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专利名称：：戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫测定试剂盒及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及体外诊断免疫分析
技术领域：
，属于血清(桨)中戊型肝炎IgG抗体检测的化学发光酶免疫分析测定试剂盒。同时，本发明提供了一种戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。
背景技术：
：戊型肝炎病毒(hepatitisEvirus,HEV)是无包膜的单正链RNA病毒，经粪口途径传播，引起的急性戊型肝炎(hepatitisE,HE),多表现为急性黄疽型肝炎，易发展为亚急性重症肝炎或淤胆肝炎。近年来呈逐年上升趋势。患者主要为成年人，病死率较高，尤其孕期最后3个月的妊娠妇女患病后，病死率可达10%-39%,危害严重。戊型病毒性肝炎，首先在印度次大陆发现，中亚、东南亚、非洲、印度次大陆均有较大流行的报道。多数爆发流行为水源性的。食源性的报道亦见诸文献。我国人群戊型肝炎的感染率约18%。急性散发性肝炎中戊肝约占10%,是我国乙类法定传染病之一。通过了解戊型肝炎病毒(HEV)感染后抗-HEVIgG存在持续的时间，以准确、客观评估抗-HEVIgG在戊型肝炎(戊肝)诊断中的意义。目前戊肝的诊断主要是通过ELISA(酶联免疫法)检测抗HEV抗体，其次有放射免疫分析(RIA)、免疫印迹测法、RT-PCR方法、实时荧光RT-PCR方法等。免疫印迹测法灵敏度不如ELISA、RIA、RT-PCR及实时焚光RT-PCR方法，ELISA试剂灵敏度不如RIA、RT-PCR及实时荧光RT-PCR试剂，对HEV感染窗口期患者不能提早诊断；而常规RIA灵敏度虽高，半衰期短，容易形成放射污染；RT-PCR及实时荧光RT-PCR方法操作繁瑣，稳定性差、仪器昂贵。鉴于此本发明建立了一种快速、敏感、特异性强的化学发光酶促免疫分析方法来检测戊型肝炎病毒抗体。即有放射免疫分析、荧光免疫分析等方法的高度灵敏性，又克服了这些方法的缺点。现在，化学发光免疫分析试剂盒多为进口封闭式全自动化学发光测量系统，设备昂贵，使用成本高，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作。本发明的试剂盒采用微孔板化学发光免疫分析技术，既可应用于开放式的半自动化学发光测量仪，也可用于全自动的测量系统，可实现大批量快检测，使用成本低，更能适合在大、中、小医院推广应用。
发明内容本发明采用间接法原理，利用化学发光酶免疫分析技术，以酶标记抗原或抗体与样品中待测物发生免疫反应，所形成的免疫复合物上的酶再作用于发光底物,产生的光信号强度与参与反应的酶分子数(活性)成正比，根据发光信号可判断待测物的浓度或含量的变化。本发明的目的是:提供一种化学发光免疫分析测定戊型肝炎病毒IgG抗体的试剂盒。本发明试剂盒包括戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品；包被固相载体；酶标记结合物；样品稀释液；化学发光底物液；以及浓缩洗涤液。根据本发明的试剂盒，其中，所述固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1，2-二氧乙烷类衍生物，为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷(AMPPD)、CSPD或CDP-Star。本发明的再一目是提供本发明试剂盒的制备方法。采用间接法原理，利用化学发光酶免疫分析技术，间接方法检测血清(浆)样本中的戊型肝炎病毒IgG抗体。该发明试剂盒的制备方法是以戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性血清制备的对照品；以重组戊型肝炎病毒抗原包被固相载体；以酶标记抗人IgG抗体(单抗或多抗)；配制样品稀释液；配制上述酶所作用的化学发光底物液；配制浓缩洗涤液；分装上述各组份；并组装为成品。根据本发明的方法，所述固相载体包被的步骤2)包括以下步骤用0.1MpH值为9.0的磷酸氢二钾(K2HP043H20)緩冲液配制成所需浓度的重组戊型肝炎病毒抗原包被液，并将包被液负载于固相载体上；再用含0.1%酪蛋白，0.01%明胶，0.l%Proclin300,pH值为7.0-7.5，浓度为0.01M的磷酸盐緩沖液作为封闭液封闭上述的固相载体。在上述方法中，并对所述抗原包被的固相栽体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒；所述结合物为辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶；所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺，其中所述1,2-二氧乙烷类衍生物为(金刚烷)-l，2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star，--进行了优选。具体的，上述试剂盒包括戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品、直接包被重组戊型肝炎病毒抗原微孔板、样品稀释液、酶标记物、化学发光底物液与浓缩洗涤液等。其中，所述戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品为经HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗体测定均为阴性的多份混合血清，6(TC灭活1小时，适度稀释配制(抗-HEVIgG抗体阳性效价>1:1000);包被的微孔板为48或96孔的微孔板条，标记抗体的酶为偶联辣根过氧化物酶(HRP),化学发光底物液为鲁米诺，浓缩洗涤液为PBST。本发明"戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒"可以非常专一地检测出感染戊型肝炎病毒后人体中的戊型肝炎病毒IgG抗体，可以根据测定戊型肝炎病毒IgG抗体变化情况，判断治疗效果及病情变化。它具有简便、快速、灵敏、稳定等优点。该戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光测定试剂盒的各项指标均超过ELISA试剂盒的分析水平，可替代RIA试剂及ELISA试剂。并且，本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用。根据本发明的试剂盒，载体上包被的抗原与被测样品的戊型肝炎病毒IgG抗体结合，酶标记的二抗再与固相上结合的抗体结合，因此本发明采用的"间接法"反应模式，应用的是酶催化发光底物，通过检测发光底物产生的光信号代替酶免疫分析中的显色底物，因而具有特异性、灵敏度高于现今的酶免疫分析试剂，可为戊型肝炎病毒IgG抗体的诊断提供更为特异、快速、可靠的依据。本发明试剂盒既有效地利用了化学发光技术原理，又确保了检测的灵敏度。另外，这种模式还便于操作和生产。具体实施例方式实施例1制备本发明的戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒在本发明的研究过程中，本发明的发明人首先对所用的原材料进行了筛选实验和质量鉴定，包括标记抗体与包被抗体的活性、载体(如不透光的白色微孔板)的吸附性能和变异大小、HRP的活性、化学发光底物的发光强度及发光持续时间等。然后对包被方法进行了研究，用不同的包被緩冲液和保护液进行实验，选择出最适合的包被緩冲液和保护液，通过抗体不同包被浓度实验找到最佳的浓度条件。对于HRP的标记可以有不同的方法，通过反复探索和对比实验最终找到了简便、产率高、成本低、质量可靠的标记方法，并对不同的酶稀释液进行了长期的考察实验，配制出了能够使酶标记物长期保持活性稳定的稀释液一、酶标抗体制备抗人IgG抗体用戊二醛法与辣根过氧化物酶偶联，具体步骤包括:取HRP10mg溶于0.4ml，0.25Mol/LpH6.8PBS液中或0.Q5Mol/LpH9.6石友酸盐緩沖液中，加入25°/。戊二醛0.lml，37。C温育2h后加入冰冷的分析纯的无水乙醇2ml，2500r/min离心沉淀10min-15min，倾去溶液。沉淀以80%乙醇4ml-5ml混悬，同上离心，倾去乙醇，将管倒置，使乙醇充分流出。沉淀用lml0.05Mol/LpH9.6碳酸盐緩沖液溶解，加入0.5ml-lml抗IgG抗体溶液(含抗体15mg左右)，放在冰箱内过夜后，力口KH2P04，使其pH值近中性即可应用，加等体积甘油，-20。C以下保存。酶标抗人IgG抗体浓度选定用酶标记抗体稀释液将酶标记的抗人IgG抗体，稀释不同浓度，采用方阵滴定法选择酶标抗体的工作浓度为1:20000。酶标单抗稀释液基于1000ml酶标抗体稀释液，其组份含量为2.9gNa2HP0412H20、0.3gNaH2P042H20、9gNaCl、25gBSA、lmlProclin300、lmlTween-20，称量各组份，于洁净容器内，用双蒸水溶解，调为pH7.2~7.4,定溶10Q0ml。二、戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品的制备混合6份以上经ELISA试剂盒检测戊型肝炎病毒IgG抗体阳性血清或阴性血清，经HBsAg、抗-HIV、抗-TP以及抗-HCV抗体阴性血清，6(TC灭活1小时，过滤除菌、分装，1氐温冻存。三、固相包被板的制备包被，在包被液中加入适量重组戊型肝炎病毒抗原混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔100jaL,4'C放置吸附24小时。基于1000ml包被溶液，其各组份含量为22.82g磷酸氢二钾(1(2肝04.3H20)、于洁净容器内，用双蒸水溶解，调为pH9.0~9.3定溶1000ml。每孔分别加入封闭液120nL，4。C放置24小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍千。室温除湿干燥24小时。然后进行封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2~8。C保存。基于1000ml封闭溶液，其各组份含量为0.36gNaH2P042H20、2.76gNa2HP0412H20、lg酪蛋白、0.lg明胶、lmlProclin300,称量各组份，于洁净容器内，用双蒸水溶解，调为pH7.0定溶1000ml。四、样品稀释液基于1000ml样品稀释液，其各组份含量为0.59gNaH2P04.2H20、5.8gNa2HP04.12H20、30gNaCl、10gBSA、ImLTween-20、lmlProclin300,称量各组份，于洁净容器内，用双蒸水溶解，调pH至7.2~7.4定溶1000ml。五、化学发光底物A液基于lOOOmlA液组份含量为lOraM鲁米诺1.7716g、0.3mM4-羟基联苯0.051g、0.05mM4-碘苯硼酸0.012g、硼酸11.4g、硼砂4.9g。称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为8.0~10.0,定容l000ml。六、化学发光底物B液基于1000mlA液组份含量为3.5mM过氧化脲0.329g、lml0,l°/。Tween20、51.58gNa2HP04.12H20、8.74gNaH凤■2H20、称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为7.0-7.6,定容1000ml。称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为8.0-10.0,定容1000ml。使用时A液与B液等比例混合。七、20倍洗涤液基于1000ml20倍洗涤液各组份含量为58gNa2HP0412眼2gNaH2P04.2眼160gNaCl、lmLTween-20、lmLProclin300。称量好各组份量放入洁净容器中，加双蒸水，溶解混匀，调整pH值为7.2~7.4,定容1000ml。八、半成品及成品组成上述步骤所得产品分装即为半成品。半成品通过检测特异性、精密性、灵敏度及稳定性，指标检定合格后组装为成品。组装后的成品试剂盒测定特异性、精密性、灵敏度及稳定性各项指标合格后才能使用。本发明的发明人还对试剂盒的反应模式和反应条件进行了实验研究，最终确定了间接法反应模式，并就不同的反应时间对实验结果的影响进行了实验，确定最适合的反应时间。通过对化学发光底物液发光持续时间的测定及不同发光时间对测定值的影响实验表明在加入化学发光底物液后5-25分钟之间进行测量为最佳，其结果也较为准确。实施例2~3制备本发明的戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除以碱性磷酸酶标记戊型肝炎病毒抗体、以AMPPD作为化学发光底物、以塑料珠、塑料管作为载体、包被液的pH值为4.5、封闭液的pH值为7.5外，其余均以与实施例1相同的方法制备戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例4制备本发明的戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒除以磁性颗粒作为固相载体，采用EDC偶联法制备磁颗�？乖�固相载体外，其余均以与实施例1相同的方法制备戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒。实施例5本发明的试剂盒的使用方法以上实施例1制备的戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒的具体操作如下1)自4'C冰箱中取出试剂盒，室温平衡15分钟。2)取出包被板条，插入板架上。3)除空白孔外，反应孔中分别加阴、阳对照品各两孔，每孔100ul，各孔加待检样本10ul，样品稀释液100ul，用微量震荡器充分振荡混匀，37。C温育0.5小时。4)甩去反应液，洗板5次，每孔加然后加酶标记物100用孩i量震荡器充分振荡混匀，37。C温育0.5小时。5)甩去反应液，洗板5次，最后在干净的吸水纸上扣千。6)各孔加化学发光底物液A、B各50mL，用微量震荡器充分振荡混合均匀，室温(20~25。C)避光反应5分钟。7)必须于加化学发光底物液后的第5~25分钟内测量，在化学发光测量仪上依序测量各孔的发光强度(RLU),测量时间l秒/孔。8)CO值=2.1^，RLU值>C0值则样本判定为阳性样本；RLU值<CO值则样本判定为阴性样本。实施例6本发明的试剂盒的方法学鉴定按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，见下表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>说明"戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"的灵敏度、特异性、精密性以及稳定性完全符合检定要求。实施例7本发明的戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒的临床应用与ELISA试剂盒比较临床医院使用实施例1的戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒和ELISA试剂盒检测临床样本652份，以对比两种试剂盒检测的符合率。一、临床血清标本的来源医院临床收集戊型肝炎病毒患者、非戊型肝炎病毒患者及正常人的样本。二、使用戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒与ELISA试剂盒比较1、方法临床医院分别使用本发明实施例1制备的"戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"(按其说明书操作)和ELISA试剂盒(按其说明书操作)检测临床样本652份(乙型肝炎病毒抗原阳性105例、曱型肝炎抗体阳性95、正常人245例、戊型肝炎IgG抗体阳性205例)，以对比两种试剂盒检测的符合率。2、结果临床医院使用实施例1的"戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"和ELISA试剂盒对比检测结果(见表2)表2.临床医院对比两种方法比较_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>备注本发明试剂检出曱肝患者中1例戊型肝炎IgG抗体阳性，经临床确认为戊型肝炎IgG抗体阳性。对比试剂检出乙肝阳性血样1例戊型肝炎IgG抗体阳性，经临床确认为阴性。临床医院使用"戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光法免疫分析测定试剂盒"与ELISA试剂盒对比检测结果表明本发明试剂盒的临床检测指标均达到或超过了ELISA法，并且本发明试剂盒特异性100%,敏感性100%。对本发明试剂盒检出曱肝患者l例戊型肝炎病毒IgG抗体阳性，经临床确认为戊型肝炎IgG抗体真阳性；对比试剂检出乙型肝炎患者血清样l例阳性，经临床确认为戊型肝炎IgG抗体假阳性。本发明的戊型肝炎病毒IgG抗体(抗-HEVIgG)化学发光免疫分析测定试剂盒特异性，敏感性，抗干扰性均好于ELISA试剂，可以应用于临床戊型肝炎疾病诊断。权利要求1、一种戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品；包被固相载体；酶标记结合物；样品稀释液；酶所作用的化学发光底物液；浓缩洗涤液。2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被固相载体为重组戊型肝炎病毒抗原直接包被的微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述酶标记结合物为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人IgG(单抗或多抗)。4、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。5、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包括A液和B液，其中，所述化学发光底物A液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘代苯基硼酸、0.2MpH8.7硼酸-硼砂緩冲液，其pH值为8.0~10.0;所述化学发光底物B液，包括3.5mM过氧化脲、0.l%Tween20、0.2MpH7.2磷酸盐緩冲液，其pH值为7.0-7.6。6、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤以戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性血清制备的对照品；以重组戊型肝炎病毒抗原直接包被固相载体；以酶标记抗人IgG抗体(单抗或多抗)；配制样品稀释液；配制上述酶所作用的化学发光底物液；配制浓缩洗涤液；分装上述戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品、样品稀释液、酶标记的抗人IgG抗体、该酶所作用的化学发光底物液和浓缩洗涤液；并组装为成品。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述包被固相栽体的步骤2)采用以下方法用0.1MpH值为9.0的磷酸氢二钾(1(2肝04.3H20)緩冲液配制成所需浓度的重组戊型肝炎病毒抗原包被液，并将包被液负载于固相载体上；用含O.1%酪蛋白，0.01。/。明胶pH值为7.0~7.5，浓度为0.01M的磷酸盐緩冲液作为封闭液封闭上述的固相载体。8、如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述包被戊型肝炎病毒抗原的固相载体为微孔板、塑料珠、塑料管或磁性颗粒。9、如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体(多抗或单抗)；所述化学发光底物为1,2-二氧乙烷类衍生物、鲁米诺或异鲁米诺。进一步，所述l,2-二氧乙烷类衍生物，为(金刚烷)-l,2-二氧乙烷、3-(2'-螺旋金刚烷)-4-曱氧基-4-(3〃-磷酰氧基)苯基-l,2-二氧乙烷、CSPD或CDP-Star。全文摘要本发明公开了一种戊型肝炎病毒IgG抗体化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。本发明试剂盒特征包括戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性对照品；包被固相载体；酶标记结合物；样品稀释液；化学发光底物液；以及浓缩洗涤液。本发明试剂盒制备的方法包括以戊型肝炎病毒IgG抗体阴、阳性血清制备的对照品；以重组戊型肝炎病毒抗原包被固相载体；以酶标记特异性抗人IgG抗体；配制样品稀释液；配制化学发光底物；配制浓缩洗涤液；分装上述各组份；并组装为成品。本发明的试剂盒可为戊型肝炎的预防、诊断、治疗提供最为直接的临床依据。文档编号G01N33/576GK101551396SQ20081010326公开日2009年10月7日申请日期2008年4月2日优先权日2008年4月2日发明者于尚永,宋胜利,应希堂,杨俊峰,胡国茂,郑金来申请人:北京科美东雅生物技术有限公司