纤维结合蛋白检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纤维结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2，所述试剂R1为含有抗人类风湿因子抗体和促凝剂的缓冲液；所述试剂R2为含有标记抗人纤维结合蛋白抗体的胶乳颗粒的缓冲液；所述抗人类风湿因子抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，为兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体或单克隆抗体；本发明纤维结合蛋白检测试剂盒可以同时满足灵敏度高和自动化快速批量检测的要求，抗干扰能力强，稳定性高，且抗体的用量小，降低了成本。
【专利说明】纤维结合蛋白检测试剂盒
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药【技术领域】，具体地说涉及一种纤维结合蛋白检测试剂盒。
【背景技术】
[0002] 纤维结合蛋白又称纤维连接蛋白（简称纤连蛋白）、粘连蛋白、纤粘蛋白，英文名 fibronectin，英文缩写Fn。纤维结合蛋白是一种高分子量糖蛋白，含糖4. 5% - 9. 5%，其 单体相对分子质量为22万一 25万。各亚单位在C端形成二硫键交联。血浆纤连蛋白多是 二聚体，由两条相似的A链及B链组成，整个分子呈V形。细胞中纤连蛋白以多聚体为主， 成纤维细胞中尤甚。纤维结合蛋白有可溶性与不溶性两种形式。血浆中纤维结合蛋白为可 溶性的，电泳时移动于α2或快β区。主要由肝细胞、内皮细胞和巨噬细胞合成。不溶性 的纤维结合蛋白广泛存在于结缔组织、组织基质、血管基质和细胞表面，与可溶性纤维结合 蛋白的分子结构、抗原特性等基本相同。
[0003] 纤维结合蛋白的功能非常复杂，主要功能是介导细胞粘着。纯化的纤连蛋白可增 强细胞间粘连及细胞与基质的粘连。通过粘着，纤连蛋白可以通过细胞信号转导途径调节 细胞的形状和细胞骨架的组织，促进细胞铺展。在胚胎发生过程中，纤连蛋白对于许多类型 细胞的迀移和分化是必需的；目前已知纤维结合蛋白与细胞之间的粘附、细胞的迀移和趋 化有关，因而在对抗炎症、组织修复和创伤愈合方面发挥作用。纤维结合蛋白有很强的促进 单核巨噬细胞吞噬功能的作用，具有非特异性的调理素活性，在抗感染、清除免疫复合物、 促使肿瘤基因转化等方面都有重要意义。纤维结合蛋白存在于血小板的α颗粒中，凝血酶 和胶原可使血小板释放纤维结合蛋白，并分泌到血小板表面。在血凝块形成过程中，纤连蛋 白促进血小板附着于血管受损部位。在血管内皮损伤、胶原暴露时，Fn可以调整纤维蛋白 与胶原之间的关系，加速清除纤维蛋白及其降解产物，维护凝血纤溶的动态平衡，具有抗血 栓作用。
[0004] 正常人血浆纤维结合蛋白PFn含量300?400mg/L (0. 3?0. 4g/L)，血清含量约为 血浆含量的67%，一般为180?280mg/L，是因为血凝过程中纤维结合蛋白与纤维蛋白结合 之故。纤维结合蛋白含量变化与临床多种疾病的严重程度和转归密切相关。血清纤维结合 蛋白降低见于多种严重疾�。宋岷系鞍壮中椭嫡咛崾驹ず蟛涣迹宋岷系鞍谆厣� 者提示预后较好。传染性肝炎患者纤维结合蛋白值的变化与疾病的病期有关，活动期纤维 结合蛋白含量下降，在急性肝炎、重症肝炎，失代偿性肝硬化、肝癌尤其是广泛性肝转移者， 纤维结合蛋白含量显著降低。纤维结合蛋白值作为评价营养状态的指标优于白蛋白、前白 蛋白、转铁蛋白等的测定。测定胸腹水中纤维结合蛋白含量对鉴别渗出液和漏出液较有意 义，结核、结缔组织疾病患者胸水纤维结合蛋白含量明显高于肿瘤患者。肿瘤性积液纤维结 合蛋白含量又高于其他传染性和非特异性积液。类风湿性关节炎时，血浆纤维结合蛋白可 正常，但病变关节液中纤维结合蛋白含量常数倍于血浆浓度。
[0005] 目前临床上广泛使用的纤维结合蛋白检测方法是ELISA法和普通免疫比浊法。 ELISA法灵敏度较高，但存在其操作复杂，检测时间长等缺点。普通免疫比浊法检测方法由 于采用多克隆抗体直接比浊，可配合自动生化仪检测，检测速度快，操作方便，但存在抗体 用量大，成本高，而且灵敏度较低的问题。而现有的纤维连接蛋白测定试剂盒，多为单一试 剂，存在灵敏度低，试剂不稳定，抗类风湿因子干扰能力差等问题。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的问题是针对现有技术的不足，提供一种具有高灵敏度，抗干扰 能力强、稳定性好的纤维结合蛋白检测试剂盒。
[0007] 本发明所采用的技术方案为：一种纤维结合蛋白检测试剂盒，包括试剂Rl和试剂 R2,其特征在于：所述试剂Rl为含有抗人类风湿因子抗体和促凝剂的缓冲液；所述试剂R2 为含有标记抗人纤维结合蛋白抗体的胶乳颗粒的缓冲液。
[0008] 所述抗人类风湿因子抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，为兔抗人多克 隆抗体或羊抗人多克隆抗体或单克隆抗体。
[0009] 作为优�。隹谷讼宋岷系鞍卓固迨呛泄δ懿课坏耐暾固寤蚩固迤危� 为兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗体或单克隆抗体中的一种。
[0010] 所述促凝剂为聚乙二醇（PEG)，聚乙烯吡咯烷酮（PVP)中的一种或两种。
[0011] 所述胶乳颗粒为60?400nm的聚苯乙烯颗粒，优选100?200nm。
[0012] 作为优�。昙强谷讼宋岷系鞍卓固宓慕喝榭帕Ｔ谑约罵2中的含量为0. 5? 5g/L，优选 1 ?3g/L。
[0013] 作为优�。鍪约罵l组成为：所述试剂Rl组成为：50?200mmol/LTris-HCl 缓冲液，〇?30g/L聚乙二醇（PEG)，5?30g/L氯化钠，0. 5?lg/L叠氮化钠，0. 1?lg/L 抗人类风湿因子抗体。
[0014] 本发明试剂盒的反应原理是：
[0015] 先将含有抗人类风湿因子抗体、促凝剂及缓冲液的试剂Rl与样本混合，使样本中 的类风湿因子抗原与试剂Rl中的抗人类风湿因子抗体结合成抗原抗体复合物并凝集成大 颗粒，将类风湿因子抗原清除。再将含有包被了高特异性的抗人纤维结合蛋白抗体的胶乳 颗粒及缓冲液的试剂R2与上述样本-试剂Rl混合液中相应的纤维结合蛋白抗原发生特异 性结合，在促凝剂的作用下，形成不溶性的以（抗原-抗体-胶乳颗粒-抗体）为聚合单位 的聚合度不等的复合物，产生一定的浊度，其浊度高低与样本中的纤维结合蛋白抗原浓度 成正比关系，在一定波长下进行浊度测定，即可测得样本中被检测纤维结合蛋白的含量。
[0016] 本发明中，选取的检测波长为340?800nm，优选540?600nm。
[0017] 采用本发明所述的试剂盒测定血清或血浆中纤维结合蛋白时，先将样本与试剂Rl 混匀后孵育3-5分钟，然后加入试剂R2,搅拌均匀后，立即读取第一点吸光度值（Al)，计时 反应5分钟后，读取第二点吸光度值（A2)，计算两点吸光度差值，根据校准曲线得到样本中 纤维结合蛋白的含量。
[0018] 本发明采用5点定标法，以样条函数或logit-log(4p)作为计算模式，绘制出校准 曲线。
[0019] 本发明所述的试剂盒，用于测定人血清或血浆中纤维结合蛋白，与现有技术相比， 本发明具有以下优点：采用了多克隆抗体致敏的胶乳增强免疫比浊检测方法，可以同时满 足灵敏度高和自动化快速批量检测的要求，抗干扰能力强，，稳定性高，且抗体的用量�。� 低了成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0020] 图1 :本发明纤维结合蛋白检测试剂盒检测血清纤维结合蛋白线性范围。
[0021] 图2 :本发明纤维结合蛋白检测试剂盒检测血清纤维结合蛋白与用于检测血清中 纤维结合蛋白的现有进口试剂盒相关性。
【具体实施方式】
[0022] 下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实 施例。
[0023] 实施例1
[0024] 纤维结合蛋白检测试剂盒的制备：
[0025] 试剂Rl:200mmol/LTris-HCl缓冲液，20g/L聚乙二醇（PEG)，20g/L氯化钠，lg/L 叠氮化钠，〇. 5g/L抗人类风湿因子抗体。
[0026] 试剂R2 :标记有抗人纤维结合蛋白多克隆抗体的胶乳颗粒的制备：将粒径为 IOOnm的胶乳颗粒，用50mmol/LMES，pH6. 0缓冲液稀释胶乳颗粒到3g/L，每ml溶液中加入 EDACO. 5mg，室温反应1小时，20000rpm转速下离心30min，去上清，将沉淀悬浮于50mmol/L MES，pH6. 0缓冲液中，超声分散；再次20000rpm转速下离心30min，去上清，将沉淀悬浮于 50mmol/LMES，pH6. 0缓冲液中，使得胶乳颗粒终浓度为6g/L，超声分散，边搅拌边加入等体 积的含8mg/ml抗人纤维结合蛋白抗体的MES稀释液，混合搅拌，室温反应2小时，胶乳颗粒 终浓度为3g/L。20000rpm转速离心30min，去上清，沉淀悬浮于50mmol/LMES，pH6. 0缓冲 液中，胶乳颗粒终浓度为3g/L，超声分散，加入BSA使得BSA最终浓度达到20g/L，4°C封闭 过夜。离心去上清，用含50mmol/LTris，pH7. 5缓冲液、10g/LBSA、20g/L鹿糖、lg/L叠氮 化钠的分散液溶解胶乳颗粒，使胶乳颗粒终浓度为3g/L，超声分散。
[0027] 实施例2
[0028] 人血清样本中纤维结合蛋白的测定：
[0029] 测定仪器：日立7060全自动生化分析仪；
[0030] 分析方法：两点终点法；
[0031] 分析参数：Rl:240ul，R2:60ul，样本：3ul;波长：546nm;
[0032] 测定步骤：先加入试剂Rl和样本，于37°C孵育5分钟后，加入试剂R2,立即读取第 一点吸光度值，计时反应5分钟后，读取第二点吸光度值，计算两点吸光度差值。
[0033] 定标曲线制作：以定标液浓度为横坐标，各浓度定标液对应的吸光度差值为纵坐 标，做l〇git-log(4p)函数曲线。
[0034] 样本浓度计算方法：根据样本的吸光度值差值，代入定标曲线，计算相对应的浓度 值。
[0035] 实施例3
[0036] 试剂盒性能试验：
[0037] (1)灵敏度试验
[0038] 以水为空白样本，选取一份低值血清样本进行倍比稀释，配制出不同浓度（0、5、 10、20、40mg/L)的样本，每个样本重复测定10次，计算均值和标准差，结果见表1，从表1可 见，本发明试剂盒的对血清纤维结合蛋白的检测灵敏度为5mg/L。
[0039]表 1 [00401
【权利要求】
1. 一种纤维结合蛋白检测试剂盒，包括试剂R1和试剂R2,其特征在于：所述试剂R1为 含有抗人类风湿因子抗体和促凝剂的缓冲液；所述试剂R2为含有标记抗人纤维结合蛋白 抗体的胶乳颗粒的缓冲液。
2. 根据权利要求1所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述抗人类风湿因 子抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，为兔抗人多克隆抗体或羊抗人多克隆抗体 或单克隆抗体。
3. 根据权利要求1所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述抗人纤维结合 蛋白抗体是含有功能部位的完整抗体或抗体片段，为兔抗人多克隆抗体、羊抗人多克隆抗 体或单克隆抗体中的一种。
4. 根据权利要求1所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述促凝剂为聚乙 二醇（PEG)，聚乙烯吡咯烷酮（PVP)中的一种或两种。
5. 根据权利要求1所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述胶乳颗粒为 60?400nm的聚苯乙稀颗粒。
6. 根据权利要求5所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述胶乳颗粒为 100?200nm的聚苯乙烯颗粒。
7. 根据权利要求1所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：标记抗人纤维结合 蛋白抗体的胶乳颗粒在试剂R2中的含量为0. 5?5g/L。
8. 根据权利要求7所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：标记抗人纤维结合 蛋白抗体的胶乳颗粒在试剂R2中的含量为1?3g/L。
9. 根据权利要求1所述的纤维结合蛋白检测试剂盒，其特征在于：所述试剂R1组成 为：50 ?200mmol/L Tris-HCl 缓冲液，0 ?30g/L 聚乙二醇（PEG)，5 ?30g/L 氯化钠，0? 5 ? lg/L叠氮化钠，0. 1?lg/L抗人类风湿因子抗体。
【文档编号】G01N33/53GK104483475SQ201410803868
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】邹炳德, 邹继华, 方亮, 刘献文 申请人:宁波美康生物科技股份有限公司
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