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专利名称：一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法
技术领域：
本发明属于微流控芯片的电泳分析技术领域，具体地涉及一种利用微流控芯片电泳-激光诱导荧光联用技术分离检测益生菌的种类。
背景技术：
益生菌是指对人体和动物有益的细菌，能够通过改善宿主肠道菌群生态平衡而发挥有益作用，以提高宿主健康水平。益生菌制品已经在人们的日常生活中扮演着重要角色。 因此，检测益生菌制品中益生菌的种类以确保其制品的质量尤为重要。细菌的检测技术有血清法、流式细胞术、蛋白质分析、组成分析、特征分析等，以上分析技术因分析时间长而无形中增加了工作量。另外，由于细菌具有组成复杂、相似性高的特点降低了分析结果的可靠性。本发明克服了现有技术中细菌检测技术的分析时间长、工作量大、分析结果可靠性有限等缺陷，提出了一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，利用微流控芯片电泳-激光诱导荧光联用技术分离检测益生菌的种类。本发明检测方法具有操作步骤简单易行，分析时间短，样品用量少，灵敏度高，分析结果准确等优点，适用于进行益生菌制品中的益生菌检测。

发明内容
本发明提出了一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，包括以下步骤 第一步制备运行缓冲液
将Tris、硼酸、EDTA溶于去离子水中得到TBE储备液，加入聚环氧乙烷得到TBE-PEO储备液，经所述TBE储备液稀释并调节pH后得到运行缓冲液，于4°C温度下储存备用； 第二步制备细菌悬浮液
将益生菌悬浮于第一步制备得到的所述运行缓冲液中，经离心去除上清液，再悬浮于所述运行缓冲液中得到细菌悬浮液； 第三步衍生步骤
将第二步制备得到的所述细菌悬浮液与荧光染料混合，于黑暗处衍生，经离心去除上清液；
第四步微流控芯片及其微通道的预处理
依次采用氢氧化钠溶液、去离子水、运行缓冲液对微流控芯片进行冲洗； 第五步电泳检测步骤
采用经第四步处理的微流控芯片经过电泳进样、分离、激光诱导荧光检测，对经第三步处理的细菌悬浮液中益生菌的种类进行检测。其中，所述第一步中的TBE储备液中，Tris浓度为4. Ommol/L，硼酸浓度为 4. Ommol/L、EDTA浓度为0. 09mmol/L ；所述TBE-PEO储备液中聚环氧乙烷的质量分数为 0. 5%ο
其中，所述第一步中，调节pH为8. 5。其中，所述第三步中的荧光染料为SYTO 62。其中，所述第四步中的氢氧化钠溶液的浓度为lmol/L。其中，所述第五步中，电泳进样时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽650V， 第三液槽0V，第四液槽1000V，持续15s ；电泳分离时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽2150V，第三液槽1300V，第四液槽0V，持续200s。针对现有技术存在的问题，本发明的目的是推出一种基于微流控芯片电泳-激光诱导荧光联用分离检测益生菌种类的方法。该方法具有快速准确可靠等优点。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案 第一步制备运行缓冲液
将一定量的！"ris、硼酸、EDTA溶于去离子水中，得到浓度分别为Tris4. 0 mmol/L，硼酸 4.0 mmol/L和EDTAO. 09 mmol/L的TBE储备液。称取0. 2 g聚环氧乙烷(PEO)溶于40 ml TBE中得到含PEO 0.5%的TBE-PEO储备液。将TBE-PEO储备液用TBE储备液稀释并调其 PH值后得到运行缓冲液，保存于4°C冰箱中。正式实验前用0. 2 μ m滤纸对运行缓冲液进行过滤ο第二步制备细菌悬浮液
分别取培养22 h的双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和粪肠球菌，3400rpm离心3 min，去掉培养基后悬浮于运行缓冲液中，再经3400 rpm离心3 min去掉上清液，最后悬浮于运行缓冲液中配成浓度为1.0X107 CUF的细菌悬浮液。使用前用漩涡仪漩涡数秒，使悬浮液中细菌重悬。第三步衍生步骤
选用激发波长为635的荧光染料，此染料可以透过细胞膜标记核酸(DNA和RNA)。细菌悬浮液的浓度为1. OX IO7 CUF，取1. 5 mL该悬浮液与3. 0 μ 5 mmol/L的荧光染料混合后于黑暗条件下衍生30 min后，经；3400 rpm离心3 min,去掉上清液。第四步微流控芯片及其微通道的预处理
取一块新的十字型芯片用浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液冲洗20 min，去离子水冲洗10 min，再用TBE缓冲液冲洗10 min。每次实验前，先用lmol/L的氢氧化钠溶液清洗2 min，再用去离子水冲洗1 min，最后用运行缓冲液冲洗2 min。每次实验结束后，用无水乙醇冲洗3 min。第五步电泳检测步骤
采用经第四步处理的微流控芯片经过电泳进样、分离、激光诱导荧光检测，对经第三步处理的细菌悬浮液中益生菌的种类进行检测。其中，电泳进样时的电压设置为第一液槽 1300V,第二液槽650V，第三液槽0V，第四液槽1000V，持续15s ；电泳分离时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽2150V，第三液槽1300V，第四液槽0V，持续200s。本发明技术方案的进一步特征在于，运行缓冲液的pH=8. 5，所用聚环氧乙烷PEO 的浓度为0. 025 %。本发明技术方案的进一步特征在于，漩涡时间为60-90秒。本发明技术方案的进一步特征在于，荧光试剂为SYTO 62。本发明采用SYTO 62染料对双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和粪肠球菌进行衍生，在TBE-PEO制备的运行缓冲液中进行分离检测。该方法具有以下优点操作步骤简单易行，分析时间短，样品用量少，灵敏度高，分析结果准确。本发明方法可以用于对实际产品 (如酸奶、糖果、药物等)中益生菌的分析检测。


图1所示为微流控芯片结构示意图。1是样品池，2是缓冲液池，3是样品废液池、 4是缓冲液废液池、5是样品通道、6是进样通道、7是微通道、8是微通道。图2所示为利用本发明方法对四种益生菌进行检测的检测结果示意图。
具体实施例方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。本发明基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，包括以下步骤 第一步制备运行缓冲液
将一定量的！"ris、硼酸、EDTA溶于去离子水中，得到浓度分别为Tris4. 0 mmol/L，硼酸 4.0 mmol/L和EDTAO. 09 mmol/L的TBE储备液。称取0. 2 g聚环氧乙烷(PEO)溶于40 ml TBE中得到含PEO 0.5%的TBE-PEO储备液。将TBE-PEO储备液用TBE储备液稀释并调其 PH值后得到运行缓冲液，保存于4°C冰箱中。正式实验前用0. 2 μ m滤纸对运行缓冲液进行过滤ο第二步制备细菌悬浮液
分别取培养22 h的双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌和粪肠球菌，3400rpm离心3 min，去掉培养基后悬浮于运行缓冲液中，再经3400 rpm离心3 min去掉上清液，最后悬浮于运行缓冲液中配成浓度为1.0X107 CUF的细菌悬浮液。使用前用漩涡仪漩涡数秒，使悬浮液中细菌重悬。第三步衍生步骤
选用激发波长为635的荧光染料，此染料可以透过细胞膜标记核酸(DNA和RNA)。细菌悬浮液的浓度为1. OX IO7 CUF，取1. 5 mL该悬浮液与3. 0 μ 5 mmol/L的荧光染料混合后于黑暗条件下衍生30 min后，经；3400 rpm离心3 min,去掉上清液。第四步微流控芯片及其微通道的预处理
取一块新的十字型芯片用浓度为1 mol/L的氢氧化钠溶液冲洗20 min，去离子水冲洗10 min，再用TBE缓冲液冲洗10 min。每次实验前，先用lmol/L的氢氧化钠溶液清洗2 min，再用去离子水冲洗1 min，最后用运行缓冲液冲洗2 min。每次实验结束后，用无水乙醇冲洗3 min。第五步电泳检测步骤
采用经第四步处理的微流控芯片经过电泳进样、分离、激光诱导荧光检测，对经第三步处理的细菌悬浮液中益生菌的种类进行检测。其中，电泳进样时的电压设置为第一液槽 1300V,第二液槽650V，第三液槽0V，第四液槽1000V，持续15s ；电泳分离时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽2150V，第三液槽1300V，第四液槽0V，持续200s。实施例本实施例完全按照上述方法的具体操作步骤进行操作，相同步骤不再赘述。第一步中，调节运行缓冲液的pH=8. 5，PEO的浓度为0. 025 % ；第二步中，漩涡时间为60-90秒；第三步中，荧光染料为SYTO 62。本实施例第五步对四种益生菌电泳分析的检测步骤如下
本发明适用于益生菌的细菌种类检测分析。本实施例中，选取双歧杆菌 (Bifidobacterium)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei )和粪肠球菌(Enterococccus faecalis)混合液的浓度为 1. 0X IO7 CUF。首先，在微流控芯片的四个液槽中分别加入运行缓冲液，待基线平稳后将第一液槽样品池1中的缓冲液换成样品，采用压缩进样将电压设置为进样电压，如图1所示，样品由液槽1经样品通道5、进样通道6进入第三液槽样品废液池3，15秒后转换成分离电压， 样品在微通道7被分离后，在微通道8处被检测，分离后的样品进入第四液槽缓冲液废液池 4。具体电泳分离条件见下表
权利要求
1.一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤第一步制备运行缓冲液将Tris、硼酸、EDTA溶于去离子水中得到TBE储备液，加入聚环氧乙烷得到TBE-PEO储备液，经所述TBE储备液稀释并调节pH后得到运行缓冲液，于4°C温度下储存备用；第二步制备细菌悬浮液将益生菌悬浮于第一步制备得到的所述运行缓冲液中，经离心去除上清液，再悬浮于所述运行缓冲液中得到细菌悬浮液；第三步衍生步骤将第二步制备得到的所述细菌悬浮液与荧光染料混合，于黑暗处衍生，经离心去除上清液；第四步微流控芯片及其微通道的预处理依次采用氢氧化钠溶液、去离子水、运行缓冲液对微流控芯片进行冲洗；第五步电泳检测步骤采用经第四步处理的微流控芯片经过电泳进样、分离、激光诱导荧光检测，对经第三步处理的细菌悬浮液中益生菌的种类进行检测。
2.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，其特征在于，所述第一步中的TBE储备液中，Tris浓度为4. Ommol/L,硼酸浓度为4. Ommol/L、EDTA浓度为 0. 09mmol/L ；所述TBE-PEO储备液中聚环氧乙烷的质量分数为0. 5%。
3.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，其特征在于，所述第一步中，调节PH为8. 5。
4.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，其特征在于，所述第三步中的荧光染料为SYTO 62。
5.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，其特征在于，所述第四步中的氢氧化钠溶液的浓度为lmol/L。
6.根据权利要求1所述的基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，其特征在于，所述第五步中，电泳进样时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽650V，第三液槽0V，第四液槽1000V，持续15s ；电泳分离时的电压设置为第一液槽1300V，第二液槽2150V，第三液槽 1300V，第四液槽0V，持续200s。
全文摘要
本发明公开了一种基于微流控芯片的益生菌电泳检测方法，先制备TBE-PEO运行缓冲液，然后利用其制备细菌悬浮液，经过衍生步骤，利用经预处理的微流控芯片进行电泳联用激光诱导荧光检测。本发明检测方法具有操作步骤简单易行，分析时间短，样品用量少，灵敏度高，分析结果准确等优点，适用于进行益生菌制品中的益生菌检测。
文档编号G01N21/64GK102435660SQ20111038435
公开日2012年5月2日 申请日期2011年11月28日 优先权日2011年11月28日
发明者何品刚, 张俊庆, 成双, 方禹之, 汪志芳, 王欢, 王清江, 王霞, 葛淑丽 申请人:华东师范大学