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专利名称：膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法
技术领域：
本发明涉及膜蛋白质组学研究領域，具体涉及ー种膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法。
背景技术：
膜蛋白质组学研究中，大多数膜蛋白尤其是整合膜蛋白由于疏水性强，妨碍了它们的有效提取、溶解和酶解，从而影响了它们的分析鉴定。为了增加膜蛋白的溶解性，对膜蛋白分析鉴定用样品的处理通常采用往缓冲液中添加促溶剂(如去垢剂、有机溶剂和变性剂等)的方法。与其他种类的促溶剂相比，去垢剂由于促溶能力较强而应用较多。用去垢剂提取膜蛋白时，去垢剂的使用浓度一般为1_2%。其中，十二烷基硫酸钠(SDS)能有效裂解生物膜、提取膜蛋白，被认为是目前已知的提取膜蛋白能力最強的去垢剂。采用SDS处理膜蛋白分析鉴定用样品时，一般是将已经过富集纯化的膜片溶于含2%左右SDS的水溶液，离 心后取上清液作为样品，再将样品中SDS的浓度稀释至不高于0. 1%后进行液相酶解，酶解肽段用于液相色谱-质谱联用分析；或将含SDS的样品包埋入凝胶，然后反复洗涤胶块以去除其中的SDS，使SDS浓度降低至不高于0. 1%，然后进行胶内酶解，酶解肽段采用液相色谱-质谱联用分析；或用离子交換的方法使SDS浓度降低至不高于0. 1%，再进行酶解及液相色谱-质谱联用分析。此方法可用于膜蛋白分析鉴定用样品的处理，但由于样品中SDS浓度高于0. 1%即严重抑制蛋白酶活性，因此在蛋白质酶解前须将样品中SDS浓度降低至不高于0. 1%，常用稀释、凝胶介导样品净化或离子交換等方法降低样品中SDS浓度，但大幅度的稀释会使样品体积大大増加，从而增加酶解时酶的用量；且样品中的SDS并未彻底去除，样品体积过大也给后续分析鉴定带来困难；采用凝胶介导的样品净化方法或离子交換等其余方法，操作相对麻烦且易造成样品损失。由于SDS的存在会影响后续的蛋白质酶解和液相色谱-质谱联用分析，从而限制了它在膜蛋白分析鉴定用样品处理中的应用。脱氧胆酸钠(SDC)和一种商品化的酸不稳定去垢剂ALS (sodium 3 - [ (2 - methyl - 2 - undecyl -1，3 - dioxolan - 4 - yl) methoxyl] - I - propanesulfonate,.向品名为 RapiGest SF,又献一般以ALS或RapiGest SF称之，没有中文名称)是与SDS具有类似作用的去垢剂，它们可以在较高的浓度下使用而不影响蛋白酶的活性；且由于可在酸性条件下析出而易于从样品中除去，不会干扰后续的质谱分析；其不足之处是它们溶解生物膜、提取膜蛋白的能力不如SDS。鉴于目前使用的促溶剂要么提取膜蛋白的能力不强，要么会干扰后续分析鉴定，难以取得好的效果。因此，开发适宜的膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法，对于膜蛋白质组学研究具有十分重要的意义。

发明内容
本发明针对上述不足，提供ー种步骤简单、分析鉴定效果更好的膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法。本发明提供的膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法，依次包含以下步骤(1)用质量百分含量为I.0%的月桂酸钠(SL)溶液裂解经富集纯化的生物膜，提取膜蛋白，离心取上清液，得到蛋白质样品；
(2)将步骤(I)得到的蛋白质样品用缓冲液稀释至SL的质量百分含量为0.1%后，经酶解、酸化，萃取去除酸化后析出的月桂酸，再经冷冻真空干燥得分析用样品，分析用样品用于液相色谱-串联质谱联用分析鉴定。本发明根据结构决定功能的原理，通过对比分析SL，SDS和SDC的分子结构和性质特点，发现SL分子既具有与SDS分子相似的线性疏水性碳氢链尾部，又具有与SDC分子相似的羧基头部(见图1)，推测它极有可能在提取膜蛋白和不影响后续实验方面均表现出较为理想的性能，并通过实验证明了 SL在膜蛋白质组学研究中作为去垢剂的优良表现。我们进行了以下实验1、取等量(含50 y g蛋白质)经差速离心和蔗糖密度梯度离心分离富集的大鼠肝脏细胞膜片，分别用1.0%(质量百分比浓度，以下同)SDS，1.0% SL,I. 0% ALS, I. 0% SDC或5. 0% SDC溶解30分钟，超声处理2次，每次10分钟，12000转/ 分钟离心10分钟，取上清液冷冻真空浓缩。上清液蛋白质样品和沉淀分别用含4. 0%SDS的上样裂解液溶解后用SDS-PAGE分离(4. 8%浓缩胶，10%分离胶，厚度1mm)。电泳结束后用考马斯亮蓝染色，根据染色条带的多少和顔色深浅比较评估不同去垢剂溶解膜、提取膜蛋白的能力。实验结果表明，SL溶解生物膜提取膜蛋白的能力与SDS相当，高于ALS，明显高于SDC (见图2和图3) ;2、用N-a -苯甲酰精氨酸こ酯(Ar- a -benzoyl-L-arginineethyl ester，BAEE)作为胰蛋白酶的底物进行SL对酶活性影响的实验。该底物在胰蛋白酶作用下生成具有紫外吸收能力的产物N-a -苯甲酰精氨酸(N-a -benzoyl-L-arginine,BA)。分别在0%，0.1%，0.5%，1.0% SL和0. 1%SDS存在条件下，256 nm波长下在线测定BA生成的速度，从而得出不同浓度去垢剂对胰蛋白酶活性的影响。同时，用类似的方法測定去垢剂对胰凝乳蛋白酶活性的影响。不同的是以N-a-苯甲酰-L-酪氨酸こ酯(Ar-a -benzoyl-L-tyrosine ethyl ester,BTEE)为底物，256nm波长下在线检测产物N_苯甲酰-L-酪氨酸(N-Benzoyl-L-Tyrosine, BT)的生成速度。实验结果表明，SL对蛋白酶活性影响较小=SL浓度为0. 5%吋，对胰蛋白酶的活性几乎没有影响，SL浓度为I. 0%吋，胰蛋白酶仍保留80%以上的活性，0. 1%浓度的SL能使胰蛋白酶活性增高。SL对胰凝乳蛋白酶活性的影响更小(见图4、图5);3、取等量(IOOfmol)牛血清白蛋白(BSA)的胰蛋白酶酶解样品，分别用于下述实验A:作为对照，直接用于液相色谱-串联质谱联用分析；B和C:分别添加0. 1%和0. 5% SL后，不经萃取处理直接用于液相色谱-串联质谱联用分析；D-F:分别添加0. 1%和0. 5% SL和I. 0%SL后，用萃取法去除样品中的SL后用于质谱分析。根据质谱图中多肽离子峰的数目和信/噪比评估萃取去除SL的效果及其与液相色谱-串联质谱联用分析的兼容性。实验结果表明，SL在酸性环境中不溶，可用萃取法将其从样品中去除，因而不会影响后续的液相色谱-串联质谱联用分析(见图6-11)。本发明提供的膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法，用SL作去垢剂，与用SDS作去垢剂的膜蛋白的分析鉴定方法的相同之处在于二者均需在较高浓度下溶解膜片、提取膜蛋白，其中SDS的常用浓度为2%左右；SL可在1.0%浓度下使用。其不同之处在于由于样品中SL浓度即使高达0. 5%也不影响常用蛋白酶(膜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的活性，故用含SL不高于0. 5%的缓冲液提取膜蛋白后，不需稀释或进行其他样品净化处理，即可直接加酶进行蛋白质酶解，从而大大筒化分析鉴定过程；即使用0. 5%以上的SL提取膜蛋白，也只需适当稀释即可进行酶解，若稀释至0. 1%时反而能提高常用蛋白酶(膜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的活性。SL不仅可以有效裂解生物膜、提取膜蛋白，还可以提高蛋白酶的活性、促进膜蛋白的溶解和酶解，且因具有酸不溶性而可方便地从样品中去除，因而不会对后续的液相色谱-质谱联用分析造成干扰，从而使得膜蛋白尤其是强疏水性的整合膜蛋白的分析鉴定效果优于现有样品处理方法的效果。因此，本发明提供的膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法，采用SL作去垢剂，不仅能有效溶解膜片、提取膜蛋白，且不会降低蛋白酶活性，也不会干扰后续的液相色谱-质谱分析，因而有利于简化分析鉴定过程，并获得更好的分析鉴定效果。


图I为SDS、SDC和SL的分子结构。图2为不同浓度SDS、SDC和SL溶解生物膜提取膜蛋白，离心后上清液的SDS-PAGE分析图谱。
图3为不同浓度SDS、SDC和SL溶解生物膜提取膜蛋白，离心后的沉淀用样品裂解液处理后的SDS-PAGE分析图谱。图4为SL对胰蛋白酶活性的影响。图5为SL对胰凝乳蛋白酶活性的影响。图6为BSA酶解产物的MALDI-T0F质谱分析图。图7为添加0. 1%SL的BSA酶解产物的MALDI-T0F质谱分析图。图8为添加0. 5%SL的BSA酶解产物的MALDI-T0F质谱分析图。图9为添加0. 1%SL的BSA酶解产物，经酸化和萃取去除SL后的MALDI-T0F质谱分析图。图10为添加0. 5%SL后的BSA酶解产物，经酸化和萃取去除SL后的MALDI-T0F质谱分析图。图11为添加I. 0%SL后的BSA酶解产物，经酸化和萃取去除SL后的MALDI-T0F质谱分析图。
具体实施例方式为了便于理解本发明，以下用实施例予以说明。需要说明的是，以下实施例仅作为列挙，不应视为对本发明的范围的限制。实施例I 由肌红蛋白、细菌视紫红质和牛血清白蛋白ニ种蛋白质各5 ii g组成的标准蛋白质混合物。其中的肌红蛋白、细菌视紫红质和牛血清白蛋白分别为难酶解蛋白、疏水性多跨膜蛋白和可溶性蛋白的代表。将上述标准蛋白质混合物溶于含I. 0% (质量百分比浓度，以下同)SL的50 mM的NH4HCO3溶液(酶解前稀释至SL为0. 1%)，再经酶解、酸化，萃取去除酸化后析出的月桂酸，再经冷冻真空干燥，得分析用样品，分析用样品用于液相色谱-串联质谱联用分析鉴定。另将上述标准蛋白质混合物分别溶于50mM的NH4HCO3(pH 7. 8)溶液，含I. 0% ALS的50 mM的NH4HCO3溶液(酶解前稀释至ALS为0. 1%)和含1% SDC的50 mM的NH4HCO3溶液，酶解、酸化与上同，酸化后SDC通过离心去除，分析鉴定与上同，经不同处理方法得到的样品的分析鉴定结果见表I。
权利要求
1.一种膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法，依次包含以下步骤 (1)用质量百分含量为1.0%的月桂酸钠溶液裂解经富集纯化的生物膜，提取膜蛋白，离心取上清液，得到蛋白质样品； (2)将步骤(I)得到的蛋白质样品用缓冲液稀释至月桂酸钠的质量百分含量为O.1%后，经酶解、酸化，萃取去除酸化后析出的月桂酸，再经冷冻真空干燥，得分析用样品，分析用样品用于液相色谱-串联质谱联用分析鉴定。
全文摘要
本发明涉及膜蛋白质组学研究领域，具体涉及一种膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法。本发明提供的膜蛋白分析鉴定用样品的处理方法，用SL为去垢剂，用于膜蛋白的分析鉴定。由于SL分子既具有与SDS分子相似的线性疏水性碳氢链尾部，又具有与SDC分子相似的羧基头部，经实验表明，与ALS和SDC相比，SL在膜蛋白尤其是具有高疏水性和/或多跨膜区的整合膜蛋白的鉴定中具有明显的优势。本发明的方法步骤简单、分析鉴定效果更好。
文档编号G01N30/06GK102854272SQ20121032898
公开日2013年1月2日 申请日期2012年9月7日 优先权日2012年9月7日
发明者王贤纯, 梁宋平, 林勇 申请人:湖南师范大学