征在于，具备抽取单元，从细胞集落的相位差显微镜图像中抽取表示该细胞集落的轮廓的明确度的特征量；自动判別单元，基于所述抽取单元抽取的特征量和预定的判別基准，自动判別所述细胞集落是否为iPS细胞集落。
2.如权利要求1所述的图像处理装置，其特征在于，所述抽取单元在所述相位差显微镜图像中设定包含细胞集落的轮廓线的规定宽度的带状区域，且抽取该带状区域的亮度离散值和亮度平均值中的至少一个。
3.如权利要求1或2所述的图像处理装置，其特征在于，所述抽取单元在所述相位差显微镜图像中将位于细胞集落的轮廓线外侧的带状区域的亮度平均值和位于所述轮廓线内侧的带状区域的亮度平均值的差作为所述特征量中的至少一个成分来抽取。
4.如权利要求1 3中的任一项所述的图像处理装置，其特征在于，所述抽取单元在所述相位差显微镜图像中将位于细胞集落的轮廓线外侧的带状区域的亮度离散值和位于所述轮廓线内侧的带状区域的亮度离散值之和作为所述特征量的至少一个成分来抽取。
5.如权利要求1 4中的任一项所述的图像处理装置，其特征在于，具备示教装置，使多个细胞集落的相位差显微镜图像显示于监视器，操作者分别对所述多个细胞集落进行是否为iPS细胞集落的手动判別；抽取单元，分别对所述多个细胞集落抽取表示轮廓的明确度的特征量；设定单元，基于所述抽取单元分别对所述多个细胞集落抽取的特征量和所述操作者分别对所述多个细胞集落进行的手动判別结果，设定所述自动判別单元的判別基准。
6.一种培养观察装置，其特征在于，具备收纳培养容器的恒温室、取得收纳于所述恒温室内的培养容器的相位差显微镜图像的摄像单元、对所述摄像单元取得的相位差显微镜图像进行处理的权利要求1 5中的任一项所述的图像处理装置。
7.一种图像处理方法，其特征在于，包括如下步骤抽取步骤，从细胞集落的相位差显微镜图像中抽取表示该细胞集落的轮廓的明确度的特征量；自动判別步骤，基于按所述抽取步骤抽取的特征量和预定的判別基准，自动判別所述细胞集落是否为iPS细胞集落。
8.如权利要求7所述的图像处理方法，其特征在于，在所述抽取步骤中，在所述相位差显微镜图像中设定包含细胞集落的轮廓线的规定宽度的带状区域，抽取该带状区域的亮度离散值和亮度平均值中的至少一个。
9.如权利要求7或8所述的图像处理方法，其特征在于，在所述抽取步骤中，在所述相位差显微镜图像中将位于细胞集落的轮廓线外侧的带状区域的亮度平均值和位于所述轮廓线内侧的带状区域的亮度平均值之差作为所述特征量中的至少一个成分来抽取。
10.如权利要求7 9中的任一项所述的图像处理方法，其特征在于，在所述抽取步骤中，在所述相位差显微镜图像中将位于细胞集落的轮廓线外侧的带状区域的亮度离散值和位于所述轮廓线内侧的带状区域的亮度离散值之和作为所述特征量中的至少一个成分来抽取。
11.如权利要求7 10中的任一项所述的图像处理方法，其特征在于，包括如下步骤 示教步骤，使多个细胞集落的相位差显微镜图像显示于监视器，操作者分别对所述多个细胞集落进行是否为iPS细胞集落的手动判別；抽取步骤，分别对所述多个细胞集落抽取表示轮廓的明确度的特征量； 设定步骤，基于所述抽取步骤分别对所述多个细胞集落抽取的特征量和所述操作者分别对所述多个细胞集落进行的手动判別结果，设定所述自动判別步骤的判別基准。
12.—种图像处理装置，其特征在于，具备抽取单元，从细胞集落的相位差显微镜图像中抽取表示该细胞集落的边缘变化度的特征量；自动判別单元，基于所述抽取单元抽取的特征量和预定的判別基准，自动判別所述细胞集落是否为iPS细胞集落。
全文摘要
本发明提供一种不使用荧光蛋白质基因等标记基因而判别细胞有无初始化的图像处理装置。因此，本发明的图像处理装置从细胞集落的相位差显微镜图像中抽取表示该细胞集落的轮廓的明确度的特征量(S62)，基于所述特征量和预定的判別基准，自动判別所述细胞集落是否为iPS细胞集落(S63)。
文档编号G01N21/17GK102471744SQ20108003273
公开日2012年5月23日 申请日期2010年7月20日 优先权日2009年7月21日
发明者中川诚人, 和田阳一, 渡边博忠 申请人:国立大学法人京都大学, 株式会社尼康
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