专利名称：利用获取光的多发色团检测和分析多核苷酸的方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及检测和分析样品中多核苷酸的方法、物品和组合物。
背景技术：
可实现DNA序列实时检测且灵敏度高的方法具有重大的学术和经济利益。u’3其应用包括医学诊断、遗传突变的鉴定、基因送递监控和特定基因组技术。4阳离子有机染料，如溴化乙锭和噻唑橙被插入双链DNA (ds DNA)的沟槽中，并充当直接DNA杂交探针时，便可激发，但缺乏序列特异性。5’6用于链特异性测定的能量/电子转移发色团对是存在的，但需要化学标记两个核酸，或双重修饰相同的改变链(例如，分子信标)。7’8标记两个DNA位点的困难导致了低产率、高成本，并生成了单个标记的杂质，从而使检测灵敏度较低。9最近，有关肽核酸(PNAs)的介绍提供了新的研究和诊断应用方面的契机。1(l’n在PNA中，DNA中带负电荷的磷酸键被肽模拟物中性酰胺键取代。与类似的DNA/DNA复合体相t匕，PNA/DNA复合体的形成更为快速，结合能更高，特异性也更高。12这些特性之所以被增强，是因为缺乏在带负电荷的DNA双链之间所存在的库伦排斥。PNA复合体具有更高的热稳定性，这是因为其主链对核酸酶、蛋白酶和肽酶生物降解的敏感性降低了。13’14另外，PNA复合体在杂交期间对离子强度和PH通常不敏感，从而为DNA检测提供了更为宽广的平台。18因此本领域需要检测和分析样品中特定多核苷酸的方法，以及在这些方法中有用的组合物和物品。
发明内容
本发明提供了用于检测和分析样品中目标多核苷酸的方法、组合物和物品。将怀疑含有目标多核苷酸的样品与聚阳离子多发色团和传感肽核酸(PM)接触，其中传感肽核酸与目标多核苷酸互补。使传感PNA与信号传递发色团缀合。无需受理论约束，样品中存在目标多核苷酸时，认为通过利用与目标多核苷酸主链的静电相互作用，信号传递发色团被带入邻近阳离子多发色团的近程，其中目标多核苷酸已与传感PNA杂交(见图I)。随后，信号传递发色团可从已激发的聚阳离子多发色团获得能量，并发射可检测的光。目标多核苷酸天然存在于样品中时，可对其进行分析，或者可以在分析之前或分析的同时将其扩增。本发明提供了包含用于实现本发明方法的试剂的溶液，也提供了含有该试剂的试剂盒。本发明方法可用于多路设置，其中采用了多种不同传感PNA分析多种不同目标多核苷酸。本发明方法可任选在特定表面上进行，例如采用可与表面缔合的聚阳离子多发色团；该表面可以是传感器。本发明方法也可以均相形式被提供。检测多核苷酸的其它技术均可将此处所描述的方法和物品作为选择方案。
图I表示了本发明方法，采用聚阳离子聚合物作为获取光的多发色团。提供了传感PNA(PNA-O)，包含信号传递发色团，并具有与所关心目标多核苷酸互补的碱基序列。在与样品中目标多核苷酸接触时，由于与目标多核苷酸存在静电相互作用，聚阳离子多发色团被带入邻近信号传递发色团的近程。随后，多发色团的激发使信号传递发色团发射光。图2所示分别为聚合物I (见下文)和传感肽核酸PNA-C* 的吸收(绿色和橙色)和发射(蓝色和红色)光谱。对聚合物I和PNA-C*的激发分别在380和480nm处进行。图3所示为通过聚合物I的激发，在互补(红色)和非互补(黑色)DNA存在条件下的PNA-C*发射光谱。将PNA-C*和相应的DNA —起加入pH = 5. 5的水中。该光谱相对于聚合物I的发射被标准化。图4所示为通过寡聚体2的激发，在互补(红色)和非互补(黑色)DNA存在条件下的PNA-C*发射光谱。将PNA-C*和相应的DNA —起加入pH = 5. 5的水中。该光谱相对于寡聚物2的发射被标准化。
具体实施例方式目前，有关DNA和RNA传感器(包括“基因-芯片”和“DNA-芯片”)的技术均基于荧光标记(发光团)与DNA单链的共价附着。这些传感器中的大部分均不得不依赖于被分析样品的标记，由于样品间标记反应的效率变化导致了若干不可避免的难题，因而需要复杂的交叉校准。其它系统则依赖于“分子信标”方法，需要附着发光团并准确对工程改造序列淬灭。本发明的一种方法包括使样品与主要为水性的溶液中的至少两种组分接触(a)获取光、发光的多发色团系统，例如共轭聚合物，半导体量子点或水溶性树枝状结构；和(b)与发光信号传递发色团或“PNA-C*”缀合的传感PNA。在多发色团激发时，具有信号传递发色团-C*的特征性光波长的发射说明溶液中存在目标多核苷酸。通过利用分别具有不同碱基序列和不同信号传递发色团(PNA1-C1^PNA2-C2*、PNA3-C3*、PNA4-C4*等)的多种不同传感PNA，可独立检测并分析多种不同多核苷酸。本发明所选择的获取光的发色团和信号传递发色团(C*)可使两个发色团的吸收条带的重叠程度最�。⑹沽街址⑸诺姆⒐夥⑸涔馄椎牟ǔげ煌�。当在水性溶液中制备时，获取光的发光多发色团系统带正电荷或阳离子，优选聚阳离子(例如与聚电解质结合的聚阳离子)。由于传感PNA不带电荷，因此，在传感PNA与获取光的阳离子发光多发色团系统之间存在的库伦相互作用最小。在加入与传感PNA序列互补的目标多核苷酸时，目标多核苷酸与该传感PNA杂交。由于目标多核苷酸带负电荷，传感PNA与聚阳离子多发色团缔合，使能量从聚阳离子多发色团转移至信号传递发色团，例如，经由F6rs ter能量转移机制。当加入碱基序列与传感PNA的碱基序列不互补的多核苷酸时，碱基对杂交不发生，多发色团与传感PNA之间静电介导的络合作用也不出现。在不发生上述杂交的情况下，聚阳离子多发色团与信号传递发色团之间的平均距离对有效能量转移而言由于过大，使信号传递发色团很少或无发射。上述总体方案可用于检测受检溶液中目标多核苷酸的存在。另外，PNA通过结合并插入ds DNA和置换相同序列的DNA链，从而具有了形成三重结构的能力。15’16’17上述传感PNA/聚阳离子多发色团平台可被掺入用于直接检测ds DNA的系统中。18除已描述方法外，本发明也提供了一种包含至少两种下述组分，且主要为水性的溶液；(a)阳离子多发色团，和(b) “传感PNA”(PNA-C*)，包括与信号传递发色团缀合的肽核酸。如实施例所例证的，可利用由水溶性多发色团，如共轭聚合物提供的光学放大，检测与PNA传感器杂交的多核苷酸。通过利用较高分子量的水溶性共轭聚合物或其它结构，如此处所描述的聚阳离子多发色团可增强上述放大。本发明可以 均相形式被提供，即利用荧光检测法提供的方便，并利用在PNA-INA相互作用中发现的增强的杂交情况。本发明可被用于检测扩增的目标多核苷酸，或者在独立试验中由于信号放大程度大，从而无需扩增多核苷酸。因此，本发明超越现有基因芯片技术的独特优势包括，避免了在分析之前，通过将发光团或发色团共价偶联至样品中所含或样品来源的多核苷酸，对待分析各样品进行首次标记的需要。上述偶联方法在偶联效率的再现性方面存在固有困难，因而需要样品间的交叉校准。此处描述的本发明对可用于检测样品是否存在目标多核苷酸的任何试验均有用。典型的试验包括测定样品中目标多核苷酸的存在或其相对量，或者该试验可定量或半定量。本发明的方法均可以多路形式进行。可采用多种不同传感PNA，并通过利用与相应的传感PNA缀合的不同信号传递发色团，检测样品中相应的不同目标多核苷酸。本发明提供的多路方法应用了 2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200、400或更多的不同传感PNA，这些传感PNA均可被同时用于测定相应的不同目标多核苷酸。本发明方法可在基质上以及溶液中进行，但溶液形式被认为由于存在扩散，因而更为快速。因此，试验可在例如，基质上以阵列形式进行，该基质可以是传感器。该试验可通过锚定或其它方式将试验组分，如传感多核苷酸、聚阳离子多发色团，或二者一起掺入上述基质而得以实现。上述基质可以为玻璃、硅、纸、塑料表面或作为光电传导器应用的光电半导体(例如，但不仅限于，掺铟氮化镓或聚合聚苯胺等)的表面。特定传感多核苷酸的定位可以是已知的，或者可以阵列形式被测定，该阵列形式可以是可微寻址或可毫微寻址的。进一步详述本发明前，应当理解的是本发明不仅限于已描述的特定方法、装置、溶液或仪器，当然还可对这些方法、装置、溶液或仪器进行改动。也应当理解的是此处所用的术语仅被用于描述特定实施方案，对本发明范畴不构成限制。上下文如无另外指明，单数形式“一个” “一种”和“该”的应用包括复数范围。因此，例如“一种目标多核苷酸”包括多个目标多核苷酸，“一种信号传递发色团”包括多个这样的发色团，“一种传感PNA”包括多个传感PNA，等等。另外，上下文如无另外指明，特定复数形式，如“两个”、“三个”等术语的应用应被解读为较大数量的相同描述对象。术语如“相连的”、“附着的”、“联接的”和“缀合的”在此文中可互换使用，如上下文无另外指明，这些术语也包括直接和间接的相连、附着、联接或缀合。本发明所列的数值范围应被理解为也具体公开了所列上限与下限之间的各居间整数值及其各分数值，以及这些数值之间的各子范围。任何范围的上限和下限均可独立地被包括在该范围内或被该范围排除在外，仅包括一个极限、两个极限均不包括或两个极限均包括的范围也在本发明范畴内。本发明所论述的某些数值具有固有极限，例如一种组分存在的浓度范围是0-100%，或者水溶液的PH范围是1-14，本文也特定公开了这些固有极限。对本发明已明确列出的数值而言，应当理解的是与所列数值大约相同数和量的数值也在本发明范畴内，可将其视为基于所列数值的范围。对本发明所公开的组合而言，本发明也具体公开了该组合中组分的各种亚组合，这些亚组合也在本发明范畴内。与之相反，对本发明公开的不同组分或组分群而言，本发明也公开了其组合。本发明的任何组分若被公开存在多种备选物，本发明也公开了逐一排除各备选物或与其它备选物任意组合的发明实例； 可如上排除超过一种的本发明组分，因此本发明也公开了存在上述排除的组分的所有组合。如无另外定义或上下文另外指明，此文所用的所有技术和学术术语均与本发明所属领域内任何一位普通技术人员通常理解的意思相同。虽然与此文所描述方法和材料相似或等效的任何方法和材料均可应用在本发明的实践或试验中，本文仍然仅描述了优选方法和材料。此文提及的所有出版物均被合并在此作为参考，用于公开并描述所引用参考文献中的特定材料和方法。此文所论述的出版物可被提供的原因仅因为其公开早于本申请的提交日期。此文无任何内容可以被认为是承认本发明不能由于发明在先而早于该公开内容。定义描述本发明的过程中，应用到下列术语，但这些术语并不仅限于下文所指的定义。术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在此文中可互换使用，指任意长度核苷酸的聚合形式，可包括核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其类似物，或其混合物。这些术语仅指分子的一级结构。因此，这些术语包括三链、双链和单链脱氧核糖核酸(“DNA”)，以及三链、双链和单链核糖核酸(“RNA”)。也包括该多核苷酸的修饰形式，例如通过烷基化和/或加帽，和未修饰形式。无论修饰或未修饰形式，聚合的目标核苷酸均应具有聚阴离子主链，优选的聚阴离子主链以糖-磷酸为基础，并携带足以与此文所描述方法中的聚阳离子多发色团发生静电相互作用的负电荷，不过，其它力也可能参与该相互作用。本发明中的传感多核苷酸的实例是肽核酸，但也可采用其它不带电荷，且在不存在目标的情况下与多发色团的相互作用程度最小的多核苷酸。针对特定试验形式的合适杂交条件可由本领域任何一位技术人员确定；可调节的非限制性参数包括试验组分的浓度、pH、所采用的盐及其浓度、离子强度、温度
坐寸o更具体而言，术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脱氧核糖核苷酸(含有2-脱氧-D-核糖)、多核糖核苷酸(含有D-核糖)，包括已剪接或未剪接的tRNA.rRNA.hRNA和mRNA，任何其它类型的多核苷酸，即嘌呤或嘧啶碱基的N-或C-糖苷，和含有磷酸或其它聚阴离子主链的其它聚合物，和其它合成的序列特异性核酸聚合物，前提是该聚合物包含了其构型可实现碱基配对和碱基堆积的核酸碱基，例如在DNA和RNA中发现的情况。因此，上述术语包括，例如，3’ -脱氧-2’，5’ -DNA、寡脱氧核糖核苷酸N3’ P5’氨基磷酸酯、2’ -O-烷基-取代RNA、双和单链DNA，以及双和单链RNA，和它们的杂交体，包括例如DNA与RNA之间的杂交体，也包括已知类型的修饰，例如，标记、烷基化、“帽”、由类似物对一个或多个核苷酸的取代，核苷酸间的修饰例如，具有带负电荷键的核苷酸间修饰(如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)、含有悬垂部分的核苷酸间修饰，例如蛋白质(包括酶(如核酸酶)、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等)、具有嵌入剂的核苷酸间修饰(如吖啶、补骨脂素等)、含有(例如金属、放射性金属、硼、氧化金属等的)螯合物的核苷酸间修饰、含有烷化剂的核苷酸间修饰、具有修饰键的核苷酸间修饰(如a异头核酸等)，以及多核苷酸或寡核苷酸的未修饰形式。应当意识到的是，此处所用术语“核苷”和“核苷酸”均包括那些不仅含有已知嘌呤和嘧啶碱基，还含有其它已修饰杂环碱基的部分。上述修 饰包括甲基化嘌呤或嘧啶、酰化嘌呤或嘧啶，或其它杂环。修饰的核苷或核苷酸也包括糖部分的修饰，例如，其中的一个或多个羟基被取代为卤素、脂肪族基团，或者被官能化为醚、胺等。术语“核苷酸单位”包括核苷和核苷酸。此外，对核苷酸单位的修饰包括重排、添加、取代或以其它方式改变嘌呤或嘧啶碱基上的功能基团，从而形成了连接相应互补嘧啶或嘌呤的氢键。所获的修饰核苷酸单位任选地可与其它所述修饰核苷酸单位配对，而不是与A、T、C、G或U形成碱基配对。无碱基位点可以被掺入，而不妨碍该多核苷酸的功能；优选的多核苷酸不包括无碱基位点。该多核苷酸中的某些或所有残基均可以一种或多种方式被任选修饰。标准A-T和G-C碱基对可在特定条件下形成，该条件下，可使胸苷的N 3_H和C4-0分别与腺苷的NI和C6-NH2之间形成氢键，使胞苷的C2_0、N3和C4-NH2分别与鸟苷的C2-NH2、N’ -H和C6-0之间形成氢键。因此，例如，鸟苷(2-氨基-6-氧-9-0 -D-呋喃核糖基-嘌呤)可以被修饰，从而形成异鸟苷(2-氧-6-氨基-9-0 -D-呋喃核糖基-嘌呤)。这样的修饰可产生将不再与胞嘧啶有效形成标准碱基配对的核苷碱基。不过，使胞嘧啶(1-0 -D-呋喃核糖基-2-氧-4-氨基-嘧啶)形成异胞嘧啶(1-0 -D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧-嘧啶)的修饰可产生将不再与鸟苷有效碱基配对，而将与异鸟苷形成碱基配对的修饰核苷酸。异胞卩密唳可从Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)获得；异胞苷可通过 Switzer et al. (1993)Biochemistry 32 :10489-10496 及其所引用参考文献中的描述方法制备；2’-脱氧-5-甲基-异胞苷可通过Tor et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 1154461-4467及其所引用参考文献中的描述方法制备；异鸟嘌呤核苷酸可采用上述Switzeret al. (1993)和 Mantsch et al. (1993) Biochem. 14 :5593-5601 描述的方法制备，或者通过Collins et al.的美国专利No. 5，780，610描述的方法制备。其它非天然碱基配对可通过 Piccirilli et al. (1990)Nature 343 :33-37 针对 2，6-二氨基嘧啶及其互补体(I-甲基吡唑_[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)_ 二酮)描述的方法合成。其它类似可形成独特碱基配对的修饰核苷酸单位是已知的，如Leach et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114 =3675-3683和上述Switzer et al.描述的修饰核苷酸单位。“互补”或“基本互补”指核苷酸或核酸之间，例如传感肽核酸与目标多核苷酸之间杂交或碱基配对的能力。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)、或C和G。对两个单链多核苷酸或PNA而言，当经过最优比对和比较，且存在适当插入或缺失的一条链上的碱基与另一条链上至少大约80%，通常至少大约90% -95%,更为优选大约98-100%的碱基配对时，便可认定这两个单链多核苷酸或PNA基本上互补。可选地，当多核苷酸或PNA在选择性杂交条件下与其补体杂交时，便存在基本互补性。典型地，当在超过至少14-25个碱基的范围内存在至少大约65%互补，优选至少大约75%,更为优选至少大约90%互补时,便可发生选择性杂交。见M. Kanehisa Nucleic AcidsRes. 12 :203(1984)。“优先结合”或“优先杂交”指一个多核苷酸或PNA与样品中的其互补体结合的倾向要大于其结合该样品中非互补聚合物的倾向。
杂交条件典型地包括低于大约1M，更为通常的是低于大约500mM，优选低于大约200mM的盐浓度。在肽核酸与聚阴离子多核苷酸杂交的情况中，该杂交可在含有极少或无盐的溶液中实现。杂交温度可低至5°C，但典型地高于22°C，更为典型地高于大约30°C，优选地超过大约37°C。较长的片段可能需要较高的杂交温度以实现特异性杂交。可能影响杂交严格性的其它因素包括碱基组成和互补链长度、有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所采用参数的组合比任一独立参数的绝对度量重要。可控制的其它杂交条件包括缓冲剂类型和浓度、溶液pH、用于减少背景结合的封闭试剂，如重复序列或封闭蛋白质溶液的存在和浓度、洗涤剂类型和浓度、可提高多核苷酸相对浓度的分子，诸如聚合物，还包括金属离子及其浓度，螯合剂及其浓度，及本领域已知的其它条件。此处所用的“多路”指可同时测定多个分析物的测定或其它分析方法。“任选”或“任选地”指后续描述的事件或情况可能或不可能发生，且该描述包括上述事件或情况发生和不发生的实例。样品包含或怀疑包含目标多核苷酸的样品的一部分可以是任意来源的生物学材料，包括可直接或间接从活生物体，包括细胞、组织或流体中获得的多核苷酸，以及从该生物遗留的沉积物，包括病毒、支原体和化石中获得的多核苷酸。样品可包含全部或部分地通过合成途径制备的目标多核苷酸。典型地，样品以主要为水性的介质的形式获得，或者分散在该主要为水性的介质中。样品的非限制性实例包括血、尿、精液、乳汁、痰、粘液、口腔刮片、阴道刮片、直肠刮片、吸出物、穿刺活检物、通过例如外科或尸体解剖获得的组织切片、血浆、血清、脊髓液、淋巴液、皮肤、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的外分泌物、泪、唾液、肿瘤、器官、体外细胞培养成分的样品(包括但不仅限于通过细胞在细胞培养基中生长而获得的条件培养基、被假定感染病毒的细胞、重组细胞和细胞组分)，以及包含多核苷酸序列的重组文库。样品可以是阳性对照样品，即已知其含有目标多核苷酸或其替代物。阴性对照样品也可被采用，该阴性对照样品虽然被预期不含目标多核苷酸，但被怀疑含有该目标多核苷酸(被一种或多种试剂污染)或其它可产生假阳性的组分，经过检验以证实其未被特定实验中所用试剂的目标多核苷酸污染，也需测定是否一组特定试验条件产生了假阳性(即使在样品中不存在目标多核苷酸的情况下也出现阳性信号)。样品可被稀释、溶解、悬浮、提取或通过其它方式处理，从而使任何存在的目标多核苷酸溶解和/或纯化，或者使其更易受扩增方案所用试剂或检测试剂的影响。样品含有细胞的情况中，该细胞可被裂解或透化，从而释放出其中的多核苷酸。可采用一步通透化缓冲剂裂解细胞，从而可以在裂解后直接进行进一步的步骤，例如聚合酶链反应。目标多核苷酸及其产生的扩增产物
目标多核苷酸可以是单链、双链或更高级结构，也可以是线型或环状。单链目标多核苷酸的实例包括mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因组，但这些多核苷酸也可含有固有互补序列和重要的二级结构。双链目标多核苷酸的实例包括基因组DNA、线粒体DNA、叶绿体DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因组、质粒、噬菌体和类病毒。目标多核苷酸可通过合成途径制备，或由生物学来源纯化获得。目标多核苷酸可被纯化，从而除去或减少样品中一种或多种不被希望含有的组分，或实现浓缩该目标多核苷酸的目的。与之相反，当该目标多核苷酸的浓度对特定试验而言过高时，可稀释该目标多核苷酸。在样品收集和任选的核酸提取之后，可使包含 目标多核苷酸的样品中的核酸部分进行一种或多种预备反应。这些预备反应可包括体外转录(IVT)、标记、破碎、扩增和其它反应。mRNA可首先经由逆转录酶和引物的处理，从而在检测和/或扩增之前生成cDNA ;该处理可采用纯化的mRNA于体外或原位实现，例如在固定于载玻片的细胞或组织中。核酸扩增增加了所关心序列，如目标多核苷酸的拷贝数量。有多种扩增方法均适合应用，包括聚合酶链反应方法(PCR)、连接酶链反应(LCR)、自动维持序列扩增(3SR)、以核酸序列为基础的扩增(NASBA)、利用QP复制酶、逆转录、切口平移等。目标多核苷酸为单链时，第一轮扩增形成了与目标多核苷酸互补的引物延伸产物。如果该目标多核苷酸为单链RNA，在首次扩增中采用了具有逆转录酶活性的聚合酶，以将RNA逆转录为DNA，可另外进行扩增循环以拷贝该引物延伸产物。用于PCR的引物必须且应当被设计为可与其相应模板中的区域杂交，从而生成可扩增的片段；因此，各引物必须杂交，以使其3’核苷酸与其互补模板链中位于从特定引物的3’核苷酸的3’侧的核苷酸配对，该特定引物被用于在该PCR中扩增互补模板链。目标多核苷酸典型地通过下述步骤得以扩增，即，使该目标多核苷酸的一条或多条链与引物和特定聚合酶接触，从而生成全长互补多核苷酸或其较小片段，其中该特定聚合酶具有可延伸上述引物并拷贝目标多核苷酸的合适活性。任何具有可拷贝目标多核苷酸的聚合酶活性的酶均可被采用，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、具有超过一种类型聚合酶活性的酶，且该酶可以是不耐热或耐热的。也可采用这些酶的混合物。这些酶的实例包括DNA聚合酶，诸如DNA聚合酶I( “Pol I”)、Pol I 的克列诺片段、T4、T7、Sequenase T7、Sequenase Version 2. 0T7、Tub、Taq、Tth、Pfx, Pfu, Tsp、Tfl, Tli 和火球菌种 GB-D DNA 聚合酶；RNA 聚合酶，诸如大肠杆菌、SP6、T3和I7RNA聚合酶；逆转录酶，诸如AMV、M-MuLV, MMLV, RNAseH-MMLV ( SuperScript )、SuperScript II、ThermoScript 、HIV-I 和RAV2逆转录酶。上述所有酶均力商业可提供的。具有多特异性的I合酶实例包括RAV2和Tli (exo-)聚合酶。耐热聚合酶实例包括Tub、Taq、Tth、Pfx, Pfu, Tsp、Tfl.Tli和火球菌种GB-D DNA聚合酶。选择合适的反应条件以实现目标多核苷酸的扩增，这些条件包括pH、缓冲剂、离子强度、一种或多种盐的存在及浓度、反应物和辅因子，如核苷酸和镁和/或其它金属离子(如锰)的存在及浓度、任选的共溶剂、温度、用于包括聚合酶链反应在内的扩增方案的热循环流程，合适的反应条件可部分地根据所用聚合酶以及样品的性质选择。共溶剂包括甲酰胺(典型地为大约2-大约10% )、甘油(典型地为大约5-大约10% )和DMSO(典型地为大约0. 9-大约10% )。扩增方案中可采用某些技术以使扩增期间产生的假阳性或伪迹的产生减至最少。这些技术包括“touchdOWn”PCR、热启动技术、利用嵌套引物或设计PCR引物使其在形成引物-二聚体时可形成茎-环结构，并因而不被扩增。可使PCR加速的技术也可被采用，例如离心PCR，可使样品内实现较高程度的对流，也包括红外加热步骤以快速加热并冷却样品。可进行一个或多个循环的扩增。可利用一种引物的过量以在PCR期间生成过量的引物延伸产物；优选地，过量产生的该引物延伸产物是待检测的扩增产物。有多种不同引物均可被用于扩增不同的 目标多核苷酸或样品内特定目标多核苷酸的不同区域。可以对扩增的目标多核苷酸进行扩增后处理。例如，在某些情况中，为提供更易于接受的片段，在杂交之前将目标多核苷酸片断化是理想的。通过可产生有助于试验进行的某一尺寸片段的任何方法，均可使核酸断裂；合适的物理、化学和酶促方法是本领域已知的。扩增反应可在特定条件下进行，该特定条件可使传感多核苷酸在至少一部分扩增循环期间与扩增产物杂交。当试验以该方式进行时，通过监控信号传递发色团发射的光的变化便可实现对该杂交事件的实时检测，其中信号传递发色团的光发射在扩增方案期间的上述杂交时发生。聚阳离子多发色团获取光的多发色团系统已被证实由于包含了多个发色团，从而成为有效的光吸收体。其实例包括但不仅限于，共轭聚合物、缀合分子的聚集物、经由侧链附着饱和聚合物、半导体量子点和树突结构的发光染料。例如，共轭聚合物上的各重复单元均可被认为是起作用的发色团，量子点由许多原子组成，饱和聚合物可被功能化，从而在侧链上具有多个发光染料分子，树枝状聚合物则可以被合成，从而含有多个共价键合的各个发色团。附着在固体支持物，如聚合物珠或表面上的发色团集合也可被用于获取光。获取光的多发色团系统可有效地将能量转移至邻近的发光部分(如“信号传递发色团”)。能量转移机制包括，例如共振能转移(FSrster (或荧光)共振能转移，fret)、量子电荷交换(Dexter能量转移)等。不过，典型地，上述能量转移机制的范围相对窄；即需要获取光的多发色团系统与信号传递发色团邻近，才可有效转移能量。在能量有效转移的条件下，当获取光的多发色团系统中的各个发色团数量大时，便可出现信号传递发色团发射的放大；即当入射光(“泵光”)的波长可被获取光的多发色团系统吸收时，信号传递发色团的发射比该泵光直接激发信号传递发色团时的发射更为强烈。共轭聚合物(CP)的特征在于非域化电子结构，并可针对化学和生物学目的被用作高度应答光学报道分子。19’2°由于有效共轭长度基本上短于该聚合物链的长度，主链包含了大量邻近的共轭片段。因此，共轭聚合物可有效获取光并可经由FSrster能量转移机制实现光学放大。21水溶性CP在带相反电荷受体的存在情况下显示出异常的荧光猝灭功效，这对生物学识别活动的转导而言具有特殊的益处。22’23阳离子聚电解质与DNA之间的自发聚合物间复合已得到描述，且该复合在很大程度上是静电力协同的结果。24’25’26芳族聚合物单位与DNA碱基之间的疏水相互作用最近也获得了公认。27’28聚电解质/DNA相互作用的自由能受参与部分的结构，以及溶液变量，诸如pH、离子强度和温度的控制。29上述相互作用的强度和特异性最近已被调整用于识别质粒DNA的三级结构。3°本发明中所用的多发色团为聚阳离子，因此它们可通过静电途径与目标多核苷酸相互作用，并通过传感PNA与目标多核苷酸之间的杂交，将无电荷传感PNA上的信号传递发色团带入能量接收近程。任何可吸收光并将能量转移至传感PNA上的信号传递发色团的聚阳离子多发色团均可应用在本文所描述的方法中。可采用的多发色团实例包括共轭聚合物(包括寡聚体)、饱和聚合物或以任一可行方式掺入了多个发色团而形成的树枝状聚合物，和半导体纳米晶体(SCNC)。可制备共轭聚合物、饱和聚合物和树枝状聚合物，使其掺入多个阳离子部分，或者将其衍生化，在合成后赋予其聚阳离子；半导体纳米晶体可通过在其表面加入阳离子部分从而获得聚阳离子。一种优选实施方案中，采用共轭聚合物作为聚阳离子多发色团。一种特定实例如结构I所示，其中阳离子水溶性共轭聚合物为具有碘化物反阴离子的聚(9，9_双(6’-N，N，N-三甲铵)-己基)-芴亚苯基)(下文将其表示为聚合物I)。23该聚合物的具体尺寸不重要，只要其能够吸收光并将能量转移给被带至近程的信号传递发色团即可。“n”的典型数值落在2-大约100，000的范围内。其具体分子结构不重要；任何具有相对高发光量子功效的水溶性阳离子共轭聚合物均可被采用。
权利要求
1.一种测定方法，包括 提供被怀疑含有目标多核苷酸的样品； 提供可与目标多核苷酸发生静电相互作用，并在激发可将能量转移至信号传递传递发色团的聚阳离子多发色团； 提供单链形式并与目标多核苷酸互补的传感肽核酸(PM)，该传感PNA与信号传递发色团缀合； 使样品在特定条件下与溶液中的传感PNA和多发色团接触，其中在上述条件下，如果存在目标多核苷酸，传感PNA可与其杂交； 向上述溶液施加可激发多发色团的光源；并 检测是否由信号传递发色团发射光。
2.权利要求I的方法，其中多发色团包括选自饱和聚合物、共轭聚合物、树枝状聚合物和半导体纳米晶体的结构。
3.权利要求2的方法，其中多发色团包括饱和聚合物。
4.权利要求2的方法，其中多发色团包括树枝状聚合物。
5.权利要求2的方法，其中多发色团包括半导体纳米晶体。
6.权利要求2的方法，其中多发色团包括共轭聚合物。
7.权利要求6的方法，其中共轭聚合物具有如下结构
8.权利要求6的方法，其中共轭聚合物具有如下结构
9.权利要求I的方法，其中样品与配比大约为I: I的传感PNA和多发色团接触。
10.权利要求I的方法，其中样品在足量有机溶剂的存在条件下，与传感PNA和多发色团接触，上述有机溶剂的量足以降低传感PNA与多发色团之间的疏水相互作用。
11.权利要求I的方法，其中样品与具有相应不同序列的多种不同传感PNA接触，该不同传感PNA包含相应的不同信号传递发色团，其中上述不同传感PNA中的每一个均可与相应的不同目标多核苷酸选择性地杂交。
12.权利要求I的方法，其中发色团为荧光团。
13.权利要求12的方法，其中荧光团选自半导体纳米晶体、荧光染料和镧系金属螯合物。
14.权利要求13的方法，其中荧光团为半导体纳米晶体。
15.权利要求13的方法，其中荧光团为荧光染料。
16.权利要求15的方法，其中荧光染料为荧光素。
17.权利要求13的方法，其中荧光团为镧系金属螯合物。
18.权利要求I的方法，其中目标多核苷酸为DNA。
19.权利要求I的方法，其中目标多核苷酸为RNA。
20.权利要求I的方法，其中样品包含单链目标多核苷酸。
21.权利要求I的方法，其中样品包含双链目标多核苷酸。
22.权利要求I的方法，其中目标多核苷酸是通过扩增反应而得以制备的。
23.—种多核苷酸感测液,包含 一种单链形式，并与目标多核苷酸互补的传感肽核酸(PNA),该传感PNA与信号传递发色团结合； 一种聚阳离子多发色团，可与目标多核苷酸的磷酸主链发生静电相互作用，且当其在传感PNA与目标多核苷酸杂交时被带入近程时，可在激发时将能量转移至信号传递发色团。
24.一种用于测定样品中的目标多核苷酸的试剂盒，包括 一种单链形式，并与目标多核苷酸互补的传感肽核酸(PNA),该传感PNA与信号传递发色团结合；和 一种聚阳离子多发色团，可与目标多核苷酸的磷酸主链发生静电相互作用，且当其在传感PNA与目标多核苷酸杂交时被带入近程时，可在激发时将能量转移至信号传递发色团。
25.权利要求I的方法，其中由信号传递发色团发射的超过阈值水平的光，说明样品中存在目标多核苷酸。
26.权利要求I的方法，其中由信号传递发色团发射的光被定量，并用于测定样品中目标多核苷酸的量。
27.权利要求12的方法，其中荧光团为绿色荧光蛋白。
28.权利要求I的方法，其中目标多核苷酸未被扩增。
29.权利要求I的方法，其中该方法在基质上进行。
30.权利要求29的方法，其中基质与多种不同的传感PNA缀合。
全文摘要
本本发明涉及利用获取光的多发色团检测和分析多核苷酸的方法和组合物。使被怀疑含有目标多核苷酸的样品与聚阳离子多发色团和互补于目标多核苷酸的传感PNA接触。该传感PNA包含信号传递发色团，可吸收来源自受激发多发色团的能量，并在目标多核苷酸的存在条件下发射光。本发明方法可以多路形式应用。本发明也提供了包含可实现上述方法的试剂的试剂盒。
文档编号G01N33/543GK102766695SQ201210282729
公开日2012年11月7日 申请日期2003年6月20日 优先权日2002年6月20日
发明者B.S.盖洛德, G.C.巴赞 申请人:加州大学评议会
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