专利名称：一种检测猪流产嗜性衣原体抗体的elisa试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物传染病检测领域，具体的是涉及一种检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒。技术背景
衣原体是一类专性细胞内寄生的，大小介于细菌和病毒之间的革兰氏阴性微生物，能在鸡胚和易感脊椎动物的细胞内生长繁殖，具有独特的双阶段发育周期。衣原体感染在世界范围内广为流行，是一种能够引物人和动物患病的人畜共患病原体。依据衣原体核糖体rRNA的序列比对以及多形态限制性酶切位点的分析，将衣原体科分为衣原体属和嗜性衣原体属。衣原体属包含沙眼衣原体、猪衣原体和鼠衣原体；嗜性衣原体属包含鹦鹉热嗜性衣原体、流产嗜性衣原体、肺炎嗜性衣原体、家畜嗜性衣原体、猫嗜性衣原体以及豚鼠嗜性衣原体。
衣原体具有广泛的宿主，家畜中羊、牛、猪以及各种家禽均可感染发病。猪感染衣原体后，临床症状主要表现为妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎、产弱仔等；各年龄段猪表现为肺炎、肠炎、多发性关节炎、心包炎以及结膜炎等；公猪感染后主要发生睾丸炎、附睾炎以及尿道炎等。
1955年，美国人winigan等首先发现衣原体对猪具有致病性，他们从患心包炎病猪病料分离出了衣原体。罗马尼亚学者Sorodok等1959年和1965年分别报道了猪群感染衣原体，发生肺炎，大批母猪流产及新生仔猪死亡的病例。此后，英国、前苏联、德国和日本也陆续报道表现不同症状的猪衣原体病。我国从80年代开始关注和研究猪衣原体病。杨宜生等在国内首先报道猪衣原体�。谴恿鞑钢砗投喾⑿怨亟谘鬃兄淼牟×现蟹直鸱掷氤鲆略�。90年代后，猪衣原体感染呈上升趋势，我国各省均有衣原体感染猪导致流产、 死胎等的报道，而且衣原体血清学调查报告显示各省规模化猪场中衣原体血清学检测结果阳性率普遍较高。邱昌庆等O000)对河北省衡水地区某规模化猪场的猪衣原体病进行检测，阳性率达35%。高双娣等报道甘肃省猪衣原体病的流行情况，对甘肃省7个市 (地)的部分猪场猪群用间接血凝试验进行衣原体血清抗体检测，共检测468份猪血清，总阳性率达34. 496，个别地区的阳性率高达67%。白挨泉等Q004)对广东部分地区猪衣原体病的血清学做了调查，10个猪场的阳性率为14. 3%-94. 1%。王海志Q004)对辽宁铁岭市6 个规模较大的养猪场的猪衣原体病进行了调查，平均阳性率达5. 16%。索绪峰等Q005)对海南省部分市县13个猪场的972份血清用间接血凝试验进行猪衣原体病抗体检测，结果显示猪场整体抗体阳性率为49. 596，其中母猪群抗体阳性率为53. 66%。陆文俊(2006)对广西部分地市猪场衣原体病调查，结果显示平均阳性率为20. 77%。近些年来，各省家畜疫病普查表明，猪衣原体病在我国大部分地区都有流行，而且阳性感染率呈现增高趋势。分析原因主要是对衣原体对养猪业的�：θ鲜恫还唬揽匾馐恫磺�。同时，随着规模化养猪场的快速发展，针对衣原体病的诊断没有很好的方法可以应用。
众多研究者对牛的衣原体病和禽类的衣原体病关注较多，而对猪的衣原体病研究3较少。传统的猪衣原体病检测方法主要有细胞培养法、血凝实验以及酶联免疫吸附试验等， 而这些实验方法都不同程度的存在缺陷。细胞培养法操作繁琐、周期长等；血凝实验的敏感度低；而已有的酶联免疫吸附实验中所用包被抗原均为全病原，这对具有种间特异性的衣原体诊断并不适合，而且存在容易造成病原扩散的潜在危险性。现在普遍应用的PCR检测技术对实验条件要求较高，目前尚难以普及。因此，开发一种简便、高效、廉价的猪衣原体抗体检测试剂盒无论对于科学研究亦或是临床检测猪衣原体病的流行状况等都有重要的意义。
衣原体的外膜蛋白主要包括40kDa的主要外膜蛋白(Μ0ΜΡ)、富含半胱氨酸的 60kDa的大蛋白和12kDa的小蛋白等组成。40kDa的衣原体主要外膜蛋白(MOMP)占衣原体外膜蛋白的60%以上，具有血清型、亚种、种和属特异性抗原决定簇，大量实验研究表明该蛋白是衣原体的主要保护性抗原。在牛的衣原体病及禽类的衣原体病检测方面或者是亚单位疫苗的研制中，MOMP均作为目的抗原而被大量研究。但是衣原体的MOMP蛋白具有种属特异性，这些实验方法在检测猪的衣原体病方面存在局限性。迄今为止，尚未有推广应用的用于检测猪衣原体病的方法报道。发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术而提供一种快速、准确检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，可供科学研究使用以及临床对猪衣原体病的监测及诊断等临床应用。
本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案是一种检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有抗原包被的酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、羊抗猪酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液A、底物缓冲液B和终止液，其中抗原包被的酶标板上包被有重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP。
按上述方案，所述的重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP的包被浓度为0. 97 μ g/mL。
按上述方案，所述的阳性对照血清和阴性对照血清使用时与样品稀释液的稀释比均为1:50，所述的羊抗猪酶标二抗使用时与样品稀释液的稀释比为1:5000。
按上述方案，所述的重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP的制备方法是1)以临床分离的猪源衣原体为病原株，提取病原株的总DNA为模板，经特异性引物进行PCR扩增得到主要外膜蛋白MOMP全基因片段，对其核苷酸序列进行测定并分析预测其信号肽位点及抗原表位分布，依据上述分析测定结果，利用主要外膜蛋白MOMP全序列上天然存在的ife // I位点，选取主要外膜蛋白MOMP上无信号肽、抗原性强、而且抗原表位均位于其表面的部分片段；2)将主要外膜蛋白MOMP截取部分的片段与pET-28a连接并转入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，提取质粒，经PCR及酶切鉴定，测序，筛选出正确连接的阳性克�。竦弥刈橹柿� pET-28a-M0MP ；将此重组质粒pET48a-M0MP转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，经诱导表达、镍离子亲和层析纯化得到得到重组猪流产嗜性衣原体主要外膜蛋白rMOMP。
按上述方案，所述的特异性引物为 上游 Pl -.ttaggaiccATGAAAAAACTCTTGAAATCG ； 下游 P2 :gcg§"ic^acTTAGAATCTGAATTGAGC。
本发明的优点在于1)本发明填补了猪衣原体病临床诊断中检测方法的空白，已有的诊断家畜衣原体病的 ELISA检测试剂盒都是从牛或者禽类分离的病原株进行实验设计，对其病原株的主要外膜蛋白MOMP进行原核表达得到的蛋白抗原，而衣原体对宿主具有选择性和依赖性，因此，这些检测试剂盒对猪衣原体的检测灵敏度不高，本发明则已从临床发病的猪源分离到的病原衣原体进行实验设计；2)本发明所用于包被的蛋白抗原，是经分子生物学软件预测及实验分析后对主要外膜蛋白MOMP全基因序列进行选择性的克隆表达，实验设计中将主要外膜蛋白MOMP基因序列中的信号肽部分以及无抗原性的部分切去，只对抗原性较强而且位于外膜表面的部分进行克隆表达；3)本发明中原核表达产生的蛋白包涵体溶解后，除去了影响抗原抗体特异性反应的杂蛋白；4)本发明中原核表达产生的蛋白采用镍离子亲和层析住纯化后的蛋白经透析复性，蛋白构象得以恢复自然状态，免疫学活性较好；5)本发明的生产过程安全性高，不存在有害微生物扩散的危险。而且采用原核表达制备蛋白抗原已有成熟的发酵罐规模化生产技术，生产成本低，质量容易保证，适于科研应用及临床推广。
图1为以提取的衣原体基因组为模板，P1、P2为引物，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果；其中，1、Mark DL2000 ；2、衣原体主要外膜蛋白MOMP PCR产物；图2为MOMP表面抗原位点分析结果； 图3为MOMP全基因序列信号肽预测结果；图4为蛋白表达及纯化结果SDS-PAGE检测结果；其中，1、蛋白质Marker ；2、3、pET_28a 诱导前后；4、5重组M0MP-pET-28a诱导前后；6、包涵体上清；7、8、9、三个不同咪唑浓度洗脱液；10、浓缩后的重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP ；图5为纯化后的蛋白Western-blot检测结果，1、与阳性血清反应结果；2、4、蛋白质 Marker ；3、与阴性血清反应结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，可以理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明要求保护的范围。
实施例1 1)M0MP基因扩增以临床分离的猪源衣原体为病原株接种SPF鸡胚，收集72h以后规律死亡的鸡胚卵黄囊液。以此为原料使用Biospin Bacteria Genomic DNA Extraction Kit商品化的试剂盒提取提取分离衣原体的基因组，也就是总DNA模板取适量卵黄囊液于1. 5mL离心管中， 3000r/min离心lOmin，取上清，再15000r/min离心30min，弃沉淀，按照试剂盒操作步骤提取基因组。
根据Genbank中衣原体主要外膜蛋白MOMP全基因序列设计两条特异性引物 上游 Pl -.ttaggaiccATGAAAAAACTCTTGAAATCG (斜体部分为及I 酶切位点) 下游 Ρ2 :gcg§"ic^acTTAGAATCTGAATTGAGC (斜体部分为 5 / I 酶切位点)上下游引物使用的限制性内切酶分别是及 // I和5 / I，引物由上海生工生物技术服务有限公司合成。以提取的衣原体全基因组为模板，特异性的引物P1、P2为引物进行PCR反应(图1，PCR产物1200bp左右)。反应体系=PCR MIX 25ul，上下游引物P1、P2各0. 5ul，模板 4ul，加 ddH20 20ul 至总体积 50ul ；反应程序为 94°C 2min，94°C 15s，58°C 30s, 72°C lmin, 30个循环，72°C 10min，4°C池。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定有无目的条带。采用 Axyft·印凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收，得到主要外膜蛋白MOMP全基因片段，并送上海生工生物技术服务有限公司测序； 2)构建重组质粒pETj8a-M0MP使用DNAstar、SignalP 3.0 krver等软件对测序结果进行分析，依据分析结果(图2， 从图中可看出第20-90位氨基酸残基之间的区段虽然抗原性位点较强但是其可能不是表面抗原位点，而在100位、240位以及345位氨基酸残基处抗原性较强，而且均可能为表面抗原位点；图3，全部391个氨基酸残基中最有可能为信号肽的是前22个氨基酸残基)，利用衣原体主要外膜蛋白MOMP全序列上天然存在的及 /7 I位点，选取主要外膜蛋白MOMP上无信号肽、抗原性强、而且抗原表位均位于蛋白表面的部分片段(271bp-1176bp)构建重组质粒 pET-28a-M0MP。
職BamH I和5 / I对PCR回收产物及质粒pET48a进行双酶切。反应体系PCR 产物酶切 IOXT Buffer BamH 1 2ul,5a7 1 2ul，PCR 产物 8ul，加 ddH20 22ul 至总体积 40ul ；质粒酶切 IOXT Buffer 15ul, BamH 1 4ul, Sal 1 4ul，质粒 20ul，加 ddH20 57ul 至总体积 100ul，37°C水浴 4h。使用 DNA Fragment Purification Kit Ver. 2. 0 对酶切产物进行回收。
经琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切正确后，采用DNA Fragment Purification Kit Ver. 2. 0 DNA片段试剂盒对酶切产物进行回收。将带有黏性末端的酶切产物使用T4DNA连接酶反应体系连接，连接产物(含ρΕΤ48ει-Μ0ΜΡ重组质粒)转化大肠杆菌DH5 α感受态细胞。转化具体步骤详见《分子克隆实验指南》(第三版，96-99)。筛选出阳性克隆后，小量摇菌，使用Ε. Ζ. N. A. Plasmid Mimi Kit 1试剂盒从菌液提取质粒。提取的质粒经PCR及酶切鉴定，以确定目的片段正确克隆入载体，同时将提取的质粒送上海生工测序。测序结果显示目的片段正确插入质粒pET48a，获得正确的重组质粒ρΕΤ48ει-Μ0ΜΡ。
3)目的蛋白原核表达步骤2)中构建好的重组质粒pETj8a-M0MP转化表达载体五coli BL21 (ED3)。转化具体步骤详见《分子克隆实验指南》(第三版，1228-1232)。筛选出的阳性菌落小量摇菌， 5mlLB/瓶，37度摇床他；4°C过夜；按1 100体积比接种400mlLB大量摇菌，3h后加诱导剂 IPTG至终浓度IMm/L，继续37°C摇床4h ；富集菌体，8000r，5min，于两个50mlEP管中；每管加BufferA20ml，重悬；超声破碎菌体，3min/次，间隔3min，破碎10次左右；破碎完全后 12000r/min, IOmin ；上清为包涵体上清，留样待检，包涵体沉淀加BufferA洗涤两次。
4)目的蛋白纯化步骤3)中制备的包涵体沉淀使用镍离子亲和层析法进行纯化，除去杂蛋白。具体操作方法每管包涵体沉淀各加20ml镍柱亲合层析平衡缓冲液(含8M/L尿素)，4°C过夜；镍离子亲和层析填料用平衡缓冲液洗涤两次，500g/min，5min ；将玻璃柱固定在铁架台上，加 IOml平衡缓冲液润洗玻璃柱；加洗涤完成的填料，使其自然沉降；4°C过夜的包涵体溶液 12000r/min, 5min,弃沉淀，用IOml —次性注射器将包涵体溶液缓慢加入到玻璃柱中，作用 30min ；松开止血钳，收集穿流液；蛋白加完后，加40ml平衡缓冲液，洗去未结合的杂蛋白； 依次用含100mM/L、200 mM/L、300 mM/L咪唑洗脱目的蛋白；洗脱完成后，洗脱液中加终浓度为0. 2%的聚乙二醇4000 (PEG4000)，1. OmM/L的氧化型谷胱甘肽及2. OmM/L的还原型谷胱甘肽，4°C过夜；PBS透析6h/次，3次；透析完成后使用蔗糖浓缩蛋白洗脱液；收集蛋白， 1. 5mlEP管分装，-70保存。
5 )蛋白表达及纯化结果SDS-PAGE检测步骤3-4)中诱导表达和纯化过程中的蛋白样品，双蒸水以及SDS-PAGE上样缓冲液按照1 5 4的比例配制成200ul样品，沸水中煮沸IOmin制成电泳样品；SDS-PAGE分离胶和浓缩胶配制过程及胶架的安装过程详见《分子克隆实验指南》(第三版，1713-1720);待胶块凝固后，加甘氨酸缓冲液，取制备好的蛋白样品上样，电泳，80V至分离胶时调高电压至120V 至电泳完成；取出胶块剥离上面浓缩胶层，考马斯亮蓝染色4h ；用脱色液进行脱色4h ；组后观察蛋白表达及纯化过程中蛋白情况，照相(图4，诱导后在预计分子量大小的地方有明显的蛋白表达条带，经纯化后，杂蛋白基本被去除)。
6) Western-blot 检测蛋白活性按照步骤5)中步骤SDS-PAGE电泳；电泳结束后取出胶块进行ffestern-blot，具体方法转膜，将两个蛋白泳道与各自相邻的Marker切下来，用尺子量出大�。眉舫鐾拇笮�6层重叠的滤纸；再裁剪出比之大约3-4mm的NC膜；将3层滤纸用转移液浸透后放在电转板上，将胶块放上，再加上NC膜，最后再加上剩余的3张滤纸，压平，盖好电转仪的盖子； 接通电压，80mA，45min ；转移结束后进行封闭，将NC膜放入加有封闭液的平皿中，振荡池； 加标准猪衣原体阳性血清和阴性血清，各1:50稀释加样，4°C过夜；TBST洗涤三遍，加二抗 HRP标记的羊抗猪IgG，37°C温育Ih ；TBST洗涤三遍，加DAB显色液显色；最后用蒸馏水洗涤三遍，观察结果，照相(图5，仅与衣原体阳性血清发生显色，表明重组衣原体主要外膜蛋白 rMOMP有良好的免疫反应原性)。
7)标准阴阳性血清制备临床分离的病原接种鸡胚后，收集7 后无细菌感染死亡的鸡胚，收集卵黄囊液经甲醛灭活后制成油乳剂灭活苗。用此疫苗免疫30日龄的健康长白猪，最后采集血清，检测效价。标准阳性血清效价在1:800左后。
标准阴性血清采自健康的经检测无衣原体感染的健康猪。
实施例2建立ELISA检测方法 1试剂配制包被液(PH9. 6碳酸盐缓冲液)=Na2CO3 1. 59g，NaHCO3 2. 93g，加双蒸水补齐至1000ml, 调PH至9. 6。
洗涤液(含0.05%的了界6611-20的卩85):妝(18. 0g, KCl 0. 2g, Na2HP03*12H20 2. 9g, KH2PO4 0. 2g, Tween-20 0. 5ml，加双蒸水补齐至 1000ml，调 pH 至 7. 4。
样品稀释液0. IgBSA溶于100ml洗涤液。
封闭液IgBSA溶于IOOml洗涤液。
底物缓冲液A =Na2HPO4 14.6g、柠檬酸9. 33g、过氧化氢脲0. 52g，加双蒸水 CddH2O)定容至IOOOmL,调节pH至5. 0-5. 4，无菌分装，IOmL/瓶。
底物缓冲液B 四甲基联苯胺(TMB)20mg、无水乙醇10mL，加双蒸水(ddH20)定容至 1 OOOmL，无菌分装，IOmL/瓶。
终止液氢氟酸(40%) 625 4 1^，加双蒸水((1(^20)定容至IOOmL,无菌分装，IOmL/瓶。
2蛋白最佳包被浓度和血清最佳稀释度选择方阵滴定法将步骤4)中纯化得到的重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP用包被液倍比稀释包被8个浓度，第一行从1:25开始，IOOul/孔；4°C过夜后，洗涤3次，每次^iin ；每孔加封闭液200ul，37°C温育Ih ；洗涤3次，每次;3min;将阴阳性血清分别从1:50稀释开始，横向倍比稀释，8个浓度滴度，IOOul/孔，37°C温育Ih ；洗涤3次，每次;3min ；加SoutherBiotech 公司HRP标记的羊抗猪1 5000稀释液，IOOul/孔，37°C温育Ih ；洗涤3次，每次3min ；加底物缓冲液A和B，各一滴，Smin后加终止液，酶标仪测OD63tl。检测结果如表1所示。从表1 和表2数据可判定蛋白稀释160倍(0. 97 μ g/mL)，血清稀释50倍时，P/N值最大。
权利要求
1.一种检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于该试剂盒包括有抗原包被的酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、羊抗猪酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液A、底物缓冲液B和终止液，其中抗原包被的酶标板上包被有重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP。
2.按权利要求1所述的检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP的包被浓度为0. 97 μ g/mL。
3.按权利要求1或2所述的检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的阳性对照血清和阴性对照血清使用时与样品稀释液的稀释比均为1:50，所述的羊抗猪酶标二抗使用时与样品稀释液的稀释比为1:5000。
4.按权利要求3所述的检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP的制备方法是1)以临床分离的猪源衣原体为病原株，提取病原株的总DNA为模板，经特异性引物进行PCR扩增得到主要外膜蛋白MOMP全基因片段，对其核苷酸序列进行测定并分析预测其信号肽位点及抗原表位分布，依据上述分析测定结果，利用主要外膜蛋白MOMP全序列上天然BamH I位点，选取主要外膜蛋白MOMP上无信号肽、抗原性强、而且抗原表位均位于其表面的部分片段；2)将主要外膜蛋白MOMP截取部分的片段与pET-28a连接并转入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，提取质粒，经PCR及酶切鉴定，测序，筛选出正确连接的阳性克�。竦弥刈橹柿� pET-28a-M0MP ；将此重组质粒pET48a-M0MP转化至大肠杆菌BL21感受态细胞中，经诱导表达、镍离子亲和层析纯化得到得到重组猪流产嗜性衣原体主要外膜蛋白rMOMP。
5.按权利要求4所述的检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，其特征在于所述的特异性引物为上游 Pl -.ttaggaiccATGAAAAAACTCTTGAAATCG ；下游 P2 :gcg§"ic^acTTAGAATCTGAATTGAGC。
全文摘要
本发明涉及一种检测猪流产嗜性衣原体抗体的ELISA试剂盒，包括有抗原包被的酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、羊抗猪酶标二抗、样品稀释液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液A、底物缓冲液B和终止液，其中抗原包被的酶标板上包被有重组衣原体主要外膜蛋白rMOMP。本发明的优点在于填补了猪衣原体病临床诊断中检测方法的空白，生产过程安全性高，不存在有害微生物扩散的危险。而且采用原核表达制备蛋白抗原已有成熟的发酵罐规模化生产技术，生产成本低，质量容易保证，适于科研应用及临床推广。
文档编号G01N33/566GK102520166SQ20111036764
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者刘泽文, 周丹娜, 杨克礼, 段正赢, 田永祥, 袁芳艳, 郭锐 申请人:湖北省农业科学院畜牧兽医研究所
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