专利名称：一种气味传感器检测水果采后病害的方法
技术领域：
本发明是一种气味传感器检测水果采后病害的方法，属于农产品采后品质检测和控制的技术领域。
背景技术：
·世界水果种类繁多，主要有葡萄、苹果、梨、桃、李、草莓、杏、柿子、樱桃、猕猴桃、柑桔、香蕉、菠萝和无花果等。我国是世界水果生产大国，如苹果、梨、桃、李和柿子的产量均为世界之首。水果采后在采摘、运销、以及贮藏过程中因腐烂所造成的损失是巨大的。据资料报道，发达国家的果蔬采后因腐烂而造成的损失也在15 24%左右，发展中国家由于缺乏冷藏设备和卫生条件较差，果蔬采后的损失高达50%。腐烂主要归因于病原微生物的致病作用。由于水果产品组织柔嫩多汁并富含糖分，在采摘、运输、销售、贮藏环节中容易损伤和变质。病原微生物多从寄生性较低的伤口或死组织入侵，这些病原微生物主要有灰葡萄饱(Botrytis cinerea)、葡枝根霉(Rhizopus stolonnifer)、青霉属(Penicilliums spp.)、毛霉属(Mueorspp.)、链格抱(Alternaria spp·)、曲霉(Aspergillus spp.)和软腐细菌(Erwinia sp.)等等。这些病菌共同的特点是生长繁殖迅速，可侵染水果器官使之迅速腐烂变质。传统检验病原体方法主要依靠具体微生物学和生物化学技术，如利用培养基方法根据菌落特性和生化反应特点进行检测，这些方法都能定量或定性分析病原体，但费时、费用大，且需要专业技术人员。受感染水果发病呈现较明显症状，水果损失已经比较严重，而且进入包装中就会感染临近果实从而导致严重的经济损失。因此，探讨快速、精确、无损的水果病害早期检测方法具有十分重要的意义和应用价值。
发明内容
技术问题针对上述问题，本发明的目的是提供一种水果采后病害的无损检测方法，利用气体传感器获得采后水果的气味信息判断水果是否感染病原微生物及感染的种类，可以进行非破坏性的检测，减少经济损失。技术方案一种水果采后病害的无损检测方法(技术路线见图I)，是利用气味传感器检测水果感染不同病原微生物后散发的气味来确定水果是否感染病害及感染病害的种类，其特征在于它的检测步骤如下，I)将水果样品表面去杂、洗净，用75%酒精浸泡30s，待酒精挥发完全后进行接种处理，所有样品分为两组，一组用于气味传感器获取水果气味信息，一组用于气相质谱联用仪器测定水果气味的化学组成和相对含量，其中，水果样品分别接种该类水果采后易感染的病源微生物，模拟水果采后病原微生物感染，接种每一类病原微生物的水果样品和代表未感染病害水果样品数量均为50-80个；2)将水果样品进行贮藏，间隔相同时间采用气味传感器和气相质谱联用仪器测试水果的气味，其中气味传感器测试时，将水果样品置于密闭容器中，当顶空气体达到饱和时，气味传感器获取气味的响应信号，并进行分析处理，同时，利用气相质谱联用仪器检测分析气味的化学组成和相对含量；3)气体传感器和气相质谱联用仪检测结束后，计算腐烂指数，腐烂指数大于0，则表明水果已经感染病原微生物，其中，按果实腐烂面积大小将果实划分为3级0级，无腐烂；1级，果面有I 3个黄褐色病斑，且病变组织面积不超过果实总表面积的25% ；2级，果实表面出现菌丝，或病变组织面积达到果实总表面积的25%以上，按下式计算腐烂指数腐烂指数=Σ [(腐烂级别X该级果实数)/(最高腐烂级别X总果实数)]Χ100% ；4)分析气相质谱联用仪器的数据，根据气体成分的组成和含量的差异程度，确定水果气味差异最大的贮藏时间，同时对获取的气味传感器响应数据分别按照贮藏时间和感染病原微生物种类进行主成分分析，综合气相质谱联用仪器信息和气味传感器信息，根据同时实现尽早判断水果感染病害和易于区分感染病原微生物种类的原则，确定较佳的测试时间，结合传感器响应值的方差显著性分析结果确定较佳的气味传感器组合；·5)在选定的传感器组合基础上，建立如下基于马氏距离的Fisher线性判别分析模型，y0 = b0+a10 X S^a20 X S2+a30 X S3+- +an0 X snY1 = b1+a11 X S^a21 X S2+a31 X S3+··· +anl X Sny2 = b2+a12XS1+a22XS2+a32XS3+...+an2XSn......yk = bk+alk X S^a2k X S2+a3k X S3+- ·· +Bnk X Sn (I)上式中，S是气味传感器的响应值，是根据传感器接触到样品挥发物后的电阻量G与传感器在经过标准活性碳过滤气体的电阻量Gtl的比值GAV下标为传感器对应编号，取
值从1、2、3......n ;b和a分别为判别式的常数项和自变量系数，y的下标代表感染病原微
生物的类型，其中O代表没有感染病原微生物；6)将未知水果样品放入封闭容器，采用气味传感器获取响应值，代入式(I)中，比较所有I值，y值最大的组其下标代表该水果感染的病原微生物类型。有益效果本发明利用气味传感器获得水果采后的气味信息，能够不破坏水果完整性的情况下，通过水果散发出的气味信息，判断出采后水果是否已经感染病原微生物以及感染的种类，能够提前快速获得水果采后的质量信息，对采后水果病害情况进行及时预警，为操作者进一步处理提供有效信息，避免严重的经济损失。相对于传统的微生物培养检测等方法，不仅节省时间，而且避免了化学试剂的使用。技术和方法新颖，研究成果不仅可以用于实验室的快速分析和检测，而且可以通过开发在线检测设备和便携式仪器，用于水果采后加工、贮藏和销售等各个环节。
四
图I :技术路线图2 :腐烂指数；图3 :不同处理组草莓果实响应值PCA分析图，其中(a)对照组草莓响应信号的主成分分析图，(b)接种灰霉病草莓响应信号的主成分分析图，(c)接种扩展青霉草莓响应信号的主成分分析图，(d)接种根霉草莓响应信号的主成分分析图；图4 :不同处理草莓传感器响应值PCA分析结果，其中(a)第O天不同处理组响应信号的主成分分析图，(b)第2天不同处理组响应信号的主成分分析图
五具体实施例方式—种气味传感器检测水果病害的方法，以草莓为例，具体实施方式
如下I.试验材料实验所用草莓品种为“红颜”。2012年4月14日采摘于南京江心洲草莓园，选择色泽均匀、大小一致，无表面损伤的草莓。
选择草莓采后感染常见的三种病原菌灰霉(Botrytis sp.,BC)、扩展青霉(Penicillium sp.，PE)和根霉(Rhizopus sp.，RH),使用前在马铃薯葡萄糖琼脂(Potatodextrose agar, PDA)上24°C、85%相对湿度条件下活化7d。2.仪器便携式电子鼻(AIRSENSE，PEN3)。所用电子鼻传感器阵列包含10个传感器，分别为WlC^S1 :对芳香型化合物敏感，检测限IOppm)、W5S (S2 :对氮氧化物敏感，检测限Ippm)、W3C (S3 :对氨类、芳香型化合物敏感，检测限IOppm)、W6S(S4 :对氢气敏感，检测限IOOppm)、W5C(S5 :对烷烃、芳香型化合物敏感，检测限lppm)、WlS (S6 :对烃类物质敏感，检测限IOOppm)、W1W(S7 :对硫化氢、萜烯类敏感，检测限lppm)、W2S(S8 :对醇类、部分芳香型化合物敏感，检测限IOOppm)、W2ff(S9 :对芳香成分，对有机硫化物敏感，检测限lppm)、W3S(S10 对浓度、烷烃敏感，并具有选择性，检测限IOOppm)。测定时，传感器涂层吸附样品中的挥发性物质产生电导率变化，记录传感器吸附样品挥发物后的电阻率G与传感器吸附经活性碳过滤的空气电导率Gtl的比值GAV响应气体浓度越大，G/G0的值越偏离I (大于或者小于I)，如果浓度低于检测限或者没有感应气体，则该比值接近甚至等于I。3.试验方法将挑选出的草莓平均分为4组。75%酒精浸泡30s，待酒精挥发完全后进行接种处理。处理组果实分别于4X IO5个/mL的灰霉(BC)、青霉(PE)和根霉(RH)的孢子悬浮液中浸泡30s，对照组用无菌水(CK)处理，晾干后每3颗果实(50±5g)为I组，置于IOOmL纸杯中5°C冷藏。将装有草莓的纸杯自冰箱取出放入150mL烧杯中，于24°C、85%相对湿度条件下敞口回温2h，使果实内部温度达到24°C，用锡纸封口于24°C中静置lOmin。试验参数为流速120mL/min，测定时间60s，洗气时间80s，样品准备时间5s，自动调零时间5s。试验发现传感器响应值在25s左右趋于稳定，选择30s处的响应值用于数据分析。按果实腐烂面积大小将果实划分为3级0级，无腐烂；1级，果面有I 3个黄褐色病斑，且病变组织面积不超过果实总表面积的25% ;2级，果实表面出现菌丝，或病变组织面积达到果实总表面积的25%以上。按下式计算腐烂指数腐烂指数=Σ [(腐烂级别X该级果实数)/(最高腐烂级别X总果实数)]X 100%。气相质谱联用(GC-MS)测定挥发性物质每个处理组取5颗草莓，切碎混匀，液氮处理后-18°C存放待用。将固相微萃取装置插入并推出纤维头进行老化；取IOg果浆于20mL样品瓶中，40°C水浴,用老化过的萃取装置萃取40min。气质联用(GC-MS)测定参照ThomasRH等[27]的研究方法。气相色谱仪进样口温度设为240°C，PDMS萃取头于进样口解析3min ;柱温:50°C保持5min，然后以2°C每分钟升至200。。，保持IOmin ；FID检测器，240°C ；离子源温度230°C;载气He，流速lmL/min ;扫描范围m/z30-450。各组分经NIST谱库检索确定，仅选择匹配度大于80%的组分，相对含量以峰面积占检出气体总峰面积百分比表示。4.传感器对草莓挥发性物质的响应电子鼻响应信号在测定初始阶段相对电导率快速上升，一定时间后逐渐趋于平缓，另外，S3 (对氨类、芳香型化合物敏感)、S5 (对烷烃、芳香型化合物敏感)、S6 (对烃类物质敏感)、S7 (对硫化氢、萜烯类敏感)、S8 (对醇类、部分芳香型化合物敏感)较其他传感器有更高的相对电导率。通过电子鼻传感器对草莓果实挥发性物质的响应试验可知，电子鼻对草莓果实的挥发性物质有明显的响应，且每一个传感器对其响应值各不相同。基于病害影响草莓果实挥发性风味物质的假设，表明利用PEN3电子鼻系统识别草莓病害可行。5.病害对贮藏期草莓腐烂指数的影响 不同病原菌处理的草莓贮藏期腐烂指数的变化如图2所示，从图中可以看出随贮藏时间的延长，各组果实的腐烂指数逐渐变大。CK组草莓发病最迟，第4天时仍无病害发生，贮藏末期的腐烂指数最小，而处理组果实在冷藏2d后即开始发�。抑啬┢诟弥甘陡哂贑K组。6.不同处理的草莓果实传感器响应值主成分分析不同处理组的草莓果实主成分分析(PCA)分析结果见图3，可以看出，各组果实第一、第二主成分累计贡献率均在90%以上，能够代表原始变量大部分的信息。CK组果实贮藏第4d时的样品点分布与贮藏前期(0、2d)、后期(6、8、10d)均有明显差异；各处理组的主成分分析结果相似，贮藏0d、2d天的样品点分布有别于贮藏后期(4、6、8、10d)，贮藏2d时的样品点分布与贮藏后期差别最大。7.电子鼻对草莓病害种类的区分利用PCA分别对处理后0d、2d的果实传感器响应值进行分析，结果如图4所示。由图可知，在处理结束后立刻进行检测，无法区分其病原菌种类，而处理后5°C贮藏2d后，不同处理样品点聚集在不同位置。表明在处理后短期内病原菌对果实挥发性物质的影响不足以用于其种类的区分，而处理后2d其差异性就表现出来，在发病早期即可区分，因此，利用主成分分析进行草莓病害的早期判别是可行的。PCA分析结果可以直观的显示出各组之间的差异，要精确说明其差异需进行方差分析。Wilks' Lambda是组内平方和与总平方和之比。当所有观测的组均值相等时，Wilks' Lambda值为I ;当组内变异与总变异相比小时,Wilks' Lambda值接近于O。因此，Wilks' Lambda值大,表示各个组的均值基本相等！Wilks' Lambda小表示组间有差异[28],利用F检验分析差异的显著性水平(P <0.05)。由表I分析结果可知，第2天时，对照组与处理组间响应值间差异显著，不同病原菌处理组间响应值也有显著差异。表I处理后2d不同病害草莓的传感器响应值方差分析
权利要求
1 . 一种水果采后病害的快速无损检测方法，是利用气味传感器检测水果感染不同病原微生物后散发的气味来确定水果是否感染病害及感染病害的种类，其特征在于它的检测步骤如下， 1)将水果样品表面去杂、洗净，用75%酒精浸泡30s，待酒精挥发完全后进行接种处理，所有样品分为两组，一组用于气味传感器获取水果气味信息，另一组用于气相质谱联用仪器测定水果气味的化学组成和相对含量，其中，水果样品分别接种该类水果采后易感染的病源微生物，模拟水果采后病原微生物感染，接种每一类病原微生物的水果样品和代表未感染病害水果样品数量均为50-80个； 2)将水果样品进行贮藏，间隔相同时间采用气味传感器和气相质谱联用仪器测试水果的气味，其中气味传感器测试时，将水果样品置于密闭容器中，当顶空气体达到饱和时，通过气味传感器获取气味响应信号，并进行分析处理，同时，利用气相质谱联用仪器分析检测气味的化学组成和相对含量； 3)气体传感器和气相质谱联用仪检测结束后，计算腐烂指数，腐烂指数大于0，则表明水果已经感染病原微生物，其中，按果实腐烂面积大小将果实划分为3级0级，无腐烂；1级，果面有I 3个黄褐色病斑，且病变组织面积不超过果实总表面积的25%;2级，果实表面出现菌丝，或病变组织面积达到果实总表面积的25%以上，按下式计算腐烂指数腐烂指数=Σ [(腐烂级别X该级果实数)/(最高腐烂级别X总果实数)]Χ100% ； 4)分析气相质谱联用仪器的数据，根据气体成分的组成和含量的差异程度，确定水果气味差异最大的贮藏时间，同时对获取的气味传感器响应数据分别按照贮藏时间和感染病原微生物种类进行主成分分析，综合气相质谱联用仪器信息和气味传感器信息，根据同时实现尽早判断水果感染病害和易于区分感染病原微生物种类的原则，确定较佳的测试时间，结合传感器响应值的方差显著性分析结果确定较佳的气味传感器组合； 5)在选定的传感器组合基础上，建立如下基于马氏距离的Fisher线性判别分析模型， Io — b0+a10 X Sfa20 X S2+a30 X S3+...+an0 X SnYi = Va11 X S^a21 X S2+a31 X S3+…+anl X Sn 12 — b2+a22 X Sfa22 X S2+a22 X S3+…+an2 X SnYk = bk+alkX S^a2kX S2+aaX S3+...+ankX Sn(I) 上式中，S是气味传感器的响应值，是根据传感器接触到样品挥发物后的电阻量G与传感器在经过标准活性碳过滤气体的电阻量Gtl的比值GAV下标为传感器对应编号，取值为1、2、3......n ;b和a分别为判别式的常数项和自变量系数，y的下标代表感染病原微生物的类型，其中O代表没有感染病原微生物； 6)将未知水果样品放入封闭容器，采用气味传感器获取响应值，代入式⑴中，比较所有y值，y值最大的组其下标代表该水果感染的病原微生物类型。
全文摘要
本发明公开了一种水果采后病害快速无损检测方法，属于农产品采后质量控制领域。该技术将选定的金属氧化物气味传感器获取水果采后的气味响应信号，代入构建的判别模型中，可以得到水果是否感染病原微生物以及感染的种类信息。本方法能够快速和非破坏检测水果采后是否感染病害以及病害的类型，操作简单，快速准确，减少人工检测的费用，降低水果采后贮藏的损失，可以用于水果采后的流通、贮藏和销售过程中的检测和监测。
文档编号G01N27/12GK102944585SQ201210520700
公开日2013年2月27日 申请日期2012年12月7日 优先权日2012年12月7日
发明者潘磊庆, 屠康, 朱娜, 张伟 申请人:南京农业大学
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