一种高尔基体蛋白73(gp73)抗原硅基磁珠结合物的制备及应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种GP73抗原硅基磁珠结合物，并以此结合物作为组份之一，搭配其他组份组成了一种竞争法GP73定量检测试剂盒。本发明的试剂盒由高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物工作液、高尔基体蛋白73(GP73)校准品、碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液、清洗液和化学发光底物组成。同时本发明提供了上述GP73抗原硅基磁珠结合物的制备方法以及试剂盒各组份的制备方法，包括GP73抗原硅基磁珠结合物工作液的配制、酶标记抗体、校准品配制、清洗液、发光底物配制等步骤。本发明的试剂盒主要可应用于原发性肝癌的诊断，具有灵敏度高、线性范围宽、无hook效应、成本低检验耗时短等优点。
【专利说明】一种高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物的制备及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种稳定性高的高尔基体蛋白73 (Golgi Protein-73,以下简写为GP73)抗原硅基磁珠结合物的制备方法及其在免疫诊断试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)是常见的恶性肿瘤之一，由于其发病隐匿，临床上约有2/3的HCC患者初诊时已属中晚期。据统计，肝癌在世界范围内发病人数超过50万，该人数在逐年增加，其中中国肝癌人数将约占去其中的50%，在恶性肿瘤死亡顺位中占第二位。医学研究表明，如若早期发现肝癌并且及时治疗大概可以提高患者的5年存活率，因此肝癌的早期发现具有重要的临床意义。
[0003]原发性肝细胞癌通常发生于有慢性病毒性肝炎、肝硬化基础的人群，能够及时的跟踪监测随访这部分人群，对提高肝癌的早期诊断率有着重要的意义。目前，对于HCC常用的检测手段包括肝超声影像分析和血清学标志物检测，其中最常使用的血清学标志物是甲胎蛋白(AFP)，但是AFP在早期肝癌诊断中灵敏度不高，只有50 %?60 %的肝癌患者AFP呈阳性，并且慢性肝炎、肝硬化患者等肝癌高危人群也可引起甲胎蛋白的升高。因此，临床需要一种更理想的血清标志物。
[0004]近年来，随着基因组学、蛋白质组学、肿瘤免疫等相关研究的飞速发展，与肝癌相关的新的肿瘤标志物相继出现，其中高尔基体糖蛋白73(GP73)是最值得期待的血清标志物之一。
[0005]高尔基体糖蛋白73(GP73)又称II型高尔基体跨膜蛋白(Golgiphosphoprotein2, G0LPH2)和GOLMl，因其在SDS-PAGE中显示相对分子质量为?.3xl04，所以称为GPTSt5Kladney等证明GP73主要表达于上皮细胞，在正常肝脏，GP73主要在胆管上皮细胞中表达，而在干细胞则很少表达甚至不表达，但是其在各种急、慢性肝炎及肝硬化患者中GP73水平明显上调。2004年Iftikhar等研究发现GP73在急性肝炎(包括病毒性和自身免疫性)和进行性肝硬化患者(慢性丙型肝炎和酒精性肝病)中表达明显增高(IftikharR, Kladney RD, Havl1glu N, et al.Disease and cell specific express1n of GP73inhuman liver disease [J].Am J Gastroenterol2004,99(6):1087-1095)。
[0006]2005年，Block等研究发现，原发性肝癌患者血清中的GP73含量明显升高(BlockTM, et al.Proc Natl Acad Sci USA, 2005,102(3):779-784.)，同年，Marrero 等通过临床血清标本分析测定，发现GP73用于诊断肝癌的灵敏度和特异性均超过70%，诊断早期肝癌的灵敏度为AFP的2.55倍，在AFP < 20ng/L的肝癌患者中，超过一半的人群GP73明显升高(Marrero JA, et al.J Hepatol, 2005,43 (6):1007-1012)。因此，对 AFP 阴性的肝癌患者，GP73的应用能够明显提高肝癌的检出率。
[0007]GP73的临床检验技术有不少文章和专利。在期刊文章方面所涉及到的GP73检测方法有很多，排除掉操作方面复杂、成本高、文章较少的免疫印迹法、配套预装离心柱的酶标试剂盒法及抗体芯片法后，目前绝大多数文献中的检测方法是双抗夹心酶联免疫法。专利方面的情况与期刊文章类似，其中CN200810172605《抗高尔基体蛋白单克隆抗体及应用》和CN200810181016《一种抗GP73蛋白的单克隆抗体、其制备方法和应用》等的技术重点是抗GP73单克隆抗体的制备及所制备的单克隆抗体的应用，其中涉及到的检测试剂盒一般均采用微孔板包被抗体，另一抗体标记辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶，使用夹心法测定GP73含量，均属于比较传统的微孔板酶联免疫检测技术。在临床检验方面，微孔板酶联免疫检测技术已逐步被更完善的技术取代，例如显色底物被灵敏度更高的发光底物所取代，做为固相载体的微孔板被反应面积更大的免疫磁珠所取代等。在磁珠方面需要说明的是，在酶联免疫检测技术中所用的磁珠以羟基或羧基磁珠为主，偶有使用氨基磁珠，表面其他活性基团的磁珠未见在酶联免疫检测中使用，硅基磁珠由于对核酸有吸附力，所以在临床上主要用于核酸的检测，没有用于蛋白质检测的文献。在GP73酶联免疫检测方面，引入免疫磁珠的文献很少，在专利CN103499692A中，提出了一种GP73板式磁颗粒化学发光免疫分析方法，引入了磁颗粒，不过从其具体专利内容来看，磁颗粒上的活性基团没有明确的说明，从交联方法来看，磁珠应该是羟基或羧基磁珠，其交联方式是羟基或羧基磁珠的简易交联方法，其效果不会很理想，从最终试剂盒的介绍来看，性能很一般。
[0008]综上所述，目前GP73的主流酶联免疫法，主要有以下不足:一、灵敏度一般均较低，线性范围窄，受到微孔板的面积限制，微孔板作为载体可包被的抗体有限，反应面积小，较显著地限制了试剂的线性范围，要么试剂灵敏度低，要么试剂盒的线性上限低，不能有效满足临床的应用；个别文献采用了磁珠作为固相载体，但对磁颗粒没有明确说明，交联方法也属于简易方法，不能发挥出磁珠的优势，从最终试剂盒的介绍来看，仍存在灵敏度低和线性范围窄的问题；二、所用连接方法采用双抗夹心反应原理，存有Hook效应问题，进一步限制了线性范围；三、反应体系中存在两种抗体及GP73抗原，成本较高；四、反应试剂组分一般较多或者反应模式较为复杂，导致反应步骤繁琐、反应时间长。
【发明内容】
[0009]本发明所需要解决的技术问题是:弥补现有GP73检测技术的不足，建立一种GP73和硅基磁珠连接的新型方法，制备出非特异性极低、稳定性高的GP73硅基磁珠连接物，并以此连接物作为组份之一，搭配其他组份组成了一种竞争法GP73定量检测试剂盒，具有灵敏度高、线性范围宽、无hook效应、成本低检验耗时短等优点。
[0010]本发明的技术问题，通过以下的技术方案解决:
[0011]1.一种GP73抗原硅基磁珠结合物的制备方法，优选的，包括以下几个步骤:
[0012]I)称取一定量的娃基磁珠,将娃基磁珠溶于其质量(单位:毫克)数一半毫升数的70%乙醇中，加入硅基磁珠质量(单位:毫克)数0.5%毫升数的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其终浓度为15% (V/V)，室温搅拌反应17?18小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，得到表面修饰有一定量氨基的硅基磁珠；
[0013]2)将上一步得到的表面修饰有氨基的硅基磁珠溶于其质量(单位:毫克)数一半毫升数的pH = 8.0±0.05的50mM Tris缓冲液中，加入戊二醛使其浓度为5% (V/V)，室温震荡反应I小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，得到表面修饰有一定fe基的娃基磁珠；
[0014]3)将上一步得到的表面修饰有一定醛基的硅基磁珠用pH = 7.8±0.05的50mMPBS缓冲液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后待用；
[0015]4)按每400mg硅基磁珠对应Img高尔基体蛋白73 (GP73)全长抗原的比例，称取所需量的GP73全长抗原，溶解于pH = 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液制备出浓度为35 μ g/ml的高尔基体蛋白73(GP73)全长抗原溶液，待用；
[0016]5)将步骤3)得到的全部表面修饰有醛基的硅基磁珠加入步骤4)的GP73全长抗原溶液中，室温震荡混匀3小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，继续用pH = 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液清洗至上清0D280 < 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物。
[0017]6)将上一步得到的GP73抗原硅基磁珠结合物加入一定量的保存缓冲液(pH =7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠结合物浓溶液，用于日常保存。
[0018]上述方法中所述的GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液，可采用以下方式测定浓度:将浓溶液混匀，取一定体积的浓溶液，用磁板沉淀磁珠结合物，去除上清后，对磁珠结合物进行干燥后称重，用磁珠结合物的重量除以所取浓溶液体积，得到GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液的磁珠结合物浓度。
[0019]上述方法中所述的GP73抗原，优选的，是带His标签的高尔基体蛋白73 (GP73)全长抗原。
[0020]上述方法中所述的硅基磁珠，是四氧化三铁经过二氧化硅包裹形成的硅基壳层的磁微粒，可以从外部购买，也可以自制，优选的，自制硅基磁珠的制备方法包含如下步骤:
[0021]I)将含Fe3+和Fe2+试剂按2.5:1的摩尔比溶于水中形成混合液，其中Fe3+在混合液中可接受的摩尔浓度范围为0.03?0.3mol/L，在55°C氮气保护状态下搅拌反应2小时，搅拌转速为400?650rpm，并通过浓NaOH溶液调节混合液pH值为碱性，反应得到磁性四氧化三铁微粒，即磁微粒。
[0022]2)将上一步中制备得到的磁性四氧化三铁颗粒,利用纯化水清洗至中性,之后加入其质量(单位:毫克)数一半毫升数的90%乙醇，继续加入磁微粒质量0.5%毫升数的氨水，在30°C下搅拌，1kHZ超声30分钟后缓慢加入90%乙醇体积0.5%体积的正硅酸乙酯(TEOS)，反应持续15-16小时，结束后之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三铁的磁性颗粒，即自制硅基磁珠。
[0023]在自制娃基磁珠制备过程中，取磁微�：妥灾仆藁胖榻械缇盗＞恫馐裕扑愣趸杩遣愫穸龋叛〉模盼⒘Ｖ本对贗?3.5 μ m，二氧化硅壳层厚度为15?20nm。
[0024]2.一种竞争法酶促化学发光高尔基体蛋白73(GP73)定量检测试剂盒，其组份包括:
[0025]I)高尔基体蛋白73(GP73)校准品；
[0026]2)碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液；
[0027]3)高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物工作液；
[0028]4)清洗液；
[0029]5)化学发光底物。
[0030]优选的，高尔基体蛋白73 (GP73)抗原硅基磁珠结合物工作液的配制方法为:使用上述步骤制备而成的GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液加入保存缓冲液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl,0.5% BSA,0.1 % Proclin300)配制成一定浓度得到的，工作液中磁珠结合物可接受的浓度范围为0.5?2mg/ml。
[0031]优选的，竞争法GP73定量检测试剂盒GP73校准品的制备过程包括如下步骤:
[0032]I)校准品缓冲液制备:准确称取Tris碱0.6g,NaC10.85g,海藻糖3g,Proclin300
0.lg，添加80g纯化水混匀后，用高浓度盐酸或氢氧化钠调整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混匀后定重至100g，继续混匀30分钟后0.22 μ m过滤。
[0033]2)校准品的配制:在上述缓冲液中加入GP73抗原配制而成。
[0034]优选的，碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液的制备包括以下步骤:
[0035]I)称取 3mg2IT，用含有 50mM Tris,0.1M NaCl 和 0.005M EDTA, pH = 8.5±0.05水溶液溶解至10mg/ml ;准确量取GP73单克隆抗体0.5mg，通过浓缩或定容的方式使溶液中抗体浓度为3.5mg/ml，溶剂使用上述2IT溶液的溶剂，置于反应试管底部；在含有3.5mg/mlGP73单克隆抗体溶液的试管中加入其体积1/20比例的2IT溶液进行活化。混匀，在室温下反应20分钟，结束后利用分子筛层析方式去除溶液中的过量的2IT，得到活化的抗体；
[0036]2)准确量取碱性磷酸酶0.4mg,置于反应试管底部；称取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有碱性磷酸酶的试管中加入其体积1/20的SMCC溶液，混匀后，室温下反应15分钟，结束后利用分子筛层析去除溶液中的过量的SMCC，得到活化的碱性磷酸酶；
[0037]3)将以上步骤中活化的抗体和活化的碱性磷酸酶按质量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液,混匀后在2?8°C环境下反应24小时。反应结束后，用分子筛层析的方法纯化得到最终抗体-酶连接物；
[0038]4)工作液缓冲液制备:准确称取 Tris 碱 0.6g，NaCl0.85g，Proclin300 0.lg，添加80g纯化水15分钟混匀后用高浓度盐酸或氢氧化钠溶液调整pH = 7.2±0.05，继续加入IM MgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，纯水定重至 100g，30 分钟混匀后 0.22 μ m 过滤，即得到工作液缓冲液；
[0039]5)将以上步骤中得到的抗体-酶连接物，利用工作液缓冲液稀释至抗体-酶连接物浓度为3.0μ g/ml，即得到碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液。
[0040]优选的，清洗液的配制方法如下:
[0041]称取Trisl211.4mg, NaC19g,吐温-20 lg,加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用高浓度盐酸溶液或高浓度氢氧化钠溶液调整溶液PH值到8.0±0.5，补加纯化水定容至1000ml，混匀30分钟，过滤后待用。
[0042]优选的，化学发光底物的配制包括以下步骤:
[0043]准确称取AMPH) (3-(2-螺旋金刚烷)_4_甲氧基_4_(3_磷氧酰)-苯基_1，2_ 二氧环乙烷二钠盐)或APS-51g，Tris24g，氯化钠(NaCl) 160g，CTAC0.0255g，加入纯化水约900ml，混匀15分钟，用高浓盐酸溶液或高浓氢氧化钠溶液调整溶液pH值到9.7±0.05，之后补加纯化水定容至1000ml，混匀待用。本化学发光底物为针对碱性磷酸酶的化学发光底物，需要在2-8 °C条件下避光保存，用时缓慢混匀。
[0044]本GP73-硅基磁珠结合物及相应试剂盒的创新性和突出技术优势具体在于:
[0045]I)将硅基磁珠引入到了酶联免疫检测技术中并通过创新的方法对硅基磁珠的表面进行了一定的氨基化和醛基化，既保留了硅基磁珠对蛋白质有一定物理吸附力的特性，又使硅基磁珠表面具备了与蛋白质进行化学键结合的能力；利用了 GP73抗原对二氧化硅较强的物理吸附特性，GP73抗原首先与磁珠表面吸附，之后GP73抗原与磁珠表面的氨基及醛基的化学键连接由于距离近而完成得更充分；最终的结合物同时有化学键和物理吸附力两种作用力，稳定性很好，同时由于磁珠的上述特性，GP73抗原在磁珠表面的封闭效果很好，磁珠结合物的非特异性极低；此GP73-硅基磁珠结合物被配制成工作液加入到GP73检测试剂盒中，使试剂盒具备更高的灵敏度和线性范围，同时有效期更长。
[0046]2)试剂盒的反应模式是竞争法，无hook效应问题，明显拓展了检测试剂盒的线性范围；
[0047]3)试剂盒的反应体系均一，能够极大提高抗原抗体的结合速率，样本测定耗时短。
【具体实施方式】
[0048]实施例1自制硅基磁珠的制备
[0049]l)Fe3+在混合液中摩尔浓度为0.3mol/L的制备磁微粒1:准确称取FeCl3.6H2040.54g和FeCl2.4H2011.93g溶于500ml纯化水中，在55°C氮气保护状态下搅拌反应2小时，搅拌转速为400?650rpm，并通过浓NaOH溶液调节混合液pH为碱性，反应得到磁性四氧化三铁微粒，即磁微粒,称为磁微粒I。结束后用纯化水清洗磁微粒至中性。将磁微粒浸泡于一定纯化水中混匀，取出一些磁微粒溶液利用烘干法(即取一定体积磁微粒溶液烘干称量干燥后的磁微粒质量，除以原体积)，测定四氧化三铁浓度。
[0050]2) Fe3+在混合液中摩尔浓度为0.03mol/L的制备磁微粒2:准确称取FeCl3.6H204.054g和FeCl2.4H201.193g溶于500ml纯化水中，在55°C氮气保护状态下搅拌反应2小时，搅拌转速为400?650rpm，并通过浓NaOH溶液调节混合液pH为碱性，反应得到磁性四氧化三铁微粒，即磁微粒,称为磁微粒2。结束后用纯化水清洗磁微粒至中性。将磁微粒浸泡于一定纯化水中混匀，取出一些磁微粒溶液利用烘干法(即取一定体积磁微粒溶液烘干称量干燥后的磁微粒质量，除以原体积)，测定四氧化三铁浓度。
[0051]3)准确量取步骤I)得到磁微粒I 200mg，磁分离去除其中的水分，添加90%乙醇100ml、氨水1ml，在30°C下机械搅拌1kHZ超声30分钟后缓慢加入0.5ml的TE0S，反应持续15-16小时，结束后用纯化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三铁的磁性颗粒，命名为硅基磁珠I。
[0052]4)准备量取步骤2)得到磁微粒2200mg，磁分离去除其中的水分，添加90%乙醇100ml、氨水1ml，在30°C下机械搅拌1kHZ超声30分钟后缓慢加入0.5ml的TE0S，反应持续15-16小时，结束后用纯化水清洗5次即得到二氧化硅包裹四氧化三铁的磁性颗粒，命名为硅基磁珠2。
[0053]5)利用电镜检测确定磁微粒1、磁微粒2、硅基磁珠I和硅基磁珠2的粒径并计算，磁微粒粒径在I μ m-3.5 μ m,硅基磁珠的二氧化硅壳层厚度在15_20nm。
[0054]实施例2 GP73抗原硅基磁珠结合物的制备
[0055]I)准确量取硅基磁珠200mg，溶于100ml70%乙醇中，加入Iml的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其终浓度为15% (V/V)，室温机械搅拌反应17?18小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，即得到表面修饰有一定量氨基的磁微粒。
[0056]2)将步骤I)得到的修饰有氨基的磁微粒溶于100ml pH = 8.0±0.05的50mMTris缓冲液中，加入戊二醛使其浓度为5% (V/V)，室温震荡反应I小时，结束后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，得到表面修饰有一定醛基的硅基磁珠。
[0057]3)将步骤2)得到的修饰有醛基的硅基磁珠用pH = 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后，待用；
[0058]4)称取0.5mg带His标签的GP73全长抗原，溶解于14.28ml pH = 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液中，制备出14.28ml浓度为35 μ g/ml的GP73全长抗原溶液，待用；
[0059]5)将步骤3)得到的修饰有醛基的硅基磁珠加入步骤4)的14.28ml GP73全长抗原溶液中，室温震荡混匀3小时，继续用pH = 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液清洗至上清OD< 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物。
[0060]6)将步骤5)得到的GP73抗原硅基磁珠结合物加入一定量的保存缓冲液(pH =7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl,0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠结合物浓溶液，用于日常保存；
[0061]7)将浓溶液混匀，取一定体积的浓溶液，用磁板沉淀磁珠结合物，去除上清后，对磁珠结合物进行干燥后称重，用磁珠结合物的重量除以所取体积，得到GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液的磁珠结合物浓度；
[0062]8)工作液的配制:参照步骤7)得到的GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液的浓度，用保存缓冲液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)稀释GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液，得到所需浓度的GP73抗原硅基磁珠结合物的工作液。
[0063]米用娃基磁珠1、娃基磁珠2及外购于河南惠尔纳米科技有限公司的娃基磁珠(简称为硅基磁珠3)，按上述步骤分别制备出GP73抗原硅基磁珠结合物的工作液1-1 (浓度为
0.5mg/ml，简称GP73硅基磁珠工作液1_1)、GP73抗原硅基磁珠结合物的工作液1_2 (浓度为2mg/ml，简称GP73硅基磁珠工作液1_2)、GP73抗原硅基磁珠结合物的工作液2_1 (浓度为0.5mg/ml，简称GP73硅基磁珠工作液2_1)、GP73抗原硅基磁珠结合物的工作液2_2 (浓度为2mg/ml，简称GP73硅基磁珠工作液2_2)、GP73抗原硅基磁珠结合物的工作液3_1 (浓度为0.5mg/ml,简称GP73硅基磁珠工作液3_1)和GP73抗原硅基磁珠结合物的工作液3-2 (浓度为2mg/ml，简称GP73硅基磁珠工作液3-2)。
[0064]实施例3 碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73 (GP73)单克隆抗体工作液以及其余试剂组份的制备
[0065]1、碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液的制备
[0066]I)称取 3mg2IT，用含有 50mM Tris,0.1M NaCl 和 0.005M EDTA, pH = 8.5±0.05水溶液溶解至10mg/ml ;准确量取GP73单克隆抗体0.5mg，通过浓缩或定容的方式使溶液中抗体浓度为3.5mg/ml，溶剂使用上述2IT溶液的溶剂，置于反应试管底部；在含有3.5mg/mlGP73单克隆抗体溶液的试管中加入其体积1/20比例的2IT溶液进行活化。混匀，在室温下反应20分钟，结束后利用分子筛层析方式去除溶液中的过量的2IT，得到活化的抗体；
[0067]2)准确量取碱性磷酸酶0.4mg,置于反应试管底部；称取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有碱性磷酸酶的试管中加入其体积1/20的SMCC溶液，混匀后，室温下反应15分钟，结束后利用分子筛层析去除溶液中的过量的SMCC，得到活化的碱性磷酸酶；
[0068]3)将步骤I)得到的活化抗体和步骤2)得到的活化碱性磷酸酶按质量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液,混匀后在2?8°C环境下反应24小时。反应结束后,用分子筛层析的方法纯化得到最终抗体酶连接物；
[0069]4)工作液缓冲液的配制:准确称取 Tris 碱 0.6g, NaCl0.85g, Proclin300 0.lg,添加80g纯化水15分钟混匀后用高浓盐酸或氢氧化钠调整pH = 7.2±0.05，继续加入IMMgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，纯水定重至 100g，30 分钟混匀后 0.22 μ m 过滤，即得到工作液缓冲液；
[0070]5)将步骤3)得到的抗体酶连接物，利用步骤4)得到的试剂缓冲液稀释至
3.0 μ g/ml,即得到碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液，简称GP73酶标抗体工作液。
[0071]2、化学发光底物的配制包括以下步骤:
[0072]I)准确称取AMPPDlg，Tris24g，NaC1160g，十六烷基三甲基氯化铵0.0255g，加入纯化水约900ml，混匀15分钟，用高浓盐酸溶液或高浓氢氧化钠溶液调整溶液pH值到
9.7±0.05，之后补加纯化水定容至1000ml，混匀待用。此发光底物在2_8°C条件下避光保存，使用前轻轻震荡混匀，得到化学发光底物I。
[0073]2)按照以上步骤，除了将AMPH)替换成等量的APS-5外，底物中其他成份的量和配制方法一致，配制得到化学发光底物2。
[0074]3、高尔基体蛋白73(GP73)校准品
[0075]校准品缓冲液制备:准确称取Tris碱0.6g, NaCl0.85g,海藻糖3g, Proclin300
0.1g,添加80g纯化水混匀后，用高浓盐酸调整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混匀后定重至10g,继续混匀30分钟后0.22 μ m过滤。用校准品缓冲液将带His标签的GP73全长抗原分别配制成0，10，50，150，500，2000ng/ml，5个浓度点，共6瓶待用。
[0076]4、清洗液的配制
[0077]依次向容器内加入Trisl211.4mg，NaC19g，吐温-20 lg，加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用高浓盐酸溶液或氢氧化钠溶液调pH至8.0±0.5，补加纯水定容至1000ml，混匀30分钟，0.22 μ m过滤即得到清洗液。
[0078]实施例4酶促化学发光GP73定量检测试剂盒的组合
[0079]将实施例2制备的各GP73抗原硅基磁珠结合物工作液分别与实施例3中所制备的试剂盒其余组分，配套组合为试剂盒。详细组合见下表:
[0080]
【权利要求】
1.一种高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物及其制备方法，其特征在于此结合物通过硅基磁珠和高尔基体蛋白73(GP73)全长抗原制备而成，其制备包括以下步骤: 1)称取一定量的娃基磁珠，将娃基磁珠溶于其质量(单位:毫克)数一半毫升数的70%乙醇中，加入硅基磁珠质量(单位:毫克)数0.5%毫升数的氨水、加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)使其终浓度为15% (V/V)，室温搅拌反应17?18小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，得到表面修饰有一定量氨基的硅基磁珠； 2)将上一步得到的表面修饰有氨基的硅基磁珠溶于其质量(单位:毫克)数一半毫升数的pH = 8.0±0.05的50mM Tris缓冲液中，加入戊二醛使其浓度为5% (V/V)，室温震荡反应I小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次，得到表面修饰有一定醛基的娃基磁珠； 3)将上一步得到的表面修饰有一定醛基的硅基磁珠用pH= 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液清洗3次后，用磁板沉淀磁珠去上清后待用； 4)按每400mg硅基磁珠对应Img高尔基体蛋白73(GP73)全长抗原的比例，称取所需量的GP73全长抗原，溶解于pH = 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液制备出浓度为35 μ g/ml的高尔基体蛋白73(GP73)全长抗原溶液，待用； 5)将步骤3)得到的全部表面修饰有醛基的硅基磁珠加入步骤4)的GP73全长抗原溶液中，室温震荡混匀3小时，之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，继续用pH = 7.8±0.05的50mM PBS缓冲液清洗至上清0D280 < 0.0050。再次用磁板沉淀磁珠，去除上清，得到高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物。 6)将上一步得到的GP73抗原硅基磁珠结合物加入一定量的保存缓冲液(pH=7.8±0.05，100mMTris,0.85% NaCl，0.5% BSA，0.1% Proclin300)得到 GP73 抗原硅基磁珠结合物浓溶液，用于日常保存。
2.根据权利要求1所述的高尔基体蛋白73(GP73)抗原，其特征在于:所述高尔基体蛋白73(GP73)抗原为带His标签的高尔基体蛋白73 (GP73)全长抗原。
3.根据权利要求1所述的硅基磁珠，其特征在于:所述的硅基磁珠是四氧化三铁经过二氧化硅包裹形成的硅基壳层的磁微粒，可以通过外部购买或自制得到。
4.根据权利要求3所述的自制硅基磁珠，其特征在于，其具体制备方法如下: 1)将含Fe3+和Fe2+试剂按2.5:1的摩尔比溶于水中形成混合液，其中Fe3+在混合液中可接受的摩尔浓度范围为0.03?0.3mol/L，在55°C氮气保护状态下搅拌反应2小时，搅拌转速为400?650rpm，并通过浓NaOH溶液调节混合液pH为碱性，反应得到磁性四氧化三铁微粒，即磁微粒。 2)将上一步中制备得到的磁性四氧化三铁颗粒，利用纯化水清洗至中性，之后加入其质量(单位:毫克)数一半毫升数的90%乙醇，继续加入磁微粒质量(单位:毫克)0.5%毫升数的氨水，在30°C下搅拌，1kHZ超声30分钟后缓慢加入90%乙醇体积0.5%体积的正硅酸乙酯(TEOS)反应持续15-16小时，结束后之后用磁板沉淀磁珠，去除上清，用纯化水清洗5次得到二氧化硅包裹四氧化三铁的磁性颗粒，即硅基磁珠。
5.根据权利要求4所述的Fe3+和Fe2+试剂，其特征在于，Fe3+试剂是六水氯化铁、Fe2+试剂是四水氯化亚铁。
6.根据权利要求3或4所述的磁微粒，其特征在于，磁微粒直径在1-3.5 μ m。
7.根据权利要求1或3或4所述的硅基磁珠，其特征在于，二氧化硅壳层厚度为15_20nmo
8.一种酶促化学发光高尔基体蛋白73 (GP73)定量检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括: 1)高尔基体蛋白73(GP73)校准品； 2)碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液； 3)高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物工作液； 4)清洗液； 5)化学发光底物。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的高尔基体蛋白73(GP73)抗原硅基磁珠结合物工作液是用权利要求1中所述的GP73抗原硅基磁珠结合物浓溶液加入适量的保存缓冲液(pH = 7.8±0.05，10mM Tris,0.85% NaCl,0.5% BSA,0.1% Proclin300)配制成一定浓度得到的，工作液中磁珠结合物可接受的浓度范围为0.5?2mg/ml。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述清洗液的配制包括以下步骤: 称取Trisl211.4mg, NaC19g,吐温-20 lg，加入纯化水约900ml，混匀至各试剂溶解，用高浓度盐酸溶液或高浓度氢氧化钠溶液调整溶液PH值到8.0±0.5，补加纯化水定容至100ml，混匀30分钟，过滤后待用。
11.根据权利8要求所述的化学发光底物的配制包括以下步骤:准确称取AMPPD (3- (2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4- (3-磷氧酰)-苯基-1，2- 二氧环乙烷二钠盐)或APS-5 lg，Tris24g，氯化钠(NaCl) 160g, CTAC 0.0255g，加入纯化水约 900ml，混匀 15 分钟，用高浓盐酸溶液或高浓氢氧化钠溶液调整溶液PH值到9.7±0.05，之后补加纯化水定容至1000ml，混匀待用。
12.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的GP73校准品的制备过程包括如下步骤: 1)校准品缓冲液制备:准确称取Tris碱0.6g, NaCl0.85g,海藻糖3g, Proclin300.0.1g,添加80g纯化水混匀后，用高浓度盐酸或氢氧化钠调整pH = 7.8±0.05，添加BSA6g，混匀后定重至100g，继续混匀30分钟后0.22 μ m过滤。 2)校准品的配制:在上述缓冲液中加入GP73抗原配制而成。
13.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白.73 (GP73)单克隆抗体工作液的制备包括以下步骤:
1)称取3mg2IT，用含有 50mM Tris, 0.1M NaCl 和 0.005M EDTA，pH = 8.5±0.05 水溶液溶解至10mg/ml ;准确量取GP73单克隆抗体0.5mg，通过浓缩或定容的方式使溶液中抗体浓度为3.5mg/ml，溶剂使用上述2IT溶液的溶剂，置于反应试管底部；在含有3.5mg/ml GP73单克隆抗体溶液的试管中加入其体积1/20比例的2IT溶液进行活化。混匀，在室温下反应20分钟，结束后利用分子筛层析方式去除溶液中的过量的2IT，得到活化的抗体； 2)准确量取碱性磷酸酶0.4mg，置于反应试管底部；称取3mg的SMCC用二甲基甲酰胺(DMF)溶解至5mg/ml ;在含有碱性磷酸酶的试管中加入其体积1/20的SMCC溶液，混匀后，室温下反应15分钟，结束后利用分子筛层析去除溶液中的过量的SMCC，得到活化的碱性磷酸酶； 3)将以上步骤中活化的抗体和活化的碱性磷酸酶按质量比1: 0.8混合，加入6μ I的IM MgCl2溶液，混匀后在2?8°C环境下反应24小时。反应结束后，用分子筛层析的方法纯化得到最终抗体-酶连接物； 4)工作液缓冲液制备:准确称取Tris碱0.6g，NaCl0.85g,Proclin300 0.lg，添加80g纯化水15分钟混匀后用高浓度盐酸或氢氧化钠溶液调整pH = 7.2±0.05，继续加入IMMgCl20.35ml, 0.1M ZnCl20.05ml, BSA0.5g，纯水定重至 100g，30 分钟混匀后 0.22 μ m 过滤，即得到工作液缓冲液； 5)将以上步骤中得到的抗体-酶连接物，利用工作液缓冲液稀释至抗体-酶连接物浓度为3.0μ g/ml，即得到碱性磷酸酶标记抗高尔基体蛋白73(GP73)单克隆抗体工作液。
【文档编号】G01N33/68GK104198721SQ201410360560
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年7月28日 优先权日:2014年7月28日
【发明者】霍萌萌, 刘向祎, 鲁辛辛, 路晟 申请人:北京润诺思医疗科技有限公司, 首都医科大学附属北京同仁医院, 刘向祎
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