专利名称：一种叶酸的酶联免疫检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于检测食品、饲料和维生素产品中的叶酸含量的酶联免疫检测试剂盒，属于食品和饲料成分的检测分析技术领域。
背景技术：
叶酸(Folic acid)是一种水溶性B族维生素，又称维生素氏或维生素M，为机体细胞生长和繁殖所必需的物质。在体内叶酸以四氢叶酸的形式起作用，四氢叶酸在体内参与嘌呤核酸和嘧啶核苷酸的合成和转化。在制造核酸上扮演重要的角色。人体在利用糖分和氨基酸时的必要物质。叶酸缺乏时，脱氧胸苷酸，嘌呤核苷酸的形式及氨基酸的互变受阻， 细胞内DNA合成减少，细胞的分裂成熟发生障碍，引起巨幼红细胞性贫血。此外，研究还发现，叶酸对孕妇尤其重要。如在怀孕头3个月内缺乏叶酸，可导致胎儿神经管发育缺陷，从而增加裂脑儿，无脑儿的发生率。叶酸广泛存在于各种动植物食品中，但天然食品所含叶酸大部分含量不高，以多谷氨酸叶酸形式存在，吸收率不高，且叶酸在人体内停留时间不长，人们通常在食品中强化吸收率高的单谷氨酸盐形式叶酸。美国1998年1月1日起已强制在某些谷物食品中强化叶酸，FDA规定每1千克谷物食品强化1.4 mg叶酸。我国已在婴幼儿、孕妇、老年食品中强化叶酸。为了避免维生素缺乏，如今，生产商通过混合或喷雾的方式向食品中加入适量的维生素，然而要使其均勻地分布于食品中并非易事。此外，在产品的标签上必须标注保质期内的维生素含量。考虑到在食品生产储存中部分维生素的流失，德国化工企业协会建议，超量添加的维生素量不应超过标签注明含量的50%。因此，生产商和监督部门都有必要对产品中维生素的含量进行控制。叶酸作为B族维生素其分析方法很多，主要有化学法、微生物法、薄层扫描法、荧光分析法和气相色谱法等。这些方法比较繁杂、费时、重现性差、检出极限低，气相色谱法易对维生素造成破坏。近年来用高效液相色谱法(HPLC)测定B族维生素的报道较多。HPLC 法虽具有快速、准确、重现性好的特点，但所用仪器昂贵笨重，且需要大量的有机溶剂，样品前处理复杂，费时，费力，难以用于现场操作。酶联免疫检测法(ELISA)具有快速，准确，简易，不需要专门人员操作等优点，因此研究开发一种叶酸的酶联免疫检测试剂盒具有直接的经济效益和社会效益。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的上述不足，提供一种叶酸的酶联免疫检测试剂盒。本发明所述叶酸的酶联免疫检测试剂盒中试剂的组成包括
(1)包被有叶酸包被抗原的酶标板；
(2)叶酸的多克隆抗体；
(3)酶标二抗即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的抗体；(4)叶酸标准品溶液；
(5)浓缩磷酸盐缓冲液；
(6)浓缩洗涤液；
(7)底物显色液A；
(8)底物显色液B；
(9)终止液。其中所述的叶酸包被抗原是将叶酸半抗原与卵清蛋白偶联得到的，叶酸包被抗原的浓度为lyg/ml。所述偶联物的载体蛋白为分子量范围是6. 7KDa 6. SKDa的牛血清蛋白或卵清蛋白。所述叶酸的多克隆抗体是由叶酸与载体蛋白的偶联物作为免疫原免疫动物(新西兰大白兔)制备得到；所述叶酸多克隆抗体的工作浓度为1:10000 1:20000，优选 1:20000。所述的酶标二抗是采用过碘酸钠将辣根过氧化物酶与羊抗兔抗体进行偶联得到的；所述酶标二抗的工作浓度优选为1:2000。所述叶酸标准品溶液浓度分别为3ng/ml、6 ng/ml、12. 5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ ml、100 ng/ml0所述浓缩洗涤液为含有体积分数0. 05%吐温-20的pH7. 4,0. lmol/L的磷酸盐缓冲液。所述底物显色液A为TMB溶液，底物显色液B为pH5. 0 6. 0的过氧化脲溶液，使用时显色液A与显色液B等体积混合；终止液为2mol/L的硫酸溶液。本发明提供的试剂盒可用于检测食品、饲料和维生素产品中的叶酸含量。本发明的原理是以免疫学反应为基�。乖�、抗体反应的高度特异性与酶对底物的高效催化作用相结合起来，根据酶作用底物后显色，以颜色变化判断试验结果，可经酶标仪作定量分析。本发明的优点和有益效果
本发明的酶联免疫检测试剂盒具有灵敏度高、简便快速、准确的特点，可在食品、饲料和维生素产品中检测叶酸含量发挥重要作用。
图1为本发明叶酸抗体的抑制率曲线。图2为本发明叶酸的酶联免疫检测试剂盒的标准曲线。
具体实施例方式实施例1、免疫原、包被抗原的合成及抗体的制备 1、免疫原的合成
将叶酸与牛血清蛋白(BSA)采用EDC法进行偶联得到免疫原。具体包括以下步骤 A、分别称取叶酸 22. 7mg (51. 5 μ mol)，水溶性碳二亚胺(EDC) 98. 7mg (514. 7ymol), N-羟基琥珀酰亚胺(NHS) 29. 6mg (257.4ymol)依次溶于5mLDMF中，避光、室温磁力搅拌反应24小时；
B、将IOOmg(1. 5ymol)BSA (分子量范围为6. 7KDa 6. 8 KDa)溶于IOmL磷酸盐缓冲液(PBS) (0. 01M, ρΗ7· 4)中；
C、将“步骤A的产物”缓慢加入到“步骤B的产物”中，室温磁力搅拌反应3小时；反应结束后，将反应液转移到半透膜中，在0 4°C用PBS缓冲液(0. 01M, pH7. 4)透析3天， 期间每4 6小时换一次透析液；随后用蒸馏水透析3天，期间每4 6小时换一次透析液；透析完毕，用冷冻干燥机冻干，得到黄色絮状固体即为免疫原(叶酸与牛血清蛋白的偶联物)，-20°C保存，备用。2、包被抗原的合成
将叶酸与卵清蛋白(OVA)采用混合酸酐法进行偶联得到包被抗原。具体步骤如下 A、称取49mg (111. Ιμπιο )叶酸溶于5mL无水DMF(无水N-N 二甲基甲酰胺)中振荡溶解，加入^μ L(122. 2μ mol)三正丁胺，冰浴反应30分钟，然后逐滴加入20. 2 μ L (155. 5ymol)氯甲酸异丁酯，室温反应1小时。B、称取 IOOmg OVA (卵清蛋白)(2. 22 μ mol)溶于 PBS 中。C、将“步骤A的产物”逐滴加入到“步骤B的产物”中，室温搅拌反应过夜。反应结束后，先后用PBS缓冲液(0. 01M，pH7. 4)和蒸馏水透析6天，期间更换透析液；透析完毕， 用冷冻干燥机冻干，得到黄色絮状固体即为包被抗原(叶酸与卵清蛋白的偶联物)，_20°C保存，备用。3、叶酸多克隆抗体的制备
采用雄性新西兰大白兔作为免疫动物，以叶酸与牛血清蛋白的偶联物为免疫原。首次免疫，将弗氏完全佐剂与免疫原按1 1混合成油包水的乳浊液，每只兔注射0. 5mg免疫原， 进行背部皮下多点注射(5 10点)；20天后第一次加强免疫，用弗氏不完全佐剂与等体积免疫原混合，进行第二次免疫，剂量减半，方法同首免；以后每隔两周加强免疫一次，第五次不加佐剂只用生理盐水进行末次免疫，注射七天后进行心脏采血。血液在4°C静置过夜，次日IOOOOrpm离心15分钟得抗血清，即为叶酸多克隆抗体。
实施例2、ELISA检测方法的建立 1、抗体与包被抗原浓度的优选(方阵法)
纵向用包被抗原按 8.0 μ g/mL,4. 0 μ g/mU2. 0 μ g/mLU. 0 μ g/mL、0. 5 μ g/mL、 0. 25 μ g/mL的系列浓度包被酶标板，100 μ L/孔，37 °C放置2小时，用洗涤液300 μ L/孔洗板三次；再用封闭溶液250 μ L/孔封闭，(T4°C放置过夜，洗板三次；横向加入100 μ L/ 孔一系列稀释的抗体(1:2500至1:80000)，37 °C放置30分钟，洗板三次；加入100 μ L/孔 1:2000的酶标二抗即辣根过氧化酶标记的羊抗兔抗体，37 °C放置30分钟，洗板三次；加入 100 μ L/孔的底物显色液，测定吸光度值。以吸光度值随包被抗原的浓度有明显梯度变化的包被抗原浓度和抗体稀释度为最佳浓度进行特异性测定。2、抗体灵敏度的测定
根据上述对抗体及包被抗原浓度的优选实验，选择并确定抗体浓度为1:20000，包被抗原浓度为1 μ g/mL进行抗体的灵敏度的测定
A、包被用0. 05M pH9. 6的碳酸盐缓冲液将叶酸的包被抗原配成1 μ g/mL的溶液，每个酶标板的反应孔中加100 μ L，37°C放置2小时，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，300 μ L/孔，每次3钟，拍干。(此步简称洗涤，下同)。B、封闭用封闭溶液封闭上述已包被的酶标板，250 4 17孔，0、1放置过夜，然后洗涤。C、加样加稀释叶酸抗体(1 20000 ) 50 μ L/孔与不用浓度的叶酸标准品溶液 50 μ L/孔于上述已封闭的反应孔中，37°C放置30分钟，然后洗涤。D、加酶标二抗于各反应孔中，加入新鲜稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体(1:2000) 100 μ L/孔，30 分钟，洗涤。Ε、显色于各反应孔中加入临时配置的显色液100 μ L/孔(显色液Α50 μ L+显色液 B50yL)，37°C放置 15 分钟。F、终止于各反应孔中加入终止液100 μ L/孔，立即用酶标仪检测。G、计算过程检测结果以抑制率计算，％抑制率=%Β/ Β0，Β是加入药物作为竞争者的吸光值，BO是不加竞争者的吸光值。计算50%抑制率时药物的浓度即为该抗体的灵敏度。
实施例3、检测叶酸的酶联免疫检测试剂盒的组装 1、检测叶酸的酶联免疫检测试剂盒的组成
A、包被有包被抗原(叶酸与卵清蛋白的偶联物)的固相载体(酶标板)；
B、叶酸抗体工作液(体积比浓度为1:20000)；
C、叶酸标准溶液6瓶，浓度分别为:3ng/ml、6ng/ml、12.5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、 100 ng/ml ；
D、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体工作液(工作浓度为1:2000)；
E、浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaCl 80g、KH2PO4 2. 0g、Na2HPO4 · 12 29. 0g、KCl 2. Og的水溶液。F、浓缩洗涤液是上述浓缩磷酸盐缓冲液加入体积比浓度为0. 05%的吐温 20(Tween20)；
G、底物显色液显色液A为TMB溶液；显色液B为pH5.0 6. 0的过氧化脲溶液；
H、终止液浓度为2mol/L的硫酸溶液。2、酶标板的制备
用碳酸盐缓冲液(0. 05M, pH9. 6)将包被抗原稀释成1 μ g/mL,酶标板的每孔加入100 UL, 37 °C孵育2 h，倾去包被液，每孔加入300 μ L洗涤液洗涤3次，拍干；然后每孔加入封闭液250 uL, 4 °C过夜，倾去孔内液体，洗涤液洗涤3次，拍干，用锡箔纸真空密封4°C保存。
实施例4、检测叶酸的酶联免疫检测试剂盒的应用
I、试剂的配制
A、样品稀释液将试剂盒中提供的浓缩磷酸盐缓冲液用蒸馏水稀释10倍后使用。B、洗涤溶液将试剂盒中提供的浓缩洗涤液用蒸馏水稀释10倍后使用。C、底物显色液显色液A与显色液B等体积混合后使用。2、样品前处理A、牛奶将牛奶样品在4°C，10000转/分钟离心15分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用磷酸盐缓冲液稀释成1 10，得到待测样品。B、奶粉称取IOg奶粉加入90ml蒸馏水溶解，然后在4°C，10000转/分钟离心15 分钟，脱除脂肪层；将脱脂的牛奶用磷酸盐缓冲液稀释成1:10，得到待测样品。C、维生素功能饮料将样品在4°C，10000转/分钟离心15分钟，取上清，用磷酸盐缓冲液稀释成1 100，得到待测样品。D、维生素片或胶囊称取Ig样品用IOOml蒸馏水溶解，然后在4°C，10000转/分钟离心15分钟，取上清，用磷酸盐缓冲液稀释成1:10，得到待测样品。3、检测步骤
A、加样向酶标板微孔中加入叶酸系列浓度标准溶液或样品溶液50μ L，然后加入叶酸抗体溶液50 μ L，室温(25°C )恒温孵育1 h ；
B、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液300μ L，洗涤3次，拍干；
C、加酶标羊抗兔抗体溶液每孔加入酶标羊抗兔抗体溶液100μ L，室温恒温孵育1
h；
D、洗涤倾出孔中液体，每孔加入洗涤溶液300μ L，洗涤3次，拍干； Ε、加显色液每孔加入显色液100 μ L，室温(25°C)恒温孵育15分钟； F、终止每孔加入终止液100 μ L ；
F、检测用酶标仪测定450nm处的吸光度值。4、结果判断
标准曲线的绘制横坐标为叶酸浓度的对数值，纵坐标为各标准品和样品的吸光值与标准液为Ong/ml的吸光值的比值，即抑制率，每一个样品的浓度可以从标准曲线上读出。%抑制率=%标准品吸光值(或样品)/O标准品吸光值。
实施例5、试剂盒精密度和准确度试验
取20，50，100 ppb的叶酸标样，添加到牛奶样品中，来检测叶酸的回收率。每个浓度的批间变异系数都以不同的5天的5个重复数据进行计算，批内变异系数以同一天的5次
重复数据计算。根据制定的标准曲线的线性方程进行回收率的定量计算。结果见下表。
添加浓
度检测次检测结回收率变异系检测次检测结回收率变异系数η果(！(%)数(％)数η果(ppti)m数⑶20521.183105.911,1522.055110.39.050550.188100,410.9550.562101.19.3100589.1098Ρ.17,7594.04094.011.8
从上述测定结果看，变异系数低于11. 8%，回收率在89. 1 110. 3%之间。表明本试剂盒有很好的重复性和准确度。
权利要求
1.一种叶酸的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于该试剂盒中试剂的组成包括(1)包被有叶酸包被抗原的酶标板；(2)叶酸的多克隆抗体；(3)酶标二抗即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔的抗体；(4)叶酸标准品溶液；(5)浓缩磷酸盐缓冲液；(6)浓缩洗涤液；(7)底物显色液A；(8)底物显色液B；(9)终止液。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的叶酸包被抗原是将叶酸半抗原与卵清蛋白偶联得到的；所述的叶酸包被抗原的浓度为1 μ g/ml。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述叶酸的多克隆抗体是由叶酸与分子量范围是6. 7KDa — 6. SKDa的牛血清蛋白偶联制成的偶联物作为免疫原免疫新西兰大白兔制备得到；其中所述叶酸多克隆抗体的工作浓度为1:10000 1:20000。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的酶标二抗是采用过碘酸钠将辣根过氧化物酶与羊抗兔抗体进行偶联得到的；所述酶标二抗的工作浓度为1:2000。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的叶酸标准品溶液的浓度依次为 3ng/ml、6 ng/mK12. 5 ng/ml、25 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩磷酸盐缓冲液是每升含NaCl 80g、KH2PO4 2. 0g、Na2HPO4 ‘ UH2O2 29. 0g, KCl 2. Og 的水溶液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述浓缩洗涤液是含有体积分数0.05% 吐温-20的pH7. 4,0. lmol/L的磷酸盐缓冲液。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的底物显色液A为TMB溶液；所述的底物显色液B为pH5. 0 6. 0的过氧化脲溶液，使用时显色液A与显色液B等体积混合后使用；所述的终止液为2mol/L的硫酸溶液。
9.权利要求1所述的酶联免疫试剂盒在检测食品、饲料和维生素产品中叶酸含量的应用。
全文摘要
一种叶酸的酶联免疫检测试剂盒，属于酶联免疫吸附分析技术领域。所述试剂盒中试剂的组成包括包被有叶酸包被抗原(由叶酸与卵清蛋白偶联制成)的酶标板；叶酸多克隆抗体；酶标二抗即辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体；叶酸标准品溶液；浓缩磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液；底物显色液A；底物显色液B；终止液。本发明的酶联免疫检测试剂盒利用多克隆抗体进行酶联免疫检测，IC50=15.5ng/ml。在牛奶样品中最低检测限为11.9ng/ml，批间批内变异系数<11.8%，回收率为89.1～110.3%。本发明的酶联免疫检测试剂盒具有简单、快捷、准确、灵敏度高的特点，可用于快速定量检测食品、饲料和维生素产品中所含的叶酸。
文档编号G01N33/82GK102175878SQ20111000410
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月11日 优先权日2011年1月11日
发明者孟萌, 张元阳, 张太昌, 徐静, 薛虎寅, 郗日沫 申请人:南开大学
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