专利名称：：基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法
技术领域：
：本发明属于生物工程
技术领域：
，特别是指一种基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法
背景技术：
：本项目主要在基因工程药物领域创立抗体芯片检测技术平台，自主研发抗乙肝疫苗抗体芯片检测试剂盒(抗体芯片)完全是由中国人自主开发，应用这一芯片，可通过多种方式、多种渠道、多测面检测乙肝疫苗制品的效价和含量，将检测灵敏度由ug提高到ng级，从而达到更准确、更全面的效果3其检测结果即可定性也可定量。抗乙肝疫苗抗体芯片检测试剂盒(抗体芯片)对促进我国生物高技术前沿领域的发展具有重大鼓舞作用，对提升我属生物芯片技术、产品和巿场的国际竟争力具有重大意义，此方法完全符合分子免疫学原理。目前国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了生物芯片技术来寻找药物靶标，查检药物的毒性或副作用及进行药物产品的定量和定性。用芯片技术进行大规模的药物筛选可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，从而带动创新药物的研究和开发。
发明内容本发明的目的在于提供一种基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法。本发明的整体技术构思是利用细胞融合、亚克隆及酶联免疫吸附实验进行特异性筛选技术，获得高效价.高特异性抗人基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体，由于此单抗效价高、特异性好，可直接应用二芯片的点样，结合CY3标记的基因工程药物乙肝疫苗与被检产品建立抗体芯片竟争抑制法检测基因工程乙肝疫苗含量的方法。抗体芯片竟争抑制法检汰'基因工程乙肝疫苗含量具有灵敏度高，特异性好、操作简单、高通量等优点，可用于生产线的监测和质控。基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，它包括如下工艺步骤(1)动物免疫将高纯度的人基因工程药物乙肝疫苗lml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人神经巢蛋白，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1:IO比例混合，30秒内逐渐加入45。/。PEG(分子量4000)，静止90秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择培养基进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第七天时，吸�。タ着嘌宓目字谐鱿挚寺∠赴氐呐嘌锨逵妹噶庖呶绞笛榉椒觳饪固搴浚邢尴∈徒腥窝强寺∩秆。揽固宓姆置谇榭錾秆〕龈咝Ъ鄣目固宸置诳祝字邢赴┐笈嘌「咝Ъ郏咛匾煨缘南赴暝倮┐笈嘌⒍炒妫�(5)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A28tom时收集，1.44(吸光单位)浓度为lmg/ml。(6)将基因工程乙肝疫苗进行CY3标记(7)基因工程药物乙肝疫苗微阵列点样一张芯片点100个点，检测线性范围0。01~10ng/ml。本发明的具体工艺步骤和各步骤中的工艺参数是=步骤U)将基因工程药物乙肝疫苗lml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在812周，每只腹腔注射0.2ml,间隔2周注射一次；釆用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清。步骤(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨喧细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为9xl05/3il细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞。步骤(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml,以HAT选择培养基按36%的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。步骤(4)中是将细胞培养至覆盖0%~20%孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。步骤(5)中选用的BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5xl()5杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位=1.44时浓度为lmg/ml。步骤(6)中选用的是CY3对基因工程药物乙肝疫苗的标记步骤(7)中选用基因工程药物乙肝疫苗微阵列点样一张芯片点100个点，检测线性范围0。01~10ng/ml。本发明所取得的实质性特点和显著的技术进步在于所获得的抗人基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体经AKTA蛋白纯化仪FPLC纯化，其效价高、特异性非�：茫芍苯咏邢尴∈偷目固宓阌谛酒希氡昙堑囊腋我呙绾椭破方性咏唬柚壳跋冉男酒觳庖瞧鹘屑觳�。此技术与传统的检测方法比较，具有快速、操作便捷、高通量检测的特点；并可快速、准确地进行定性和定量检测。本发明所公开的方法是将高纯度基因工程药物乙肝疫苗经免疫动物、细胞融合、克隆化培养、以及大量的组织细胞原位特异性筛选从而获得高效价、高特异性的抗人基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体，此抗体可直接应用于临床检测和基础研究。单克隆抗体在生物学和医学研究领域中具有极大的应用价值，是亲和层析中重要的配体，是免疫组化中主要的抗体，是免疫检验中的新型试剂，是生物治疗的导向武器。作为基因工程药物乙肝疫苗的检测试剂，抗人基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体可以充分发挥其优势。单克隆抗体的特异性强，可将抗原抗体反应的特异性大大提高，减少了可能的交叉反应，使试验结果可信度更大。单克隆抗体的均一性,生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。其各项指标如下1、免疫BLAB/C鼠的抗血清酶联免疫吸附实验效价大于1:S0002、阳性克隆孔酶联免疫吸附实验效价大于l:le03G3、阳性克隆孔腹水酶联免疫吸附实验效价大于1:5G冊04、阳性克隆孔特异性表达与基因工程药物乙肝疫苗制品呈阳性表达。与其它基因工程药物人胰岛素、人生长激素、干扰素、人促红细胞生成素(Epo)、GM-集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-2(IL-2)、白介素-11(IL-ll)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)呈阴性表达如下<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>具体实施例方式以下结合实施例对本发明做进一步描述基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤_(1)动物免疫将高纯度的人基因工程药物乙肝疫苗lml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人基因工程药物乙肝疫苗，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1:IO比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择培养基进行细胞培养；(4)篩选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第七天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛�。揽固宓姆置谇榭錾秆〕龈咝Ъ鄣目固宸置诳祝字邢赴┐笈嘌缓蠼锌乖匾煨悦庖咦橹г徊舛ǎ「咝Ъ郏咛匾煨缘南赴暝倮┐笈嘌⒍炒妫�(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1:l師00的l性孔的上清，与多种其它基因工程药物进行特异性筛选。(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，1."(吸光单位)浓度为lmg/ml。步骤(1)将高效价、高特异性抗人基因工程药物乙肝疫苗lml加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在9周，每只腹腔注射0.2ml,间隔2周注射一次；测定抗血清。步骤(2)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成a、包被以50麵ol/L、pH=9的碳酸盐缓冲液将步骤(1)中的高纯度基因工程乙肝疫苗l:500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封4i:保存备用。b、封闭每孔加入P'H为-7。4的磷酸盐缓冲液200jul洗涤、内含1%山羊血清；c、加样'每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50ial(1:5000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；d、加入酶标二抗每孔1Q0pl，洗涤；e、显色每孔加入底物100n1;f、比色以空白调零，405謹波长测定光密度(0。D);g、结果判断P/》测定标本0。D均值/阴性血清0。E均值，P/N^2。l为阳性。步骤a中的聚乙烯板规格为200jul/孔、真空抽千温度为4'C,洗涤釆用0。05%的Tween-20磷酸盐缓冲液洗涤3次。步骤b中的工艺参数为每孔加入pH-7。4、含PA山兰血清磷酸盐缓冲液200pl,温度为37i:、时间1小时，洗涤3次。步骤c中的工艺条件为每孔加入1:5000稀释后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50ji1,每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液X温度为37°C、时间为1小时，洗涤3次。步骤ci中的工艺条件加入酶标二抗每孔100jul，温度为37°C、时间为1小时，洗涤3次。步骤e中的工艺条件为室温、时间为10分钟5然后使用终止液终止反应，经酶标仪在波长450nm处读取光密度值。步骤(3)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为9x107ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞。步骤(4)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1:10的比例混合，加入PEG使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第1分钟滴加4.5ml培养液；间隔2分钟滴加5ml培养液，然后加培养液50ml,以HAT选择培养基按36%的孔为1个细胞/孔进行细胞培养。步骤(5)中是将细胞培养至覆盖10%孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况筛选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，与多批次基因工程乙肝疫苗经ELISA筛选呈阳性表达。然后确定高分泌、高特异性细胞株扩大培养或冻存。步骤(6)中选用的BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5xl()5杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集15ml的腹水，使用AKTA蛋白纯化仪FPLC将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，吸光单位=1.44时浓度为lmg/ml。步骤(7)中选用的CY3标记基因工程药物乙肝疫苗步骤(8)中选用的基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗^本徽阵列点样一张芯片点100个点，从第一个点至第IOO个点每一个点的含量以10pg/ml递增，检测线性范围0。01~10ng/ml。步骤(9)中选用的与其它基因工程药物进行特异性篩选。此基因二程药物乙肝疫苗抗体芯片经30批次的基g工程药物乙肝疫苗产品的特异性筛选表达均为阳性，与9种251批次的其它基因工程药物进行特异性筛选阳性表达为0。表明此芯片特异性很高5适合提供绘基因工程药物企业进行基因工程药物乙肝疫苗的鉴定和质控评价，此抗体还可制成免疫组化或酶联免疫吸附实验试剂盒开展医学基础研究。权利要求1、基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于它包括如下工艺步骤(1)动物免疫将高纯度的人基因工程药物乙肝疫苗1-10ml充分乳化，免疫与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，每只腹腔注射乳化后的高纯度人基因工程药物乙肝疫苗，用酶联免疫吸附实验方法测定其抗血清；(2)分离脾细胞取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后的Sp2/0细胞调整为细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞并制成细胞悬液；(3)细胞融合将具有较高活性Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞悬液按1∶10-100比例混合，加入聚乙二醇(美国Sigma公司出品)使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中滴加培养液，以HAT选择性培养基(美国�？寺」境銎�)进行细胞培养；(4)筛选杂交瘤细胞待融合的细胞培养至第5-10天时，吸取96孔培养板的孔中出现克隆细胞簇的培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，经有限稀释进行三次亚克隆筛�。揽固宓姆置谇榭錾秆〕龈咝Ъ鄣目固宸置诳祝字邢赴┐笈嘌缓蠼锌乖匾煨悦庖咦橹г徊舛ǎ「咝Ъ郏咛匾煨缘南赴暝倮┐笈嘌⒍炒妫�(5)单克隆抗体特异性筛选选经酶联免疫吸附实验检测抗体效价大于1∶10000的阳性孔的上清，与多厂家、多批次的基因工程药物乙肝疫苗进行特异性和效价筛选。(6)单克隆抗体纯化保存选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中，一周后收集小鼠的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪(美国通用公司制造)将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280nm时收集，1.44(吸光单位)浓度为1-10mg/ml。(7)CY3标记基因工程药物乙肝疫苗用CyDyeDIGEFluor，Cy3minimaldye系统采用标准方法将基因工程药物乙肝疫苗标记上CY3。(8)基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体微阵列点样一张芯片点100个点，从第一个点至第100个点每一个点的含量以10pg/ml递增，检测线性范围0.01～10ng/ml。(9)与其它基因工程药物进行特异性筛选。2、根据权利要求l所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)将高效价、高特异性基因工程药物乙肝疫苗1-lOffll加等量的完全福氏佐剂并经充分乳化，与所用骨髓瘤细胞同源的BALB/c健康小鼠，鼠龄在822周，每只腹腔注射0.2-0.5ml，隔周免疫一次，第三次免疫后第三天抽取外周血；测定抗血清。U)基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体微阵列点祥一张芯片点100个点，检测线性范围0。01~10ng/證l。3、根据权利要求1或2所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(1)进行完毕后采用酶联免疫吸附实验方法测定抗血清，该方法由如下操作步骤组成a、包被以5Ommol/L、pH=9的碳酸盐缓冲液将步骤(1)中的高纯度基因工程药物乙肝疫苗l:500稀释，包被96孔聚乙烯板，真空抽干，密封rC保存备用。b、封闭每孔加入pH为7。4的磷酸盐缓冲液200ni1洗涤、内含1%山羊血清；c、力口样每孔加入第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100in1(h5000-10000稀释)，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，洗涤；d、加入酶标二抗每孔100-2冊]ul，洗涤；e、显色每孔加入底物50-100pl;f、比色以空白调零，405謹波长测定光密度(0。D);g、结果判断:P/N-测定标本0。D均值/阴性血清G。iD均值，P/N》2。l为阳性。4、根据权利要求3所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤c中的工艺条件为每孔加入1:5000-10000稀释后的第三次免疫后3天的小鼠外周血清50-100^1，每板设一正常对照、阳性对照及空白(磷酸盐缓冲液)，温度为37r、时间为l小时，洗涤3次。5、根据权利要求3所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法5其特征在于所述的步骤e中的工艺条件为室温、时间为G分钟，然后使用终止液终止反应，经酶标仪在波长'450iMi处读取光密度值。6、根据权利要求1所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(2)中取未免疫的BALB/c健康小鼠腹腔巨噬细胞，铺植96孔培养板，将换液后15小时的Sp2/0细胞调整为1-9x107ml细胞悬液，分离免疫的小鼠脾细胞1-9^105—Vml。7、根据权利要求l所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(3)中具有高活性的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞的比值按1:10-100的比例混合，30-60秒内逐渐加入450露(分子量:4000)，静止90-120秒，使细胞彼此融合，在两种细胞的混合细胞悬液中，第l分钟滴加4.5mll640培养液；间隔2分钟滴加5ml1640培养液，然后加1640培养液至50ml，1500rpm/分钟离心IO分钟，以HAT选择性培养基(美囯�？寺」境銎�)按20-50%的孔为l个细胞/孔进行细胞培养。8、根据权利要求l所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(4)中是将细胞培养至覆盖0%~20%孔底时，吸取培养上清用酶联免疫吸附实验方法检测抗体含量，依抗体的分泌情况篩选出高效价的抗体分泌孔，将孔中细胞再行克隆化，然后进行抗原特异的免疫组织化学测定，选高分泌特异性细胞株扩大培养或冻存。9、根据权利要求l所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(5)中选用的多厂家30批次的基因工程药物乙肝疫苗与此单克隆抗体呈阳性表达。10、根据权利要求1所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(6)中选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射，一周后将5><105杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去，在接种一周后有明显的腹水产生，每只小鼠可收集10-15ml的腹水，使用AKTA-FPLC蛋白纯化仪将小鼠IgG单克隆抗体腹水溶液在A280im时收集，吸光单位=1.44时浓度为1-10mg/ml。11、根据权利要求1所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(7)对其基因工程药物乙肝疫苗进行CT3标记。12、根据权利要求1所述的基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法，其特征在于所述的步骤(8)基因工程药物乙肝疫苗单克隆抗体微阵列点样一张芯片点100个点，检测线性范围0。01-10ng/ffil。全文摘要本发明属于生物工程
技术领域：
，特别是指一种基因工程药物乙肝疫苗抗体芯片的制备方法。其中动物免疫、分离脾细胞、细胞融合、筛选杂交瘤细胞、单克隆抗体特异性筛选、单克隆抗体纯化保存、乙肝疫苗的标记、单克隆抗体的矩阵点样、芯片的杂交等工艺步骤，解决了传统技术存在的费时、费力、结果重复性差等技术问题。此芯片可直接应用于一线基因工程药物生产企业进行检测和质控研究，在基因工程药物研究领域中具有极高的应用价值，单克隆抗体的均一性和生物活性单一性使抗原抗体反应结果便于质量控制，利于标准化和规范化。目前国外几乎所有的主要制药公司都不同程度地采用了生物芯片技术来寻找药物靶标，检查药物的毒性或副作用及进行药物产品的定量和定性。用芯片技术进行大规模的药物筛选可以省略大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，从而带动创新药物的研究和开发。文档编号G01N33/577GK101556286SQ20081008896公开日2009年10月14日申请日期2008年4月10日优先权日2008年4月10日发明者锐张,彬李,倩梁申请人:李彬;梁倩;张锐
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