专利名称：用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法和仪器的制作方法
技术领域：
本发明涉及从生物学样品中分离靶生物实体。在一个特定实施方式中，本发明涉及从血液样品中分离和浓缩稀少的或非常稀少的循环肿瘤细胞，但是本申请不限于这种实施方式，而是更一般地延伸至分离广泛的其它靶标细胞、亚细胞、和分子生物实体，例如非肿瘤细胞，包括微生物和病毒、膜结合的囊泡、亚细胞蛋白质、碳水化合物和核酸、污染物和毒素，甚至是元素例稀土元素。
背景技术：
广泛地讲，本发明涉及从构成生物学样品(特别是血液、血浆和血清样品)的复杂混合物中分离细胞或分子靶生物实体。如上文所示，在一个特定实施方式中，本发明提供了用于从血液样品中分离和浓缩稀少的或非常稀少的肿瘤细胞或其亚细胞组分的方法，所述肿瘤细胞或其亚细胞组分从癌性的或癌变前的肿瘤流出、渗漏或迁移到循环系统中。这些稀少和非常稀少的肿瘤细胞或其亚细胞组分的早期检测是非常重要的并且对于人类和其它动物中的恶性疾病的预后和结果有非常显著的影响。在癌症研究方面最近的进展显示出，虽然循环肿瘤细胞可能是稀少或甚至非常稀少的，可使用适当的生物标记物在外周血液样品中检测它们以帮助诊断患者中的癌性或癌变前病况以及帮助监测癌症患者中的治疗应答。类似地，分离母源血液样品中的循环胎儿细胞可被用于出生前的诊断，而分离抗原特异性淋巴细胞可被用于免疫监测中。本发明还提供了用于从血液样品中分离和浓缩循环干细胞的方法。Bodey的美国专利号6，008，002公开了用于检测和分离抗原相关癌细胞的组合物和方法。所述组合物和方法利用抗原特异性的、免疫磁性组合物作为检测和分离试剂。示例性的免疫磁性组合物包括与顺磁珠缀合的抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素并且其进一步与抗原特异性的、生物素化的抗体相缀合。置于磁场中的、亲和柱中的抗原相关癌细胞与免疫磁性组合物的流体混合物产生癌细胞免疫磁性组合物缀合物，其沉积在所述柱的内壁上。Saur等人的美国专利号4，710，472公开了适于从系统中移除经磁性珠包被的细胞的磁性分离设备，其包括基底、安装在所述基底上的多个磁体(从而产生用于盛载样品容器的样品室，所述样品容器将被置于所述磁体附近)、以及用于调整磁体相对于样品容器的位置的工具。使含有经磁性珠包被的细胞的血液样品通过被安装在所述磁体附近的管道。经磁性珠包被的细胞被所述磁体吸引并被保留在管道中，而非磁性的细胞通过所述管道。
Davidson等人的美国专利号6，482，328公开了用于从样品中磁性分离所选类型的靶粒子以产生样品中所述靶粒子的浓缩或产生样品中所述靶粒子的耗竭的方法和仪器， 其是通过产生样品与具有选择亲和性的磁性粒子的样品混合物以磁性沾染靶粒子；产生通过管的缓冲液流，所述管包括可与缓冲液的来源相连的入口和缓冲液的出口 ；当通过管产生了缓冲液流之后，将样品混合物引入流过管的缓冲液中，从而当二者都通过管供给时， 所述缓冲液形成所述样品混合物的连续的液体载体；以及在其中的磁化位置应用跨越所述管的磁�。佣咕判哉慈镜陌辛Ｗ颖环掷氩⒃谒龉苣诘拇呕恢么Ρ槐Ａ粼诨撼逡褐�。发明简述根据本发明的一方面，提供了用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法，其包括下列步骤(a)使所述生物学样品与对于所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇具有选择性结合亲和性的、经磁性标记的配体相接触，以在所述生物学样品中形成靶生物实体/ 经标记的配体复合物；(b)将具有确定的流体流动路径的分离�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈校龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹募耘帕校�(c)使所述生物学样品通过所述分离�？椋允股镅а吩谕ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒本艽懦。佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物在所述确定的流体流动路径中的运动而磁性地捕获所述复合物；(d)任选地，且优选地，使洗涤溶液通过所述确定的流体流动路径而所述复合物在所述流体流动路径内被磁性地捕获；(e)从磁场中移除分离�？椋缓�(f)从流体流动路径中回收所述靶生物实体/经标记的配体复合物。另一方面，本发明还提供用于从生物学样品中分离靶生物实体的仪器，其包括(i)具有确定的流体流动路径的分离�？椋�(ii)具有磁场的磁性�？椋龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹拇偶耘帕校渲兴龇掷肽？榫哂衅渲辛魈辶鞫肪段挥诖判阅？榈拇懦≈械牡谝晃恢煤推渲辛魈辶鞫肪洞铀龃懦∫瞥牡诙恢茫缓�(iii)控制器，其包括用于使生物学样品和任选地洗涤溶液通过由分离�？樘峁┑娜范ǖ牧魈辶鞫肪兜墓ぞ撸纱耸沟玫鄙镅а吠ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒保鲅肪艽判阅？榈拇懦�。在一个方面，本发明提供用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法，其包括下列步骤(a)使所述生物学样品与对于所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇具有选择性结合亲和性的、经磁性标记的配体相接触，以在所述生物学样品中形成靶生物实体/ 经标记的配体复合物；(b)将具有确定的流体流动路径的分离�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈校鋈范ǖ牧魈辶鞫肪栋ň哂泄餐肟诤凸餐隹诘亩喔龉茏丛宜龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹募耘帕校�(c)使所述生物学样品通过分离�？椋允股镅а吩谕ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒本艽懦。佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物在确定的流体流动路径内的运动而磁性地捕获所述复合物；(d)任选地，且优选地，使洗涤溶液通过所述确定的流体流动路径而所述复合物在所述流体流动路径内被磁性地捕获；(e)从磁场中移除分离�？椋缓�(f)从流体流动路径中回收所述靶生物实体/经标记的配体复合物。在这方面，本发明还提供了用于从生物学样品中分离靶生物实体的仪器，其包括(i)具有确定的流体流动路径的分离�？椋鋈范ǖ牧魈辶鞫肪栋ň哂泄餐肟诤凸餐隹诘亩喔龉茏丛�(ii)具有磁场的磁性�？椋龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹拇偶耘帕校渲兴龇掷肽？榫哂衅渲辛魈辶鞫肪段挥诖判阅？榈拇懦≈械牡谝晃恢煤推渲辛魈辶鞫肪洞铀龃懦∫瞥牡诙恢茫缓�(iii)控制器，其包括用于使生物学样品和任选地洗涤溶液通过由分离�？樘峁┑娜范ǖ牧魈辶鞫肪兜墓ぞ撸纱耸沟玫鄙镅а吠ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒保鲅肪艽判阅？榈拇懦�。另一方面，本发明的方法可包括下列步骤(i)在第一点或收集点收集所述生物学样品；(ii)在所述第一点将所述样品加入包含所述经磁性标记的配体的收集介质中；(iii)随后将包含所述样品和经磁性标记的配体的所述收集介质运送至第二点或测试点；以及(iv)在所述第二点完成所述方法。优选地，在本发明的这一方面，所述第一和第二点是彼此分离的，例如彼此间遥远或远离。例如，所述第一点或收集点可以是患者的家、医生的手术室或办公室、或医院病房， 而所述第二点或测试点可以是中央测试设备例如医院或商业测试或测定实验室。还优选地，一方面收集样品和将样品加入收集介质中的步骤，和另一方面完成所述方法的步骤，在时间上是彼此分离的，特别是由一段运送时间相分离，所述运送时间不仅足以将收集介质从第一点运送到第二点，还足以使得样品在运送中能够形成靶生物实体/ 经标记的配体复合物。
图1是本发明的实施例中所使用的基本元件和流体回路的图示，其显示了样品管或容器⑴，分离�？棰疲判阅？棰牵驼婵赵醇胺衔锎⒖饫�20或30ml的注射器 (4)。注射器(4)为将样品从管(1)通过分离�？�( 而拉至废弃物(即，图示中的注射器)提供了方便的工具，所述分离�？�( 可被置于磁性�？�(3)的磁场中或从磁性�？� (3)的磁场移除。注意，分离�？楹痛判阅？橄喽杂诒舜耸强梢贫模佣龇掷肽？榭杀灰氪判阅？榈拇懦』虼哟判阅？榈拇懦∫瞥Ｍ�2是分离�？�02)的螺旋管版本的图示，所述分离�？橛氪判阅？�03)的磁场分离(但可被移入其中)，所述磁性�？楸话沧霸谥С治�06)上。图3描绘了本发明的实施方式的分离模块和磁性�？椋涫视诘ザ阑蛲笔苟喔鲅肪判阅？椤Ｈ缢镜�(图3a)，两个分离模块管(32)由框架(35)支持，其被安装在基底(36)上，从而它们可被保持在磁性�？�(33)的磁场内(图3b)或从其中被移除(图 3c)。向分离�？橹屑尤敫嗟墓茉市泶砀嗟难贰Ｍ�4描绘了本发明的两个实施方式，其中磁体被支持在框架06)上，所述框架可围绕分离�？榈墓艿某ぶ�0 旋转。磁体对可以是相对的并且与管长平行(图如)， 或者是连续的并且与所述管平行(图4b)。发明详述本发明提供了用于分离和纯化磁性粒子和结合或附着至磁性粒子的靶实体的高通量设备。特别地，系统被设计为适于从流体样品中快速和有效地分离化学及生物学组分并且被设计为可规模化而用于现存的设备不能有效适用的工业和实验室应用。待分离的靶生物实体可包括分子，例如农业化学制品、核酸和蛋白质、亚细胞组分例如外来体、核糖体和病毒，以及细胞，例如循环肿瘤细胞或循环干细胞，和微生物，包括细菌病原体。流体样品可包括流体，例如水和生物学流体例如血液、血浆、血清、奶、尿和粪便提取物。通过磁性分离而从流体样品中分离生物学和其它组分是被很好地建立的实验室程序并且通常涉及下列步骤a)在容器中(例如试管中)将对于靶实体有亲和性的磁性粒子与怀疑含有所述实体的流体样品相混合；b)允许有时间使所述粒子与靶标组分相结合；c)在所述容器之下或周围提供磁体，从而使粒子被吸引至容器壁；d)去除流体；e)用洗涤液重悬所述粒子并重复步骤c)&d)数次以去除不注意地捕获的外来材料；f)重悬经纯化的粒子，使它们的特异性捕获的实体在合适的缓冲液或稳定液中。本发明通过使含有磁性粒子的流体样品流过磁性�？橐源判圆痘袼隽Ｗ樱喽杂谝呀⒌姆椒ǜ慕舜判苑掷牒痛炕乃俣群托�。在其最广泛的方面，本发明提供了用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法， 其包括下列步骤(a)使所述生物学样品与对于所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇具有选择性结合亲和性的、经磁性标记的配体相接触，以在所述生物学样品中形成靶生物实体/ 经标记的配体复合物；(b)将具有确定的流体流动路径的分离�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈校龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹募耘帕校�(c)使所述生物学样品通过所述分离模块，以使生物学样品在通过确定的流体流动路径时经受磁�。佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物在所述确定的流体流动路径中的运动而磁性地捕获所述复合物；
(d)任选地，且优选地，使洗涤溶液通过所述确定的流体流动路径而所述复合物在所述流体流动路径内被磁性地捕获；(e)从磁场中移除分离模块；和(f)从流体流动路径中回收所述靶生物实体/经标记的配体复合物。一方面，本发明提供了用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法，其包括下列步骤(a)使所述生物学样品与对于所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇具有选择性结合亲和性的、经磁性标记的配体相接触，以在所述生物学样品中形成靶生物实体/ 经标记的配体复合物；(b)将具有确定的流体流动路径的分离�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈校鋈范ǖ牧魈辶鞫肪栋ň哂泄餐肟诤凸餐隹诘亩喔龉茏丛宜龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹募耘帕校�(c)使所述生物学样品通过分离�？椋允股镅а吩谕ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒本艽懦。佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物在确定的流体流动路径内的运动而磁性地捕获所述复合物；(d)任选地，且优选地，使洗涤溶液通过所述确定的流体流动路径而所述复合物在所述流体流动路径内被磁性地捕获；(e)从磁场中移除分离�？椋缓�(f)从流体流动路径中回收所述靶生物实体/经标记的配体复合物。如本申请中所使用的，术语“靶生物实体”是指生物学上或医学上感兴趣的各种物质。实例包括激素、蛋白质、肽、碳水化合物、凝集素、寡核苷酸、药物、化学物质、核酸分子 (例如RNA和/或DNA)以及生物来源的粒子分析物，其包括生物粒子，例如细胞、病毒、细菌等。在本发明的优选实施方式中，可使用本发明的方法和仪器将稀少或非常稀少的细胞 (例如母源循环中的胎儿细胞、循环肿瘤细胞或循环干细胞)与生物学样品中的非靶细胞和/或其它生物实体有效地分离。靶生物实体还可包含血液、血浆或血清样品中的亚细胞组分，例如核酸和外来体，包括外来体内容物如蛋白质、碳水化合物和核酸，特别是RNA。术语“生物学样品”包括但不限于含有细胞的体液、外周血、血浆或血清、唾液、组织勻浆、肺和其它器官抽吸物、灌洗溶液和灌肠溶液，以及可从人类或动物受试者获得的任何其它来源。将领会，本发明的方法不限于医疗或兽医领域，而可被广泛应用以在其它领域中从生物学样品中分离靶生物实体，所述其它的领域包括非医疗应用，例如食品测试、农业测试、废水测试等。当涉及任意前述靶生物实体而使用时，术语“决定簇”可特异性地被生物特异性配体结合，并且指参与和负责选择性结合特定结合物质的靶生物实体的那部分，选择性结合的发生需要所述特定结合物质的存在。在基础术语中，决定簇是在特定结合对反应中被受体识别的靶生物实体上的分子接触区域。如本申请中所使用的，术语“特异性结合”或“选择性结合”包括下列相互作用抗原-抗体、受体-激素、受体-配体、激动剂-拮抗剂、凝集素-碳水化合物、核酸(RNA或 DNA)或者适体杂交序列、Fc受体或小鼠IgG-蛋白A、抗生物素蛋白-生物素、抗生蛋白链菌素-生物素以及病毒-受体。各种其他的决定簇-特异性结合物质组合被预期用于实施本发明的方法，例如对于本领域技术人员而言将是显然的。如本文中所使用的，术语“抗体” 包括免疫球蛋白、单克隆或多克隆抗体、免疫反应性免疫球蛋白片段，和单链抗体。还被预期用于本发明的是这样的肽、寡核苷酸或其组合其以与传统上产生的抗体相似的特异性特异性地识别决定簇。根据本发明的方法，对于靶生物实体有选择性结合亲和性的配体被磁性标记，例如通过将所述配体与合适的磁性粒子或珠偶联。磁性粒子是本领域熟知的，其在免疫和其它生物特异性亲和反应中的应用也是本领域熟知的(见例如Whitehead等人，美国专利号 4，554，088和Terstappen等人，美国专利号7，332，288)。可基于它们的大�。庑┝Ｗ臃掷辔蟮�(1. 5至约50微米)或小的(0. 7至1. 5微米)。小的磁性粒子在涉及生物特异性亲和反应的分析中十分有用，因为它们方便地被生物功能性聚合物(例如蛋白质)包被，提供非常大的表面面积并给出合理的反应动力学。 专利文献中已描述了 0. 7-1. 5微米范围内的磁性粒子，所述专利文献包括例如美国专利号 3，970，518 ；4，018，886 ；4，230，685 ；4，267，234 ；4，452，773 ；4，554，088 ；和 4，659，678。小的磁性粒子，例如上文所述的那些，通常落到两个大类中。第一类包括可永久磁化的或铁磁性的粒子；而第二类包括只有当经受磁场时才显示大量磁性行为的粒子。后者被称作磁性应答粒子。展示出磁性应答行为的物质有时被描述为超顺磁的。然而，通常被认为是铁-磁性的物质(例如磁性氧化铁)当以直径为约30nm或更小的晶体被提供时，可被表征为超顺磁的。类似于上文提及的小磁性粒子，大磁性粒子(>1.5微米至约50微米)也可显示出超顺磁的行为。典型的此类物质是美国专利号4，654，沈7中所描述的那些，以及由 Dynal (Oslo，挪威)生产的那些。过程涉及合成聚合物粒子，使所述聚合物粒子膨胀且使磁石晶体被包埋在膨胀的粒子中。相同大小范围内的其它物质是通过在分散的磁石晶体的存在下合成聚合物粒子而制备的。这引起将磁石晶体捕捉在聚合物基质中，因而使得所产生的物质具有磁性。在这两种情形中，所产生的粒子都具有超顺磁行为，这通过在去除磁场后容易地分散的能力而表现出来。由于大量的磁性物质/粒子，这些物质以及小磁性粒子都是使用简单的实验室磁力学被容易地分离的。当经磁性标记的配体与生物学样品接触时，配体选择性地结合靶生物实体或靶生物实体上的决定簇(例如肿瘤细胞特异性生物标记物)，以在生物学样品中形成与磁性粒子或珠偶联的靶生物实体/经标记的配体复合物。如果希望的话，可使用多于一种经磁性标记的配体，以提高方法的灵敏度。例如， 为了从血液样品中分离循环肿瘤细胞(CTCs)，可使用以抗EpCAM(上皮细胞粘附分子)抗体标记的磁性粒子，然而，由于EpCAM不在所有的上皮细胞上表达并且可仅在其它的细胞上弱地表达，还可单独地、或与经磁性标记的抗EpCAM抗体相结合而使用经磁性标记的抗细胞角蛋白(CK)抗体。然后，使生物学样品通过具有确定的流体流动路径的分离�？椋隽魈辶鞫肪对谝桓龇矫婵梢允鞘芟薜牧魈辶鞫肪�(例如螺旋管或提供合适的曲折或弯曲流体流动路径的其它构造)，其具有近端(入口)和远端(出口)，其位于磁性模块的磁场内或可被置于磁性�？榈拇懦∧�。在一个实施方式中，管状流体流动路径是由惰性的柔性塑料管道 (例如PTFE (Teflon)，PVC或有机硅管道)形成的。作为管状流体流动路径的备选方式，也可例如通过下述实现弯曲的流体流动路径环绕容器内的一系列平行板提供液流，或者在塑料材料体之内或之上塑造或真空形成流体流动路径，且如果需要的话，用粘着盖密封所述路径。优选地，确定的流体流动路径是由惰性的、柔性塑料管道形成的，其具有0.5mm至 5mm、优选0. 8mm至1.6mm的内径(ID)和50mm至200mm，优选IOOmm至125mm的管长(在磁场内)。由分离�？樘峁┑娜范ǖ牧魈辶鞫肪痘箍捎啥喔鋈嵝怨茏槌桑缍喔銎叫械娜嵝怨埽龉芑峋壑凉餐娜肟诤凸餐某隹�。备选地，流体流动路径可由平行的轨道塑造而不是由单独的管构成。流动路径的两端都被提供以用于向流动路径或从流动路径供应液体的工具。在这方面，分离�？榭捎�10个直径为1mm、长为250mm的平行硅橡胶管组成， 所述硅橡胶管在平坦基底上排列但是在每一端都集合成为适于与流体入口和出口工具相连的束。备选地，所述管可在一端与入口多支管相连而在另一端与出口多支管相连。可提供相等的通过每个管的液流，例如通过使用滚子(如在蠕动泵中所使用的)。在本发明的这个方面，使用多个管状元件(特别是多个平行柔性管)可以是特别有利的，因为与如果使用单一的管状元件或管相比，其允许更大体积的样品(因而更多的靶生物实体)以更低的流动速度(因而以更少的剪切力)流过确定的流体流动路径。当生物学样品从近端至远端通过由分离模块提供的确定的流体流动路径时，其经受磁性�？榈拇懦〈佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物的运动并将其保留在确定的流体流动路径内而磁性地捕获所述复合物。在一个实施方式中，可沿着确定的流体流动路径渐进地应用一系列磁�。绱釉抖酥两耍佣咕判员昙堑母春衔锔坏匮刈帕魈辶鞫肪侗徊痘穸皇墙鲈谝坏惚徊痘瘛Ｒ炎⒁獾剑缭酱盘逭罅性诹魈宕脊苤辛鞫拇判�(或顺磁性)粒子主要在阵列中磁体间的连接处被捕获。本发明因此提供了这样的磁性�？椋湓诹魈辶鞫肪吨邪ǘ喔龃盘寤蛴糜诖判圆痘竦牡悖蕴峁┳畲蟪潭鹊牧Ｗ硬痘瘛Ｋ龃判阅？橛叛〉夭捎糜谰么盘謇慈缦虏痘�、浓缩、纯化和释放磁性粒子a)可使用静止的永久磁条阵列(例如4至20个单独的磁体的阵列)，并且当所述阵列中相邻的磁体以相反的磁极性排列时其提供简单而有效的磁性�？椋籦)多个磁条的阵列可以被排布以围绕、逆着或随着液流转动以捕获或释放磁性粒子。在另一个实施方式中，分离�？橐部杀恢糜谝贫拇盘逭罅械牧教醮洌龃盘逭罅锌杀恍佣谌我环较蛏臃掷肽？槟谌范ǖ牧魈辶鞫肪吨械拇判粤Ｗ�。优选的磁性�？槭侵辽倭礁鱿⊥劣谰么盘宓恼罅校龃盘謇缥� 50x5x3. 5mm，它的极在50x5mm的两侧上。已发现，当磁体被并排和/或端对端排列并且其极向上或向下且交替而使得N极向上的磁体紧靠S极向上的磁体时，对于流动磁性粒子的最多的捕获发生在磁体之间的连接处。为了使粒子捕获最大化，可将多个磁体排列在由线性对、块、筏组成的阵列中，在盘上或在鼓(drum)周围。在所有的情形中，设置分离�？榈牧魈辶鞫肪兑栽市泶┕蜓刈糯盘寮淞哟�(即最大场强度的区域)的通过最大化。因为排列了吸引力，作为阵列中相邻磁体的相反磁极性的结果，磁性�？榫哂薪鲂枰虻ブС值恼逍裕馕胖梅掷肽？樘峁┝吮憬莸耐�。如果需要，这种磁性构造也允许磁体被放置而使得它们可逆着液流移动以提高捕获，或者随着液流移动以提高粒子释放。由于最大程度收集磁性粒子的点在磁体之间的N-S连接处或其附近，而不在磁体的面上，可装配磁体以利用这一点。例如，磁体可被如下排布(a)在“阶梯”样的筏中，其中管的走向垂直于单个磁体的长轴(如下文的图3中所示)。在此情形中，在多个捕获点(即连接处)有不连续的粒子集合。(b)在平行的轨道中，其中管的走向沿着磁体长轴之间的连接处。在此情形中，沿着管/磁体的长度有连续的集合。可见地捕获所有磁性粒子所需的路径对于构造(a)和(b)是相似的，因此(a)构造通常是优选的，因为与构造(b)的有限数目的磁性连接处相比，更多的管可平行地跨过磁性�？榈目矶取＠纾�(a)和(b)的情形中，磁性�？榫捎�20个磁体组成且为50mm宽、IOOmm 长。对于构造(a)，对可跨过磁性�？榈钠叫泄�(因而对样品)数目的唯一限制是由管的宽度和其相关的硬件设置的。相反，在构造(b)中，在磁体之间仅有4个连接处，因此仅可平行地使用4个管(或处理4个样品)。螺旋管分离�？�(如下文的图2中所示)比上文的线性模型更加紧凑并且粒子被捕获于所有的连接处(纵向的、横向的和倾斜的)。可能的劣势是其不如线性模型适合于多个管(即样品)。旋转磁体构造(如下文的图如所示)通过使待捕获的实体通过在管孔中 “盘旋”的磁性粒子"云"而增加捕获。在静态磁场中，磁性粒子流向最靠近磁体的管侧而不太可能进一步捕获分析物。利用旋转磁体、使样品/粒子混合物经过分离�？樵傺�、和分离前在运送中孵育所述混合物这些本发明的方面，目的都在于减少或消除试剂反应时间要求并使得测试离医师或患者更近。优选地，捕获之后，用洗涤溶液洗涤被保留在确定的流体流动路径中的靶生物实体/经标记的配体复合物(优选地通过重复洗涤)以去除未结合的、生物学样品的细胞和其它组分。还优选地，沿着流体流动路径供给一个或多个气泡以将生物学样品与洗涤液分隔开，并且其中进行重复洗涤以分隔出单独的洗涤液等份。例如，沿着流体流动路径经过的流体的顺序可以是样品气泡洗涤液气泡洗涤液。最后，如下从确定的流体流动路径回收被捕获的复合物通过从磁性模块的磁场移除分离�？橐允头啪判员昙堑母春衔铮缓蠼龈春衔镒频绞占萜髦校缤ü故占和ü魈辶鞫肪丁Ｈ缓螅赏üコ占�(如果需要的话)来浓缩所分离的靶生物实体/经标记的配体复合物，所述复合物然后适于进一步的处理，例如用于分析疾病的生物标记物。在一个实施方式中，可通过使洗涤液从流体流动路径的远端或出口端回冲以将所捕获的复合物冲出近端或入口端，而在将分离�？榇哟懦≈幸瞥笫迪侄运痘竦母春衔锏幕厥�。同样，也可在分开的洗涤液等份之间引入气泡以帮助移位以及随后回收被捕获的复合物。由于从分离�？榛厥盏木痘竦母春衔镆部砂ㄎ唇岷系木昙堑呐涮澹缥从氚猩锸堤�(例如循环的肿瘤细胞)结合的磁性粒子，可进一步处理所回收的物质以从所捕获的靶生物实体/经标记的配体复合物中分离所述未结合的经标记的配体。这种分离可以是物理的，例如通过使用合适的膜以将较大的靶生物实体/经标记的配体复合物与较小的未结合的经标记的配体分离，或备选地这种分离可通过使用第二种结合剂来捕获靶生物实体/经标记的配体复合物并将其固定到固体支持物上而实现，例如当靶生物实体是循环的肿瘤细胞时，所述第二种结合剂可以是与生物素偶联的抗EpCAM抗体或抗细胞角蛋白 (CK)抗体，其结合靶生物实体/经标记的配体复合物(并且不与未结合的经标记的配体结合)，然后可分离所产生的复合物，例如通过使用与管或其它固体支持物(如显微镜玻片) 偶联的抗生蛋白链菌素。合适的、程式化的控制器可被用于控制生物学样品和洗涤液流过流体流动路径、 如上文所述引入气泡、以及控制所有其它的功能包括，例如分离�？榇哟懦〉囊贫突厥账痘竦母春衔�。进一步加工所分离的靶生物实体可包括，例如鉴别和测定所分离的细胞，这是直接通过使用显示剂(例如经荧光团标记的抗体)和荧光检测仪，或间接地通过检查所分离的细胞(例如，通过染色和/或显微镜技术)，或通过分析蛋白或核酸生物标记物。除了这些熟知的、传统检测方法和测定之外，进一步加工所分离的靶生物实体还可包括更新的检测方法，例如基于后生(印igenetic)变化的测定，例如，对于前列腺癌的基于甲基化的测定中甲基化状态的改变。如上文所述，本发明的方法适于从生物学样品中分离广泛的靶生物实体，并且仅需要特异性结合所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇的合适的特异性结合配体， 并且其可与本文中所描述的磁性粒子或珠相偶联。所述特异性结合配体可以是抗体、核酸， 或甚至可能是对于特定的元素有亲和性的螯合剂。本发明因此可被用于捕获和浓缩任何细胞，包括微生物、亚细胞膜结合的囊泡、亚细胞蛋白和核酸(包括病毒)，污染物和毒素以及元素(例如稀土元素)。在一个特别的实施方式中，本发明的方法特别适于从复杂的细胞介质(例如血液)中分离经纯化的细胞群体。在这种实施方式中，所述方法包括下列步骤(i)使所述细胞介质(例如血液)与磁性粒子(例如4. 5微米的Dynabead)相接触，所述磁性粒子与选择性结合目的细胞群体的配体相偶联；(ii)使细胞介质/经标记的配体混合物通过具有确定的流体流动路径的分离模块，所述分离�？槿缟衔乃霰恢糜诖判阅？榈拇懦≈幸栽诜掷肽？橹械牧魈辶鞫肪吨芪Р懦。佣够旌衔镏械拇判粤Ｗ�(以及与其结合的目的细胞)被捕获并保留在分离�？橹校�(iii)用去除未结合的血液组分的洗涤溶液洗涤被捕获的磁性粒子(和与其结合的目的细胞)；(iv)从磁场中移除分离�？橐允头糯判粤Ｗ樱灰约�(ν)回收粒子，例如通过利用收集液流过管状流体流动路径而洗脱，以将磁性粒子 (以及与其结合的目的细胞)转移到收集容器中用于进一步的处理和分析。在本发明的方法中，当生物学样品通过确定的流体流动路径时，使靶生物实体/ 经标记的配体复合物经受磁场。在备选的实施方式中，当样品通过确定的流体流动路径时， 可沿着流体流动路径脉冲或移动磁�。蛘呤股镅а肪芟嗟惹蚁喾吹拇帕�。这种备选的实施方式提供了使磁性粒子保持在流体流动路径的中流而不是在其壁上的可能性，从而使得能够增加"结合的"或捕获的磁性粒子与生物学样品的未结合组分的分离。在一个实施方式中，本发明的方法可包括下列步骤1.使能够直接或间接(例如通过生物素-抗生蛋白链菌素连接)与靶实体作用的磁性粒子与怀疑含有所述实体的流体样品混合。2.允许时间使所述粒子与靶实体进行反应，拉动流体样品经过分离�？椋渌俣仍市泶判圆痘竦煌ü鞫募羟辛ΧナО惺堤�。例如，可在分离�？榈南掠味耸褂米⑸淦骰蚶嗨频纳璞敢岳肪？�。3.样品流动完成后，使洗涤液(例如用于细胞的等张缓冲液)流过�？橐韵吹羧魏畏翘匾煨越岷系奈镏�。4.洗涤之后，当洗涤液仍然流动时，将分离模块从磁场中移除，从而使磁性粒子被释放并从分离�？榱魅牒鲜实氖占萜髦�。备选地，经过分离�？榈牧鞫梢允窍喾吹牟⑶揖炕陌惺堤逶谀？榈慕吮慌懦龅绞占萜髦�。本发明的方法的另一个实施方式设法解决涉及批量处理以从生物学样品中分离靶生物实体(例如从血液样品中分离循环肿瘤细胞(CTC))的已知现有技术系统的限制，所述已知现有技术系统需要允许有时间使样品中的任何靶生物实体(例如CTC)与经磁性标记的配体之间进行被动的反应。在本发明的方法中，靶生物实体与经磁性标记的配体之间的反应在样品流过确定的流体流动路径时得到帮助，但是其可通过主动地使样品与经磁性标记的配体在样品管(例如Vacutainer血液收集容器)中在一起而被进一步增强，而不是简单地接触试剂和允许有时间进行被动的受扩散限制的反应。例如，可在样品管中将经磁性标记的配体加入样品(例如血液)中，所述样品管被置于磁体上方，所述磁体将吸引磁性粒子穿过样品到管的基底部。为了进一步增强靶生物实体与经磁性标记的配体的反应，然后可以使样品在样品管内再循环，这是通过从管的基底部拉动样品(例如通过高浓度的磁性粒子)然后再加回管的顶部，在那里磁体将再次吸引磁性粒子穿过样品到管的基底部， 等等。在这一再循环过程中，例如CTC标记将因此通过下述二者被促进磁性粒子持续通过样品管中的血液样品以及样品在样品管基底部被拉过高浓度的磁性粒子。完成这一主动或加速的标记阶段后，可将样品从样品管基底部拉至分离�？樯弦匀缟衔乃鍪蛊渫ü范ǖ牧魈辶鞫肪�。如上文所述，在另一方面，本发明还提供了用于从生物学样品中分离靶生物实体的仪器，其包括(i)具有确定的流体流动路径的分离�？椋�(i i)具有磁场的磁性�？椋龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹拇偶耘帕校渲兴龇掷肽？榫哂衅渲辛魈辶鞫肪段挥诖判阅？榈拇懦≈械牡谝晃恢煤推渲辛魈辶鞫肪洞铀龃懦∫瞥牡诙恢茫缓�(iii)控制器，其包括用于使生物学样品和任选地洗涤溶液通过由分离�？樘峁┑娜范ǖ牧魈辶鞫肪兜墓ぞ撸纱耸沟玫鄙镅а吠ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒保鲅肪艽判阅？榈拇懦�。在一个方面，本发明还提供了用于从生物学样品中分离靶生物实体的仪器，其包括
(i)具有确定的流体流动路径的分离�？椋鋈范ǖ牧魈辶鞫肪栋ň哂泄餐肟诤凸餐隹诘亩喔龉茏丛�(ii)具有磁场的磁性�？椋龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹拇偶耘帕校渲兴龇掷肽？榫哂衅渲辛魈辶鞫肪段挥诖判阅？榈拇懦≈械牡谝晃恢煤推渲辛魈辶鞫肪洞铀龃懦∫瞥牡诙恢茫缓�(iii)控制器，其包括用于使生物学样品和任选地洗涤溶液通过由分离�？樘峁┑娜范ǖ牧魈辶鞫肪兜墓ぞ撸纱耸沟玫鄙镅а吠ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒保鲅肪艽判阅？榈拇懦�。如上文所述，在本发明的仪器中，分离模块具有其中流体流动路径位于磁性�？榈拇懦≈械牡谝晃恢煤推渲辛魈辶鞫肪洞铀龃懦∫瞥牡诙恢谩＠纾掷肽？榭上喽杂诠潭ǖ幕蚓仓沟拇判阅？橐贫佣浯铀龅谝晃恢靡贫剿龅诙恢�。备选地，磁性�？榭上喽杂诠潭ǖ幕蚓仓沟姆掷肽？橐贫源锏较嗤男Ч�。本发明的方法和仪器特别适于商业的、自动化的操作。包括确定的流体流动路径的分离�？榭梢允遣话汗笄铱膳灼模⑶夷芄槐桓咚僮远刂圃�。此外，可使用合适的控制装置来自动化地实现控制磁体活化和所有其它的过程(例如将生物学样品抽吸过分离�？椋吹尤芤旱耐ü拖赐岩曰厥瞻猩锸堤�)。如上文所概述的，本发明的方法和仪器被设计为用于从流体中检测、浓缩和纯化目的靶生物实体(包括但不限于极为稀少的靶生物实体)。一个优选的应用是用于从血液中检测、纯化和浓缩循环肿瘤细胞(CTC)或其核酸。CTC可以低于十亿分之一细胞的浓度存在于癌症患者的血液中，但是它们的存在和数目对于患者的预后和治疗管理是重要的。最广泛使用的用于检测CTC的方法目前是Veridex CellSearch系统，其利用CTC 检测来预测存活并监测癌症患者中的治疗应答。Cellkarch方法采用血液样品的批次处理，并且具有缓慢的劣势，而且其效力受到不足的灵敏度的限制。这一技术的背景以及目前的方法的缺陷由 Talasaz 等人 Q009)的 Proc Natl Acad Sci USA 106 :3970-3975所公开， 其还介绍了备选的，更灵敏的CTC收集方法。本发明设法解决Cellkarch和Talasaz等人的方法的下列缺陷，并提供适于高通量诊断性实验室应用的、用于CTC检测、纯化和回收的可规模化工具灵敏度=Cellkarch方法的速度和灵敏度受到磁性粒子与血液中任意CTC之间的反应的被动、受扩散限制的时间的限制。本发明通过使CTC临近磁性粒子流动而增强捕获， 并且这可如下被进一步促进在运送中孵育和/或将“弹跳的”磁性粒子的“云”逆着流动的血液扫掠到分离�？榈纳嫌尾糠种校佣鼓？槠鸬较袂缀痛炕淖饔�。由于使用了多个平行的管状元件而以低的流动速度和低剪切力处理大量血液的能力也可被用于增加所捕获的细胞的数目。纯度=Cellkarch方法将碎片捕捉在磁性沉积物中，从而需要多个洗涤步骤，伴随重复的CTC沉积和重悬。这是耗费时间的并且对于细胞可以是破坏性的。本发明温和地将CTC捕获在分离�？橹卸饫吹奈镏柿鞯椒掀镏小Ｊ头藕驮儆τ么懦』颉暗绷Ｗ涌山徊桨镏头湃魏畏翘匾煨越岷系奈镏省Ｑ吠暾訡ellkarCh方法提供了 CTC检测和细胞计数，但是没有提供细胞用于除了显微镜检查之外的分析。本发明提供温和的、最小破坏性的细胞检测、纯化和浓缩方法用于进一步分析，包括蛋白质和核酸分析。商业应用=Cellkarch方法能够在3_4小时中批次处理7个样品和1个对照。 Talasaz等人的方法可批次处理更多的样品但是样品的体积(因而CTC的数目)是有限的， 并且磁性扫掠和回收方法不适于高通量的商业应用。本发明使得能够以有效的细胞回收处理大的体积并且可规模化用于商业和实验室应用。虽然特别适于CTC纯化，本发明同样适于要求从大量样品中回收微量靶实体的所
有应用。在本发明的特别优选的实施方式中，磁性�？榘ǘ喔鱿⊥链盘宓恼罅校�10 个大约50xh3. 5mm的磁体、极位于两个50x5mm的侧面上，其形成大约50x50mm的阵列或〃 毯"。磁体在此阵列中并排排布，其极向上或向下并且相邻的磁体具有相反的磁极性，即， 使得N极向上的磁体与S极向上的磁体相邻。将磁体阵列安置在用于磁性�？榈暮鲜实幕咨�。在为了适于核酸的捕获和释放以及适于捕获CTC而采用的这种实施方式中，为了避免污染的风险，所有的组件(包括试剂)都以可抛弃性“一次性使用”的形式提供。这些可抛弃性组件包括⑴注射器(l-30mL，优选IOmL)(ii)分离模块，其包括空心管或由空心管组成，所述空心管类似于延长的可抛弃性移液管头，并且可以是直的、螺旋的或蛇形构造。�？榈慕司哂幸跣宰�(female taper) 以允许与实验室移液器或注射器密封匹配。远端具有阳性锥(male taper)，其出口 ID类似于可抛弃性移液管头的ID。将针对所选的应用而选择合适的管孔直径(ID)，最有可能在 0.5mm至5mm之间，且管长在50至200mm之间。优选的ID为1mm，管长为100至125mm。分离�？椴牧峡梢允侨魏胃招曰虬敫招缘亩栊圆牧希ǜ髦炙芰希蕴澹ＡЩ蚪鹗�。如果为�？樘峁┝烁招曰虬敫招缘闹С治铮部墒褂酶招越闲〉牟牧�(例如PTFE (Teflon)或硅橡胶管道)。(iii)用于接收来自分离�？榈牧鞒鑫锏姆衔锎⒖�。(iv)用于提供洗涤剂和其它试剂(例如，用于标记或裂解细胞)的试剂容器或储库。可在瓶中或可抛弃性盘的孔中提供所述试剂，其例如具有可被�？榈脑�(阳性)端穿透的密封物。所述盘还可承载废物储库。虽然可用上文所述的磁性�？楹蜕衔牡目膳灼宰榧侄写判苑掷耄杂诳刂�、安全和牵制而言，自动化的或半自动化的设备是明显优选的。此种设备可包括下列(ν)注射器驱动器(driver)，即用于将液体从注射器中驱出或将液体拉入注射器内的可逆式驱动。(vi)用于支持和保持分离�？榻袅诖判阅？榈墓ぞ撸龃判阅？橛扇缰八龅亩喔銮康南⊥链盘遄槌�。(vii)废物储库或用于接收来自分离�？榈姆掀鞒鑫锏墓ぞ�。(viii)用于向分离�？榈脑抖颂峁┦约恋墓ぞ�。例如，这可以是可滑动的或可旋转的机制，其将试剂容器呈递给分离�？榈脑抖�。(ix)可程式化的控制器，以控制所述仪器的功能。
下面通过例举的方式描述通过使用以抗EpCAM(上皮细胞粘附分子)抗体标记的磁性粒子从血液中分离循环肿瘤细胞(CTC)的方法，但是其同样适用于其它的磁性分离， 包括纯化核酸。本说明书假设废弃物和试剂容器是在旋转的或可移动的架或盘中提供的， 所述架或盘能够将它们呈递给分离�？�。 a.将所需体积(通常为7. 5mL)的血液拉入注射器中。优选地，在含有抗EpCAM磁性粒子的Vacutainer中供应血液，或者备选地，可使磁性粒子流入或被加入注射器中。b.将注射器与分离模块相连结，将�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈胁⑶沂棺⑸淦骰钊雍系阶⑸淦髑髦�。C.启动注射器驱动器a.血液以受控的速度通过分离�？椴⒃诜衔锎⒖庵斜唤邮�。(在此步骤中，其通常占用5分钟，磁性粒子与结合的CTC被捕获在分离�？橹�)。b.将废物储库移开并将洗涤液从其储库经过分离�？槎磷⑸淦髦�。这将经洗涤的CTC留在分离�？橹�。如果需要的话，还可拉动裂解或染色试剂通过分离模块。d.移除并丢弃注射器。e.将移液器插入分离�？橹�(其成为了移液管头)并从磁场中移除分离�？椤.将分离�？槟谌菸�(CTC和磁性粒子)排入微量滴定孔中(或类似的)。如果需要的话，可通过重复地将样品上下拉动通过分离�？槎竦昧硗獾幕厥�。如果需要的话，还可以使用另外的洗涤步骤。使用此仪器，已发现包括具有优选尺寸(ID = 1mm, L = 100mm)的管的分离模块回收体积为大约80 μ L的液体中的CTC (如果L= 125mm，体积为大约 100 μ L)。上述方法和仪器具有许多优势 它极其简单和便宜，因为其不具有阀门或管路系统(plumbing)。 它适于分子生物学、感染剂和酶促分离，因为所有的组件和试剂都是可抛弃性的，从而消除了任何污染的风险。 所有的可抛弃物是可容易地得到的或者其制造是容易且便宜的。 分离可以是多重的。例如，可以8或12的结合的组(可独立分开的)制作分离模块，其间隔使其适合与标准的实验室移液器及微量滴定盘一起使用。在用于从血液样品中分离CTC的、上文所述的方法的备选方法中，在含有抗EpCAM 磁性粒子的Vacutainer收集容器中供应血液样品，注射器与分离�？�(其被置于磁性�？榈拇懦≈�)相连结，并且从收集容器中拉动血液样品通过分离�？榻胱⑸淦髦校佣判粤Ｗ雍退岷系腃TC被捕获在分离�？橹小Ｔ诖邮占萜髦欣鲅貉泛螅菀敕掷肽？橹校缓蠼吹右捍悠浯⒖庖胱⑸淦髦校咕吹拥腃TC留在分离�？橹�。然后从磁性模块的磁场中移除分离�？椋⑷缟衔乃龃臃掷肽？榛厥誄TC。可对上文所述的仪器进行各种变化或修饰。例如，可修饰所述仪器以便提供对于所需分析物的多阶段捕获。因此，为了提高被捕获的CTC的纯度，可使用利用连续的两个分离�？榈牧浇锥畏椒�。磁性粒子和所结合的CTC如上文所述被捕获在第一分离�？橹胁⒈幌吹樱龅谝环掷肽？榇哟判苑肿拥拇懦≈幸瞥缓蠼诙掷肽？橹糜诖懦≈校以谌缟衔乃龅幕厥罩埃估醋缘谝环掷肽？榈拇判粤Ｗ雍退岷系腃TC通向并被捕获在所述第二分离�？橹小�
类似地，也可使用多阶段捕获来从癌细胞(例如CTC)中提取RNA和/或外来体。在这种实施方式中，如上文所广泛描述地使用第一分离�？椋佣友貉分胁痘馛TC(其结合至磁性粒子)。在第一分离�？橹辛呀饫醋缘谝环掷肽？榈木痘窈拖吹拥南赴佣菇岷现链判粤Ｗ拥南赴槠３直徊痘裨谀歉龇掷肽？橹校呀獾奈镏�(包括DNA 和/或外来体内容物)被回收到收集容器中。在收集容器中将经裂解的物质与结合RNA的磁性粒子(例如磁性玻璃珠)以及(如果需要的话)RNA提取试剂相混合，然后使其通过被置于磁性�？榈拇懦≈械牡诙掷肽？椋谀抢锊痘翊判粤Ｗ蛹八岷系腞NA。然后通过将第二分离�？榇哟懦≈幸瞥⑶胰缰八龅鼗厥毡徊痘竦奈镏剩铀龅诙掷肽？橹谢厥照庑┐判粤Ｗ雍退岷系腞NA。多阶段捕获也可被用于从被捕获的CTC中去除非特异性捕获的细胞(例如淋巴细胞)。在这种实施方式中，如上文所述捕获和洗涤结合至磁性粒子的CTC。回收CTC并将其释放到反应容器中，在那里使它们与结合在大的、非磁性珠上的抗淋巴细胞抗体(例如抗 CD45)相混合以标记淋巴细胞。然后使混合物通过位于磁场中的第二分离模块，以再次捕获结合至磁性粒子的CTC，而结合至所述大的、非磁性珠的淋巴细胞被扫过此分离�？�。然后通过将第二分离�？榇哟懦≈幸瞥⑶胰缰八龌厥毡徊痘竦奈镏剩铀龅诙掷肽？榛厥毡徊痘竦腃TC。另一方面，为了加速标记反应并缩短处理时间，本发明的方法可包括下列步骤(i)在第一点或收集点收集所述生物学样品；(ii)在所述第一点将所述样品加入含有所述经磁性标记的配体的收集介质中；(iii)随后将包含所述样品和经磁性标记的配体的收集介质运送至第二点或测试点；以及(iv)在所述第二点完成所述测试方法。可直接处理所述生物学样品以根据如上所述的本发明的方法分离靶生物实体或者可需要在测试之前进行某些形式的处理。例如，活检样品可能需要在测试前均质化。此夕卜，就生物学样品不是液体形式而言(例如其可以是固体、半固体或脱水的液体样品)，可能需要加入试剂(例如缓冲液)以使样品移动。根据本发明将生物学样品加入其中的"收集介质"可以是本领域技术人员所熟知的任何合适的介质。合适的介质包括，例如，适于收集和转运生物学样品的盐水和经缓冲的介质。收集介质包括如上文所述的经磁性标记的配体，并且还可在将生物学样品加入收集介质之前和之后含有样品和配体的稳定剂，包括例如(除了缓冲剂之外)去污剂、蛋白酶抑制剂和稳定剂。在特别的实施方式中，本发明提供了如上文所广泛描述的方法，其中收集介质被设计为对于随后或同时的反应提高蛋白质的溶解性以检测一种或多种分析物。此类提高靶肽或样品中的溶解性的试剂是本领域技术人员所熟知的，并且包括例如表面活性剂、高或低离子强度的缓冲剂、抗黏液溶解试剂、溶菌酶和核酸酶。此外，在这种实施方式中，本发明还包括加入特定的蛋白酶来选择性地降解靶肽或蛋白，从而暴露特定的表位。在本发明的这种实施方式中，在收集介质中包括此类溶解试剂帮助检测样品中的蛋白或肽基因表达产物，因为这些试剂在将样品从第一点或收集点向第二点或测试点的运送时间中在提高靶表达产物的溶解性方面是有活性的。
下面的使用本发明来从血液样品中分离循环癌细胞的实例是以阐释的方式描述的，而非对本发明的限制。
实施例实施例1 从缓冲液中回收乳胶微球体。将经生物素标记的乳胶微球体(Bangs Laboratories,直径10. 35 μ m, 10 μ L)与经抗生蛋白链菌素包被的磁性粒子(Chemicelia μ m直径，10 μ L)混合并在环境温度下、 在7. 5ml磷酸盐缓冲液(PBS，pH7. 2)中反应30分钟。将混合物拉动经过如图2所示的、包括在磁性�？樯戏降膌mmX200mm的螺旋PTFE管(分离�？�)的仪器从而使流动在大约5 分钟内完成，其中所述磁性�？榘�10个稀土磁体的筏(每个磁体为5mmx3. 5mmx50mm,以交替的极性并排排布，即总的尺寸为50mmX50mmX3. 5mm)。用Iml的PBS洗涤后，将分离�？榇哟判阅？樯弦瞥⒂闷莺蚉BS将所捕获的粒子从模块回冲到磁体上方的小管中。去除上清液并且对重悬的沉积物的显微镜检查显示出，较小的磁性粒子和较大的乳胶粒子均被捕获在了分离�？橹�。离心流出物没有产生沉积物，表示磁性粒子结合了较大的乳胶粒子并且两个种类的所有粒子均被捕获在了分离�？橹�。实施例2 从血液中回收乳胶微球体用新鲜的人类血液代替PBS而重复实施例1的实验。在血液流动完成后引入小气泡并且在洗涤开始后再次引入小气泡以帮助从分离模块中清除残余的血液。对被捕获的粒子的显微镜检查显示出稠密的乳胶珠和小的磁性粒子的混合物。实施例3 从血液中回收所培养的人类结肠直肠癌细胞。(a)螺旋管分离�？�(图2)收获培养的人类结肠直肠癌细胞(HCT 116, ATCC号CCL-M7)，对其进行计数并使用培养液作为稀释剂而使其成为浓度已知的细胞/ml。将细胞加入5ml的新鲜人类血液等份中至总共1000，500，250，50和8个癌细胞/等份。将在抗上皮细胞抗体(Dynabead上皮富集，抗EpCAM)中包被的磁性珠加入(IOyL)每个等份中并在室温下孵育混合物至少30 分钟。使每种血液混合物都以大约1. 67ml/分钟(即对于5ml而言为3分钟的流动时间) 的流速经过图2的仪器，然后用含有0. 05% Tween 20的Iml PBS(PBST)洗涤。观察到棕色的磁性粒子被捕获在螺旋管的第一半中(IOOmm)。从磁性模块上移除后，用PBST(Iml)和气泡将分离模块回冲到小管中。在磁体上方将磁性粒子浓缩到管的基底部，去除上清液并将粒子重悬在10 μ L的PBST中的25%亚甲蓝染剂中。在所有的情形中，对所回收的物质的显微镜检查都显示出经蓝色染色的、所加入类型的细胞和磁性粒子，其中细胞的浓度与原始加入的数目大致等同。在含有8个所加入的细胞的血液的情形中，发现了一个6细胞簇和 2个单独的细胞。没有在任何情形中观察到任何红或白血细胞。(b)直管分离�？�(图3)将一百个HCT 116细胞加入5ml血液和10 μ L磁性珠中，在室温下孵育30分钟并以大约1. 67ml/分钟将其拉过如图3所示的20个稀土磁体的筏(即磁性模块= 100x50x3. 5mm)上方的直的PTFE管(长度=200mm, ID = lmm)。棕色的磁性粒子被捕获在磁性�？槌ざ鹊那�75mm内的分离�？楣苤小Ｈ缤凳├�3 (a)，从磁体上移除后，将分离模块回冲，回收粒子并发现其含有磁性粒子和类似于所加入的那些的细胞。不可见血细胞。
(c)直的分离�？楣芎徒惶娴拇盘宥酝既缫越惶娴墓乖炝挪即盘宥�(图4a)并围绕直的PTFE管(Imm直径，200mm长) 以140rpm旋转。当使5ml含有10 μ L磁性粒子的PBS以1. 67ml/分钟的速度流过管时，第一磁体对捕获所有的粒子。当将相同体积(5ml)、含有相同量(10 μ L)的磁性粒子的血液， 以相同的流速拉过管时，没有捕获到任何东西。当将流速降低至0.625ml/min时，粒子在大约60mm的总磁体长度内被捕获在管中。这表示旋转的磁体使粒子在管的中央形成“云”，其在更高的流速时被更加稠密的血液所替代。(d)直的分离�？楣芎托南喽源盘宥酝�4b在这个实施例中，通过在分离�？橹惺褂酶笾本兜墓芎透牧魉俣迪至私档偷难毫鞫俣�。在如图4b中所示的磁性�？橹校怪本�1. 6mm、长150mm的直的Ρ Ε 管穿过两个相对的磁体对之间，每一个为50x5x3. 5mm。使磁体以140rpm围绕管转动并且使含有200个HCT 116细胞和10 μ L磁性粒子的5ml血液以0. 625ml/分钟的速度通过�？�。 所有的粒子都被捕获在磁体长度的前25mm中。在用ImlPBST进行洗涤后，从磁性�？橹谐烦鏊龉懿⑶胰缰八龌厥毡徊痘竦牧Ｗ�。发现所回收的物质是磁性粒子和类似于所加入的那些的细胞。没有可见的血细胞。
权利要求
1.用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法，其包括下列步骤(a)使所述生物学样品与对于所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇具有选择性结合亲和性的、经磁性标记的配体相接触，以在所述生物学样品中形成靶生物实体/经标记的配体复合物；(b)将具有确定的流体流动路径的分离�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈校龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹募耘帕校�(c)使所述生物学样品通过所述分离�？椋允股镅а吩谕ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒本艽懦。佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物在所述确定的流体流动路径中的运动而磁性地捕获所述复合物；(d)任选地，且优选地，使洗涤溶液通过所述确定的流体流动路径而所述复合物在所述流体流动路径内被磁性地捕获；(e)从磁场中移除分离�？椋缓�(f)从流体流动路径中回收所述靶生物实体/经标记的配体复合物。
2.用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法，其包括下列步骤(a)使所述生物学样品与对于所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇具有选择性结合亲和性的、经磁性标记的配体相接触，以在所述生物学样品中形成靶生物实体/经标记的配体复合物；(b)将具有确定的流体流动路径的分离�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈校鋈范ǖ牧魈辶鞫肪栋ň哂泄餐肟诤凸餐隹诘亩喔龉茏丛宜龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹募耘帕校�(c)使所述生物学样品通过分离�？椋允股镅а吩谕ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒本艽懦。佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物在确定的流体流动路径内的运动而磁性地捕获所述复合物；(d)任选地，且优选地，使洗涤溶液通过所述确定的流体流动路径而所述复合物在所述流体流动路径内被磁性地捕获；(e)从磁场中移除分离�？椋缓�(f)从流体流动路径中回收所述靶生物实体/经标记的配体复合物。
3.根据权利要求1或2的方法，其中所述生物学样品为血液、血浆或血清样品。
4.根据权利要求3的方法，其中所述靶生物实体是核酸、蛋白质或碳水化合物。
5.根据权利要求3的方法，其中所述靶生物实体是稀少的或非常稀少的循环肿瘤细胞，或其亚细胞组分。
6.根据权利要求1或2的方法，其中所述生物学样品为母源血液样品，且所述靶生物实体为循环胎儿细胞。
7.根据权利要求1或2的方法，其中所述经磁性标记的配体包括与磁性粒子或珠偶联的、对于靶生物实体或靶生物实体上的决定簇有特异性结合亲和性的配体。
8.根据权利要求7的方法，其中所述配体是抗体、适体或核酸。
9.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)中使所述生物学样品与多于一种经磁性标记的配体接触。
10.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)中，使一个或多个等份的洗涤溶液在所述生物学样品之后通过确定的流体流动路径，并且使气泡在生物学样品和洗涤溶液之间、任选地在洗涤溶液的等份之间通过确定的流体流动路径。
11.根据权利要求1或2的方法，其中对靶生物实体/经标记的配体复合物的回收包括下列步骤通过使一个或多个等份的洗涤溶液通过流动路径、任选地有气泡在洗涤溶液的等份之间，而从确定的流体流动路径冲洗所述复合物。
12.权利要求11的方法，其中所述冲洗步骤包括回冲通过所述确定的流体流动路径。
13.根据权利要求1或2的方法，其中对靶生物实体/经标记的配体复合物的回收包括将所述复合物与未结合的经磁性标记的配体分离的进一步的步骤。
14.根据权利要求13的方法，其中所述分离步骤是物理分离步骤。
15.根据权利要求13的方法，其中在所述分离步骤中使用第二种结合剂来捕获靶生物实体/经标记的配体复合物并将其固定在固体支持物上。
16.根据权利要求1或2的方法，其中如下将在步骤(f)中从流体流动路径回收的靶生物实体/经标记的配体复合物进一步纯化使所回收的复合物通过置于磁性�？榈拇懦≈械牡诙掷肽？椋窝〉叵吹颖徊痘竦母春衔铮驮诖哟懦≈幸瞥诙掷肽？楹蟠铀龅诙掷肽？榛厥瞻猩锸堤�/经标记的配体复合物。
17.根据权利要求1或2的方法，其中在第一分离�？橹写友貉贩掷胙分琢鱿赴�(CTC)，经捕获和洗涤的CTC在所述第一分离�？橹斜涣呀獠⑶掖铀龅谝环掷肽？榛厥绽醋訡TC的裂解物质，使所回收的裂解物质与用于靶分子的经磁性标记的配体接触并且使其通过置于磁性�？榈拇懦≈械牡诙掷肽？椋源判缘夭痘翊判粤Ｗ雍退岷系陌蟹肿樱缓笤诮诙掷肽？榇哟懦≈幸瞥螅铀龅诙掷肽？榛厥沾判粤Ｗ雍徒岷系陌蟹肿�。
18.根据权利要求17的方法，其中所述靶分子为核酸、蛋白质或碳水化合物。
19.根据权利要求1或2的方法，其中如下在第一分离模块中从分离自血液样品的CTC 去除非特异性捕获的细胞例如淋巴细胞使回收自第一分离�？榈�、经捕获和洗涤的磁性结合的CTC与结合在大的非磁性珠上的抗淋巴细胞抗体相接触以标记淋巴细胞，使混合物通过置于磁性�？榈拇懦≈械牡诙掷肽？橐圆痘翊判越岷系腃TC并将它们与非磁性结合的淋巴细胞分离，然后在将第二分离�？榇哟懦≈幸瞥螅铀龅诙掷肽？榛厥沾判越岷系腃TC。
20.根据权利要求1或2的方法，其中在步骤(a)中，通过如下来增强所述生物学样品与所述经磁性标记的配体之间的接触(i)使生物学样品与经磁性经标记的配体在样品收集点接触，从而使靶生物实体/经标记的配体复合物在收集位点与测试位点之间的运输中形成，或(ii)介由置于含有生物学样品和配体的容器的基底之下的磁体来浓缩经磁性标记的配体，并且使容器中的样品和配体再循环，或者(iii)介由绕着或沿着流动路径移动的磁体而在生物学样品的流体流动路径中形成悬浮的、经磁性标记的配体粒子云。
21.用于从生物学样品中分离靶生物实体的仪器，其包括(i)具有确定的流体流动路径的分离�？椋�( )具有磁场的磁性�？椋龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹拇偶耘帕校黄渲兴龇掷肽？榫哂衅渲辛魈辶鞫肪段挥诖判阅？榈拇懦≈械牡谝晃恢煤推渲辛魈辶鞫肪洞铀龃懦∫瞥牡诙恢茫缓�(iii)控制器，其包括用于使生物学样品和任选地洗涤溶液通过由分离�？樘峁┑娜范ǖ牧魈辶鞫肪兜墓ぞ撸纱耸沟玫鄙镅а吠ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒保鲅肪艽判阅？榈拇懦�。
22.用于从生物学样品中分离靶生物实体的仪器，其包括(i)具有确定的流体流动路径的分离�？椋鋈范ǖ牧魈辶鞫肪栋ň哂泄餐肟诤凸餐隹诘亩喔龉茏丛�( )具有磁场的磁性�？椋龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹拇偶耘帕校渲兴龇掷肽？榫哂衅渲辛魈辶鞫肪段挥诖判阅？榈拇懦≈械牡谝晃恢煤推渲辛魈辶鞫肪洞铀龃懦∫瞥牡诙恢茫缓�(iii)控制器，其包括用于使生物学样品和任选地洗涤溶液通过由分离�？樘峁┑娜范ǖ牧魈辶鞫肪兜墓ぞ撸纱耸沟玫鄙镅а吠ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒保鲅肪艽判阅？榈拇懦 �
23.根据权利要求21或22的仪器，其中所述确定的流体流动路径是由惰性的、柔性塑料管道形成的。
24.根据权利要求23的仪器，其中所述管道具有0.5mm至5mm、优选0. 8mm至1. 6mm的内径(ID)，和50mm至200mm、优选IOOmm至125mm的长度。
25.根据权利要求21或22的仪器，其中所述磁性�？榘ㄖ辽倭礁鱿⊥劣谰么盘宓恼罅校龃盘宀⑴排帕胁⑶蚁嗔诘拇盘寰哂邢喾吹拇偶�。
26.根据权利要求21或22的仪器，其中所述分离�？橄喽杂诠潭ɑ蚓仓沟拇判阅？槭强梢贫�。
27.根据权利要求21或22的仪器，其中所述磁性�？橄喽杂诠潭ɑ蚓仓沟姆掷肽？槭强梢贫�。
28.根据权利要求1或2的方法，其包括下列步骤 (i)在第一点或收集点收集所述生物学样品；( )在所述第一点将所述样品加入包含所述经磁性标记的配体的收集介质中；(iii)随后将包含所述样品和经磁性标记的配体的所述收集介质运送至第二点或测试点；和(iv)在所述第二点完成所述方法。
29.根据权利要求观的方法，其中所述第一点和第二点是分离的，例如彼此间遥远或远离。
30.根据权利要求观或四的方法，其中一方面收集样品和将样品加入收集介质中的步骤，和另一方面完成所述方法的步骤，在时间上是彼此分离的，特别是由一段运输时间相分离，所述运输时间不仅足以将收集介质从第一点运送到第二点，还足以使得样品在运输中能够形成靶生物实体/经标记的配体复合物。
全文摘要
用于从生物学样品中分离靶生物实体的方法，其包括使所述生物学样品与对于所述靶生物实体或所述靶生物实体上的决定簇具有选择性结合亲和性的、经磁性标记的配体相接触，以形成靶生物实体/经标记的配体复合物；将具有确定的流体流动路径的分离�？橹糜诖判阅？榈拇懦≈校龃判阅？榘ㄖ辽倭礁龃盘宓恼罅校渲姓罅兄邢嗔诘拇盘逡韵喾吹募耘帕校皇顾錾镅а吠ü龇掷肽？椋允股镅а吩谕ü范ǖ牧魈辶鞫肪妒本艽懦。佣ü柚够蜃璋猩锸堤�/经标记的配体复合物在所述确定的流体流动路径中的运动而磁性地捕获所述复合物；从磁场中移除分离�？椋缓痛恿魈辶鞫肪吨谢厥账霭猩锸堤�/经标记的配体复合物。
文档编号G01N33/536GK102458665SQ201080026298
公开日2012年5月16日 申请日期2010年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者H·M·钱德勒, M·B·钱德勒 申请人:临床基因组学股份有限公司
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